Diese Arbeit wurde von der American Heart Association Scientist Development Grant 0635480N und National Institutes of Health Research Grant AI081220 finanziert. BIC wird von einem Tempelritter Eye Foundation Forschungsstipendium unterstützt.

Überblick Protokolle sind vorgesehen, um zunächst den Dosierung des Mutagen was zu einer 70% igen Abtötung der Parasiten (Protokoll 1). Im nächsten Verfahren wird bereitgestellt, um die induzierten Mutanten Austritt aus einer mutagenisierten Parasit Pool (Protokoll 2, Abbildung 2) zu bereichern. Dies wird durch ein Protokoll, um die Inzidenz von Austritts-Mutanten, die in dem angereicherten Pool zu testen, oder um den Austritt Phänotyp in den einzelnen Mutanten (Protokoll 3) validieren gefolgt. Schließlich wird ein Protokoll vorgesehen, um einzelne Klone aus Parasiten angereichert Populationen zu erzeugen durch limitierende Verdünnung (Protokoll 4). 1. Titration von Mutagen Seien Sie besonders vorsichtig, wie zB doppelte Handschuhe, beim Umgang mit hoch mutagene Verbindungen und Flüssigkeiten. Sammeln flüssiger Abfälle getrennt für die ordnungsgemäße Entsorgung. <ol><li> Inokulieren T25 Zellkulturflaschen konfluent mit humaner Vorhaut-Fibroblasten (HFF) Zellen mit 1 ml frisch lysiert Tachyzoiten und wachsen 18-25 h bei 37 °; C unter 5% CO 2 in Ed1 Medium (D-MEM mit 1% Hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum, 0,2 mM L-Glutamin, 50 U / ml Penicillin, 50 ug / ml Streptomycin und 0,25 mg / ml Amphotericin B ergänzt ). Siehe Roos et al. für das allgemeine Wachstum und Medien der HFF-Zellen und Parasiten 21. </li><li> Ersetzen-Medium mit 10 ml 0,1% fötalem Rinderserum Medium (verdünnte Ed1 1:10 in D-MEM) und verlassen in angefeuchteter 37 ° C Inkubator unter 5% CO 2 (genannt &quot;37 ° C Inkubator&quot; Von hier an) für 10 min . </li><li> Fügen Sie 0, 12,5, 25, 50 oder 100 ul ENU (1 M Stammlösung in DMSO) oder EMS (1 M Stammlösung in DMSO) pro Flasche (Mutagen Arbeitsverdünnungen wird sein 1,25, 2,5, 5 und 10 mM). In DMSO zu 100 ul für jede Flasche. Inkubieren für 4 Stunden bei 37 ° C-Inkubator. </li><li> Waschen dreimal für 10 Sekunden bei Raumtemperatur durch Spülen der Monoschicht mit 10 ml kaltem PBS (bei 4 ° C vorgekühlt). </li><li> 5 ml PBS, kratzen die lose Monolayer mit einer Gummi-Polizist (SCR-Zelleaper), passieren die Zellen durch eine geschabt 26,5 g Nadel physisch zu entfernen, den Parasiten aus den Fibroblasten (Clip von der Welle außerhalb der Nadel mit schweren Schere Setzen Sie die Nadel) und Filter mit 3,0 um Polycarbonat-Filter. Mehrere Nadelpassagen wird die Effizienz der Freigabe Parasiten aus der Wirtszelle. </li><li> Zählen Sie die Parasit-Konzentration unter Verwendung eines Hämocytometers. Lassen Sie sich die Parasiten für 5 min in der hemocytomer regeln, bevor das Zählen. </li><li> Verdünnen Parasiten zu 10.000 Parasiten pro 3 ml in Ed1 (10 ml für 33.333 Parasiten benötigt werden). </li><li> Beimpfen einer Mulde in einer 6-Well-Platte mit 3 ml der verdünnten Parasiten (mit 10.000 Parasiten). Serienmäßig verdünnen die Parasiten 10-fach über 3 Brunnen in einer 6-Well-Platte mit konfluenten HFF-Zellen mit 2,7 ml Ed1 durch die Übertragung von 300 ul aus dem ersten gut. Lassen Platten ungestört in der 37 ° C Inkubator für 7 Tage. </li><li> Saugen Sie Medium, beheben 15 min mit 3 ml / Well 100% Ethanol, Fleckmit 3 ml / well Kristallviolett-Lösung (12,5 g Kristallviolett in 125 ml Ethanol mit 500 ml 1% Ammoniumoxalat gemischt) für 15 min, mit 3 ml spülen / Vertiefung PBS (1 Minute) und an der Luft trocknen. Alle bei Raumtemperatur. </li><li> Count-Plaques und wählen Konzentration von Mutagen benötigt, um das Überleben von 30% der Parasiten ausgesetzt (70% Töten Dosierung: siehe Abbildung 1) zu erreichen. Eine Dosierung von 70% Abtötung wurde historisch verwendet 14 und induziert weniger als 100 Punktmutationen pro Genom (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manuskript eingereicht). </li></ol> 2. Anreicherung von Austritts-Mutanten (2) <ol><li> Führen Mutagenese, wie oben mit einem Mutagen Dosierung induziert 70% Tötung beschrieben. Aufwachsen, die mutagenisierten Population für eine Passage in einem neuen Kolben von Wirtszellen. </li><li> Infect eine T25, HFF konfluenten Zellkulturflasche mit 120.000 frisch lysiert Parasiten aus einer mutagenisierten Population in 10 ml Ed1. Inkubieren Sie für 2 Stunden in einem 35 ° C Inkubator unter 5% CO2 und befeuchtet (von hier an als &quot;35 ° C Inkubator&quot;). </li><li> Absaugen und spülen Medium 10 Sekunden mit 10 ml kaltem PBS und dann 10 ml Ed1 Medium mit 25 mg / ml Dextransulfat (DS) 13 ergänzt. Inkubieren Sie für 26 Stunden in einem 40 ° C Inkubator unter 5% CO 2 und befeuchtet (von hier an als &quot;40 ° C Inkubator&quot;). </li><li> Bereiten funktionierende Lösung des Ausgangs-Enhancer. Verdünnen Sie die Ausgangs-Induktor der Wahl am Arbeitsplatz-Konzentration in einem 15 ml Falcon-Röhrchen mit 10 ml HBSSc mit 25 mg / ml DS ergänzt. Pre-warm die Verdünnungen für 30 min in einem 37 ° C im Wasserbad. Siehe Tabelle 1 für die Arbeit Konzentrationen. </li><li> Saugen Sie das Medium aus den Parasiten infizierte Flaschen und fügen vorgewärmten Egress Induktor Lösung. Inkubieren in der 37 ° C-Inkubator für die Zeiten in Tabelle 1 angegeben. </li><li> Absaugen und spülen Medium 10 Sekunden mit 10 ml kaltem PBS und dann 10 ml Ed1 mit 25 mg / ml DS und 50 uM Pyrrolidindithiocarbamat ergänzt (PDTC: add 5 ul 100 mM PDTC Lager in PBS) 13. Inkubieren 5 Stunden in einem 35 ° C Inkubator. </li><li> Absaugen und spülen Medium 10 Sekunden einmal mit 10 ml PBS (Raumtemperatur) und fügen Sie dann 10 ml Ed1 Medium. Setzen Flaschen zurück in die 35 ° C Inkubator bis Parasiten zerstören die Monoschicht: Schüttelkolben täglich. Diese Erholung dauert ca. 7 Tage. </li></ol> 3. Validierung der Mutante durch Austritts-Assays Nach der Durchführung der Bereicherung Bildschirm und das Erwachsenwerden der angereicherten Population für eine Passage in HFF-Zellen müssen die Phänotypen von einem Austritt Assay 11,13 bestätigt werden. Dieser Test sollte auch verwendet, um einzelne Klone nach dem Protokoll Nr. 4 zu bestätigen. <ol><li> Inokulieren 20.000 Parasiten pro Vertiefung in eine 24-Well-Platte mit konfluenten HFF-Zellen auf Deckgläsern (1 ml Medium pro Vertiefung Ed1) gezüchtet. Inkubieren 8 Stunden in einem 35 ° C Inkubator übertragen Sie dann in eine 40 ° C Inkubator für 24 Stunden. </li><li> Waschen mit 1 ml / Vertiefung PBS (10 Sekunden bei Raumtemperatur). 1 ml Ausgangs-Induktoren (DMSO eine einzige negative Kontrolle), vorgewärmt und verdünnt in HBSSc und inkubieren Sie für die Zeiten, in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Saugen Sie mittel-und fixieren mit 1 ml / Well 100% Methanol für 15 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Wenn Eltern Parasiten Expression eines autofluoreszierendes Protein für die Mutagenese verwendet wurden, fahren Sie mit Schritt 13 fort # 3.5. Wenn nicht-fluoreszierendes Protein exprimierende Parasiten als Elternteil Linie verwendet wurden, färben die feste Deckgläser mit Diff-Quick für 1 min bei Raumtemperatur 11 beflecken. </li><li> Waschen 5 min mit 1 ml / Vertiefung PBS in der 24-Well-Platte bei Raumtemperatur. </li><li> Für fluoreszierende Protein exprimierende Parasiten: schnell spülen Sie das Deckglas in ddH 2 O (Eintauchen) und montieren Sie auf Objektträger unter gelmount um das Fluoreszenzsignal zu schützen. Für Diff-Quick gefärbten Parasiten, waschen 10 Sekunden in 100% Ethanol und lassen Luft trocknen, bevor die Montage auf Folie. </li><li> Unter Verwendung eines (Fluoreszenz) mit einem Mikroskop40-60x objektive zählen der Anteil der Vakuolen egressed gegen den Vakuolen, die intrazelluläre blieb (siehe Abbildung 4). </li></ol> 4. Klonen Austritts-Mutanten durch limitierende Verdünnung Nach der Validierung der Phänotyp des angereicherten Egress Mutantenpopulation Verwendung des Protokolls Nr. 3, muss der polyklonalen Population zu geklont, um einzelne Parasiten Klone zu erhalten. <ol><li> Anzahl Parasitenpopulation in einem Hämozytometer und verdünnt auf eine Konzentration von 500 Parasiten pro ml in Ed1 Medium. </li><li> In einem 384-Well-Platte mit einem konfluenten Monolayer von HFF-Zellen, ersetzen Sie das Medium mit 40 ul / Vertiefung Ed1 Medium unter Verwendung einer Mehrkanal-Pipette. Wie in 5 gezeigt, können vier polyklonale Populationen pro Platte wie folgt kloniert werden: Pipette 40 ul / Vertiefung der verdünnten Mutante 1 in Vertiefungen C3-C12, Mutante 2 in Vertiefungen C13-C22, Mutante 3 in Vertiefungen H3-H12 und mutante 4 in Brunnen H13-H22 (Endvolumen in Brunnen ist jetzt 80 ul). Mit einer Multi-Kanal-Pipette, pipet das Solution auf und ab 5 mal, dann Transfer 40 ul auf die Zeile unter der Startreihe (aus Zeile C nach D oder Zeile H bis I). Fahren Sie diese 2-fach serielle Verdünnungen durch Reihe G (Mutanten 1 und 2) oder Zeile N (Mutanten 3 und 4). Entsorgen Sie die zusätzlichen 40 pl aus der letzten Reihe. Inkubieren in einem 35 ° C Inkubator für 7-10 Tage, ohne die Platte. </li><li> Überprüfen Sie die Brunnen auf einem inversen Mikroskop mit einem 10-20x-Objektiv für das Vorhandensein von einzelnen Plaques sichtbar als &quot;Löcher&quot; in der Monoschicht. </li><li> Pick 4 Vertiefungen pro Mutante mit einem einzelnen Plaque und übertragen die Parasiten in eine Zellkulturflasche mit konfluenten HFF-Zellen und gefüllt mit Ed1 Medium. Wachsen die Parasiten in einem 35 ° C Inkubator, schütteln die Flaschen täglich um die extrazellulären Parasiten zerstreuen. Dies dauert in der Regel 7 Tage. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Die Mutagene ENU und EMS sind nicht stabil, wenn sie über lange Zeiträume gelagert. Daher Testen des mutagenen Machtdie Bestände ist entscheidend, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Typische Titrationsergebnisse und Tötung Kurven sowohl für ENU und EMS sind in Abbildung 1 dargestellt. Es wird jedoch empfohlen, Plaque-Assays für jede Mutagenese-Experiment zu vergewissern, dass die geeignete Dosis verwendet wurde durchführen. Um die Vielfalt in der mutagenisierten Parasit Bevölkerung zu erhalten, ist es wichtig, mit dem Austritts-Mutante Bildschirm so schnell wie möglich vorzugehen. Typischerweise wird eine Passage der Parasiten in einen neuen Kolben durchgeführt, damit die überlebenden Parasiten, bevor er nach vorne mit dem Bildschirm wiederherzustellen. Es sollte bedacht werden, dass dies gelingt, werden in der Division der Mutanten führen. Daher kann nicht ausgeschlossen werden, dass mehrere klonale Mutanten nach Abschluss des gesamten Verfahrens isoliert genau das gleiche Erbgut enthalten sein. Um zu vermeiden, Isolieren der gleichen Mutante mehrfach empfohlen, nur eine einzige Austritts-Mutante pro Mutagenese zu isolieren ist, sofern sich die Phänotypen (zB differentielle Austritts-Induktor Empfindlichkeiten) sindsehr verschieden voneinander. Auf der anderen Seite, nicht alle Bildschirm führt zur Isolierung von Mutanten mit dem gewünschten Phänotyp. Vor allem die Ca 2 +-Ionophor A23187 resistenten Phänotyp ist selten und erfordert mehrere Bildschirme und Mutagenese-Experimente, um eine einzelne Austritt mutierten zu isolieren. Deshalb ist es empfehlenswert, um 10.05 Mutagenese und Bildschirm Experimenten parallel durchführen. Die Anreicherung Leistung des Bildschirms wurde durch Mischen einer bekannten Austritts-Mutante mit Wildtyp-Parasiten in unterschiedlichen Verhältnissen getestet. Diese Mischungen wurden auf dem Bildschirm unterworfen, und die Häufigkeit des mutanten Phänotyps in der angereicherten Population wurde bewertet. Durch die Verwendung von Wildtyp-Parasiten auszudrücken zytoplasmatische RFP und eine mutierte Linie, die zytoplasmatische YFP die Inzidenzen konnte schnell mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 3) 13 eingerichtet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass Mutantenphänotypen routinemäßig zu 80% Reinheit werden durch die mit 1 beginnt Egress mutierten Parasiten pro 10.000 Wildtyp-p angereichertarasites 13. Wenn jedoch die Austritts-Mutante: Wildtyp-Parasiten Start Verhältnis 1:100.000 Parasiten, ist die isolierte Population nur 1-2% (1:100) Austritts-Mutanten. Deshalb ist die Bereicherung Macht des Bildschirms befindet sich das 1000-fache. Da der Bildschirm beginnt mit Impfung von 120.000 Parasiten, von denen typischerweise 70% lebensfähig sind wir in der Regel führen zwei Runden der Anreicherung. Die isolierten Parasiten werden zwischen den Runden Bereicherung gewachsen. Dieses Verfahren führt zu einer 100%-Mutante Bevölkerung auch beim Anfahren mit 1:1.000.000 Egress Mutante: Wildtyp-Parasiten. Der Austritt Assay zu validieren und zu charakterisieren, die Phänotypen erfordert eine Vielzahl von Wirtszelle Infektion, die Differenzierung der einzelnen Vakuolen erlaubt. Dies ist besonders kritisch bei der Analyse der Bedingungen mit einem hohen Anteil von Austritts wie die einzelnen Parasiten finden sich überall. Wie in 4 gezeigt, wenn egressed Populationen nicht gut getrennt sind, ist es einfach, den Anteil zu unterschätzendes Ausgangs durch Zählen zwei egressed Vakuolen als eine Vakuole. Seit Egress und Invasion verbundenen Prozesse sind, und einige temperaturempfindliche Phänotypen zeigen einen milden Phänotyp bei der niedrigeren Temperatur, werden nicht alle Mutanten haben ähnliche Invasion Wirkungsgrade. Solche Mutanten ist daher an das Mehrfache Dosen inokuliert werden, um eine ausreichend hohe Dichte Vakuole für eine genaue Bewertung der Austritts-Phänotyp zu erhalten. Darüber hinaus haben einige Austritts-Induktoren nicht effizient stimulieren Austritt von Vakuolen, die vier oder weniger Parasiten. Als solches ist es wichtig, dass Vakuolen acht Parasiten oder mehr enthalten beim Starten des Austritts-Assay. In unserem Labor haben wir Mutanten-Bildschirm mit einer bestimmten Ausgangs-Enhancer gegen andere Ausgangs-Enhancer isoliert. Durch die Profilierung ihrer Kreuzreaktivität können die Mutanten in verschiedene Klassen eingeteilt werden. Schließlich werden nicht alle Egress Mutanten sein temperaturempfindlich. Insbesondere Mutanten mit Induktoren Egress Auslösung Schritte vor der Veröffentlichung von intracellula isoliertr Ca 2 + sind anfällig für nicht-temperaturempfindliche Phänotypen. Dies liegt an den Bahnen, die parallel zu führen austreten, bevor das Signal konvergiert auf die Freisetzung von intrazellulären Ca 2 + kann. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig1.jpg" /> Abbildung 1. Chemischen Mutagen Dosistitration. A. Plaque-Assays in einer 6-Well-Platte unter Verwendung verschiedener Konzentrationen und EMS verschiedene Anzahlen von Parasiten pro sowie angegeben durchgeführt. Die weißen Flecken sind Parasiten Plaques in der HFF Monoschicht gebildet. B, C. Die Überlebenskurven von Parasiten bei Bestrahlung mit verschiedenen Dosierungen von EMS (B) und ENU (C). Das Überleben wurde durch Plaque-Assays beurteilt. Eine Dosierung induziert 70% Töten ist für Mutagenese-Experimente ausgewählt. Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten + / - Standardabweichung dargestellt. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig2.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 2. Schematische Darstellung der Austritts-Mutante Anreicherung Bildschirm. Die Temperatur wird auf der Y-Achse dargestellt, während zeitlichen Verlauf durch das x-Achse dargestellt ist. Grüne Parasiten widerspiegeln Egress mutierten Parasiten, rot Parasiten widerspiegeln Wildtyp-Parasiten. Der Zeitpunkt der Änderungen in den Bedingungen und Stimulation durch Austritt Induktor werden oben angezeigt und sind durch Pfeile auf der blauen Linie reflektiert das Temperaturprofil markiert. Angenommen von Eidell et al. 13. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig3.jpg" /> Abbildung 3. Typische Anreicherung von Austritts-Phänotypen. Anreicherung Ergebnisse eines Austritts-Mutante in Wildtyp-Parasiten in verschiedenen Verhältnissen (x-Achse) versetzt. Der Anteil der Austritts-Phänotypen in der Bevölkerung bis nach dem Bildschirm aufgewachsen auf der y-Achse aufgetragen und wurde durch Durchflusszytometrie (Austritts-Mutante Parasiten exprimiert cytoplasmatischen YFP beurteilt, ausgedrückt Wildtyp-Parasiten cytoplasmic RFP). Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten sind durch rote, blaue und grüne Datenpunkte dargestellt. Angenommen von Eidell et al. 13. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig4.jpg" /> Abbildung 4. Typische Ergebnisse eines Austritts-Assay. A. Pfeile kennzeichnen vier verschiedenen intakt enthaltenden Vakuolen 4-8 Parasiten. B. Pfeile kennzeichnen vier Gruppen von verstreuten Parasiten widerspiegeln vier unabhängige egressed Vakuolen. Egress wurde durch A23187 (B) oder DMSO als negative Kontrolle (A) induziert. Parasiten exprimieren zytoplasmatische YFP 22. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig5.jpg" /> Abbildung 5. Verdünnungsstufe zur klonalen Linien Parasiten. Vier polyklonale Populationen (rot, blau, gelb, grün) seriell in einem einzigen 384-Well-Platte mit konfluenten HFF-Zellen verdünnt. Row C und I erhalten 10 Parasiten pro Vertiefung undsind 2-fach verdünnter (40 + 40 ul ul) bis H und N Reihen, jeweils. Der Grauton zeigt die sinkende Zahl der Parasiten pro Vertiefung. In der Regel werden einzelne Klone in Reihen DF und JL gefunden. <table border="1"><tbody><tr><td> Verbindung </td><td> Lager </td><td> Arbeitskonzentration </td><td> ul für T25 (10 ml) erforderlich </td><td> Inkubationszeit (min) </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 1 M in DMSO </td><td> 5 mM </td><td> 50 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> 190 Proof </td><td> 5% </td><td> 500 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> A23187 </td><td> 2 mM in DMSO </td><td> 1 uM </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Nigericin * </td><td> 2 mM in DMSO </td><td> 10 uM </td><td> 50 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> * Nigericin nicht in der Anreicherung verwendet werdenment-Bildschirm, wie die Parasiten nicht überleben Nigericin Stimulation; nur Nigericin bei der Validierung von Egress Mutanten. Tabelle 1. Egress-Induktoren in Verfahren verwendet werden. Verdünnen Sie in 10 ml HBBSc mit 25 mg / ml DS für den Bildschirm, oder gar keine DS-Mutante für die Validierung (Ausgangs-Assay). Alle Verbindungen von Sigma-Aldrich.

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+selective+killing+of+extracellular+parasites+by+oxidation+using+pyrrolidine+dithiocarbamate.">Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate.</a> Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).</li><li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+growth+assay+for+Toxoplasma+gondii+using+yellow+fluorescent+protein.">High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).</li><li>Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+approach+to+studying+invasive+mechanisms+of+Toxoplasma+gondii.">A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).</li><li>Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+of+Toxoplasma+gondii+invasion.">Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion.</a> J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).</li><li>Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+distribution+of+structural+mutants+in+ethylnitrosourea-treated+cultured+human+lymphoblastoid+cells.">Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).</li><li>Kafsack, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+membrane+disruption+by+a+perforin-like+protein+facilitates+parasite+exit+from+host+cells.">Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells.</a> Science. 323 (5913), 530-533 (2009).</li><li>Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+microneme+secretion+involves+intracellular+Ca(2+)+release+from+inositol+1,4,5-triphosphate+(IP(3))/ryanodine-sensitive+stores.">Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores.</a> J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).</li><li>Nagamune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abscisic+acid+controls+calcium-dependent+egress+and+development+in+Toxoplasma+gondii.">Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii.</a> Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).</li><li>Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Externally+triggered+egress+is+the+major+fate+of+Toxoplasma+gondii+during+acute+infection.">Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection.</a> J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).</li><li>Persson, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+receptor+ligation+or+exposure+to+perforin+trigger+rapid+egress+of+the+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii.">Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

<html> Die beschriebene Protokoll stellt eine effiziente Methode zur Toxoplasma Mutanten mit einer Austritts-Defekt zu isolieren. Wir haben erfolgreich Mutanten auf verschiedenen Stufen des Austritts Bahn, von denen einige eine doppelte Invasion Phänotyp 13 haben isoliert. Mögliche Auswirkungen auf die Invasion kann mit Hilfe der sogenannten Rot-Grün-Assay, die aus Nicht-Parasiten eingedrungen durch Differential-Antikörper-Färbung differenziert 23,24 überfallen werden. Für beide Inva...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> ENU </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N3385 </td><td> 1 M Stammlösung in DMSO, Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> EMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0880 </td><td> 1 M Stammlösung in DMSO, Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Dextransulfat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4911 </td><td></td></tr><tr><td> PDTC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8765 </td><td> 100 mM Stock in PBS </td></tr><tr><td> Diff Quick </td><td> EMD Chemicals </td><td> 65044-93 </td><td></td></tr><tr><td> Filterhalter </td><td> Cole-Parmer </td><td> 540100 </td><td></td></tr><tr><td> 3 um Polycarbonat-Filter </td><td> WhatmanSchleicher &amp; Schuell </td><td> 110612 </td><td></td></tr><tr><td> Hämozytometer </td><td> Hausser Scientific </td><td> 1475 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2-Inkubatoren </td><td> Verschiedene Hersteller </td><td></td><td> Befeuchteten 5% CO 2, 35, 37 und 40 ° C </td></tr><tr><td> Fluoreszenzmikroskop </td><td> Verschiedene Hersteller </td><td></td><td> Idealerweise invertiert, wide-field mit 63x oder 100x Öl-Objektiv </td></tr></tbody></table> HBSSc (nach Black et al 11.): <ul><li> 98,0 ml Hanks Balanced Salt Solution (Hyclone Katalognummer SH30588) </li><li> 100 ul 1 M MgCl 2 (100 mM Ende) </li><li> 100 ul 1 M CaCl 2 (100 mM Ende) </li><li> 2,0 ml 1 M Hepes pH 7,3 (20 mM Ende) </li><li> 84 mg NaHCO 3 (10 mm Ende) </li></ul>

a genetic screen to isolate toxoplasma gondii host-cell egress mutants

Die weit verbreitete, obligat intrazelluläre, einzelligen Parasiten Toxoplasma gondii verursacht opportunistische Erkrankung bei immungeschwächten Patienten und verursacht Missbildungen bei kongenitaler Infektion. 1: Die lytischen Replikationszyklus wird durch drei Phasen gekennzeichnet. aktive Invasion eines kernhaltigen Wirtszelle; 2. Replikation in der Wirtszelle; 3. aktive Austritt aus der Wirtszelle. Der Mechanismus des Austritts wird zunehmend als eine einzigartige, stark regulierten Prozess, der immer noch schlecht ist auf molekularer Ebene zu verstehen, zu schätzen. Die zugrunde liegenden Ausgangs-Signalwege sind durch die Verwendung von pharmakologischen Mitteln, die auf verschiedene Aspekte der Wege 1-5 gekennzeichnet. Als solches, mehrere unabhängige Auslöser Austritts identifiziert worden, die alle auf die Freisetzung von intrazellulärem Ca 2 + konvergieren, ein Signal, das ebenfalls kritisch ist für die Host-Invasion 6-8. Diese Einsicht teilte ein Kandidatengen-Ansatz, der auf die identi geführtFIZIERUNG der Pflanze wie Kalzium abhängige Proteinkinase (CDPK) in Egress 9 beteiligt. Darüber hinaus haben mehrere neuere Durchbrüche im Verständnis Egress gemacht worden mit (chemischen) genetische Ansätze 12.10. Um die Fülle an Informationen pharmakologische mit der zunehmenden Verfügbarkeit von genetischen Toxoplasma kombinieren wir vor kurzem ein Bildschirm erlaubt die Anreicherung für Parasiten Mutanten mit einem Defekt in der Wirtszelle Egress 13. Obwohl chemische Mutagenese mit N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff (ENU) oder Ethylmethansulfonat (EMS) wird seit Jahrzehnten in der Studie von Toxoplasma Biologie 11,14,15 verwendet worden, erst vor kurzem hat genetische Kartierung von Mutationen zugrunde liegen, die Phänotypen zur Routine geworden 16 -18. Ferner kann durch Erzeugen temperaturempfindlichen Mutanten können essentielle Verfahren präpariert und die zugrunde liegenden Genen direkt identifiziert. Diese Mutanten verhalten, als Wild-Typ unter der permissiven Temperatur (35 ° C), aber nicht zu proliferate bei der restriktiven Temperatur (40 ° C) als Ergebnis der Mutation in Frage. Hier zeigen eine neue phänotypische Screening-Verfahren, um Mutanten mit einem temperaturempfindlichen Austritts-Phänotyp 13 zu isolieren. Die Herausforderung für die Ausgangs-Bildschirmen ist es, aus Nicht-egressed Parasiten, die durch schnelle Re-Invasion und die allgemeine Klebrigkeit der Parasiten zu Wirtszellen kompliziert ist egressed trennen. Ein vorher festgelegten Ausstieg Bildschirm wurde auf einer Reihe von umständlichen Biotinylierung Schritte zur Trennung von extrazellulären Parasiten 11 intrazellulären basiert. Auch diese Methode nicht erzeugen bedingte Mutanten was zu schwachen Phänotypen. Das hier beschriebene Verfahren überwindet die starke Bindung von Parasiten austritt, indem ein Glykan Konkurrenten, Dextransulfat (DS), die Parasiten verhindert das Anhaften von dem Host-Zelle 19. Darüber hinaus sind extrazelluläre Parasiten speziell durch Pyrrolidin (PDTC), die intrazelluläre Parasiten verlässt getötet20 unverletzt. Deshalb mit einem neuen phänotypischen Bildschirm, um gezielt zu isolieren Parasit Mutanten mit Defekten in induzierter Egress, kann die Kraft der Genetik nun voll eingesetzt werden, um die molekularen Mechanismen der Wirtszelle Egress entwirren.

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A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Vorwärts Genetik ist eine leistungsfähige Methode, um die molekularen Ebene, wie entwirren<em&gt; Toxoplasma</em&gt; Austritt aus der Wirtszelle. Protokolle werden bereitgestellt, um chemisch mutagenisieren Parasiten, bereichern nach Mutanten mit Defekten in der induzierten Egress und Validierung der Phänotyp der Mutanten geklont.

Ein genetischer Screen zu isolieren Toxoplasma gondii Host-Zelle Egress Mutanten

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

12.9K Aufrufe.  Boston College. Vorwärts Genetik ist eine leistungsfähige Methode, um die molekularen Ebene, wie entwirren Toxoplasma Austritt aus der Wirtszelle. Protokolle werden bereitgestellt, um chemisch mutagenisieren Parasiten, bereichern nach Mutanten mit Defekten in der induzierten Egress und Validierung der Phänotyp der Mutanten geklont.

Serie: A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

Gewinnung von hochgradig gereinigter Toxoplasma gondii Oocysten durch eine diskontinuierliche Cäsiumchloridgradienten

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma gondii Zystenwand Formation in Activated Knochenmark abgeleiteten Makrophagen und Bradyzoite AGB

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

Transnuclear Mäuse mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor Spezifitäten gegen Toxoplasma gondii Via SCNT Erhalten

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

Eine einfache und effiziente Methode, um Makrophagen aus Mixed primären Kulturen von adulten Leber Zellen zu isolieren

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Genetische Manipulation in<em&gt; Δku80</em&gt; Die Stämme für Funktionelle Genomanalyse<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Mit Klick-Chemie, um die Wirkung von Viral Infection auf Host-Zell-RNA Synthese Messen

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Zukunfts Genetics Screens Mit Makrophagen zu identifizieren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gene wichtig für die Resistenz gegenüber IFN-γ-abhängige Zell autonome Immunität

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.