Die Autoren sind dankbar, H. Eisen, M. Gubbels, K. van Grinsven, E. Guillen, A. Drake, V. Mahajan, Q. Gao und G. Yap für fruchtbare Diskussionen und Reagenzien. Wir sind dankbar, J. Dausman, R. Flannery, und J. Jackson für die Unterstützung bei der Verwaltung der Maus Kolonie. Wir sind dankbar, P. Wisniewski für FACSorting. EMF wurde vom Human Frontier Science Program unterstützt. RJ wurde von National Institute of Health gewährt RO1-HD045022 und R37-CA084198 unterstützt. HLP wurde durch Zuschüsse aus dem National Institute of Health unterstützt.

Diese Methode wurde in der Forschung in gemeldet verwendet <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/328/5975/243">Kirak et al., Science 328 (5975), 243-248 (2010)</a> . 1. Isolation von Spenderzellen Bevor spezifischen T-oder B-Zellen als Spenderzellen verwendet werden kann, um transnuclear Mausmodellen zu erzeugen, brauchen Mäuse mit einem Pathogen infiziert von Interesse sein oder immunisiert mit einem Antigen von Interesse. Da wir CD8 +-Zellen spezifisch für Toxoplasma gondii verwendet haben, wird das folgende Protokoll beschreibt die Erzeugung und Isolierung dieser Zellen und muss je nach persönlichem Interesse angepasst werden. <ol><li> Zysten von einer Maus Hirnhomogenat (ca. 40) abgeleitet werden intraperitoneal in BL / 6 x Balb / c F1 (B6CF1) Mäusen, die Trennung der beiden H-2 b und H-2 d restringierte CD8 + T-Zellen ermöglicht injiziert. </li><li> Auf dem Höhepunkt der Immunantwort, wird die infizierte Maus eingeschläfert, der Milz isoliert und in eine Schale mit 6 ml roter Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer. </li><li> Mit dem mattierten Seiten von zwei Deckgläser, ist die Milz sorgfältig geschliffen und inkubiert in der RBC-Lyse-Puffer für 5 min bei RT. </li><li> Fügen Sie 14 ml PBS, filtern die Zellsuspension durch eine Zelle Sieb (40 oder 70 um) in einen 50 ml Falcon-Röhrchen und zentrifugieren Sie für 5 min bei 300g. </li><li> Überstand entfernen, Zellpellet in 1 ml PBS und Überführung in eine 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Zentrifuge für 5 min bei 300g und Überstand danach. </li><li> Zellpellet in 50 ul PBS, fügen fluoreszenzmarkierten Antikörpern auf den jeweiligen Zelltyp von Interesse (zB CD3, B220, CD8 und CD4) zu identifizieren, und fluoreszenzmarkierten MHC-I-Tetramer (MHC-II-Tetramer für CD4 T-Zellen) geladen mit dem Peptid von Interesse für die Zell-Suspension und Inkubation für 30 min bei 4 ° C. </li><li> 1 ml PBS, Zentrifuge für 5 min bei 300 g, Pellet in 3 ml PBS, und filtern Sie die Zellsuspension durch eine Zelle Sieb (40 oder 70 um) in ein Rohr. </li><li> Führen FACSorting, indem Sie die Tore stringent (Abbildung 1B). </li></ol> 2. Somatic Cell Nuclear Transfer Es gibt ein paar Protokolle für Somatic Cell Nuclear Transfer. Die hier beschriebene nutzt Eizellen in der Metaphase-II festgenommen und die Hemmung der zweiten Reifeteilung mit Cytochalasin B. Deshalb Spenderzellen benötigt, die in G0/G1 Phase. <ol><li> Vorbereitung von Oozyten <ol><li> Weibliche Mäuse von BDF1 Hintergrund sind intraperitoneal mit 5IU PMS pro Maus von 17.00 bis 07.00 Uhr injiziert. </li><li> Etwa 47 Stunden später wird jeder Maus intraperitoneal mit 5IU HCG injiziert. </li><li> Bereiten Sie eine Kulturschale (KSOM-AA Tropfen unter Öl) für die Eizellen noch am selben Tag wie der hCG-Injektion und legen Sie sie in einen Inkubator 37 ° C, 5% CO 2. Auch bereiten sich die Nadeln, die für SCNT (7μm für Enukleation und 4 oder 5 um für Kerntransfer von Lymphozytenkerne), indem Sie sie mit Quecksilber. </li><li> Euthanize Mäusen und isolieren Eileiter über 13h nach HCG (ca. 8 Uhr). Sammeln Sie die Eileiter in 1-2 Tropfen HCZB. </li><li> One-by-one bewegen Sie den Eileiter in einen Tropfen mit M2 w / Hyaluronidase. Nick den Eileiter vorsichtig mit einem ForceP und bewegen Sie die Oozyten-Cumulus-Komplex in der Drop. Nachdem alle Oozyten-Cumulus-Komplexe isoliert worden sind, die Schale ist bei 37 ° C. </li><li> Nach 2-5 min (die genaue Zeit hängt von der Partie Hyaluronidase) sammeln die Oozyten, in HCZB und Platte sie in KSOM-AA Tropfen waschen. </li></ol></li><li> Enukleation der Oozyten <ol><li> Verwenden Sie den Deckel einer Petrischale, die SCNT Platte vorbereiten. Richten Sie das Mikroskop und der Mikromanipulator. </li><li> Waschen Sie die Enukleation Nadel (7 um) in PVP vor dem Start mit Enukleation. </li><li> Für Enukleation, statt eine Gruppe von Oozyten (10-30) in einen Tropfen HZCB mit Cytochalasin B (5 ug / mL). Während der Inkubation (min. 5 min) Line-Up der Eizellen horizontal. </li><li> Nehmen Sie eine Eizelle und stellen Sie ihn vor der Holding Nadel. Fix die Eizelle nicht die Haltung Nadel durch Anlegen eines Vakuums. Mit der Enukleation Nadel, drehen Sie die Eizelle bis zum Chromosom-Spindel-Komplex (CSC, die oft als &quot;Kern&quot;) ist in der 3-Uhr Position. </li><li> Mit Piezo-Puls dringt der Zona pellucida sorgfältig ohne Beschädigung der Eizelle. Legen Sie die Öffnung der Nadel neben der Metaphase-II Spindel und Vakuum anlegen. Der &quot;Kern&quot; sollte langsam in die Nadel zu bewegen, und die Membran sollte sich Dichtung, wenn es vollständig entfernt wird. </li><li> Übertragen Sie die entkernte Eizellen zurück in die KSOM-AA Tropfen, und waschen Sie sie mehrere Male. Wiederholen Sie die eKeimbildung Schritte mit einer neuen Gruppe von Oozyten. Fort, bis alle Eier entkernt werden oder bis zu 11AM. </li></ol></li><li> Nuclear Transfer <ol><li> Für den Kerntransfer, Austausch der Enukleation Nadel (7 um) mit einem Kerntransfer Nadel (4 oder 5 um) und waschen Sie es mit PVP. </li><li> Legen Sie Ihre Zellen von Interesse (zB CD8 + T-Zellen) in einen Tropfen mit PVP, gut mischen und Inkubation für mindestens 10 min. </li><li> Legen Sie eine Gruppe von entkernte Eizellen (10-30) in einen Tropfen HCZB mit Cytochalasin B (2,5 pg / mL). Während der Inkubation (min. 5 min) Line-Up Eizellen horizontal mit dem Kerntransfer Nadel. </li><li> Pick-up ein Donor-Zelle aus dem PVP-Zell-Suspension und saugen es in-and-out, bis die äußere Membran hat sich (Fragmente der Membran und Cytosol sichtbar sein soll) gebrochen. Bei Bedarf kann ein Piezo-Puls angewendet werden können. Einmal im Zellkern isoliert worden ist, verschieben Sie sie ein wenig in die Nadel, und weiterhin abholen Kerne bis 10-30 haben. </li><li> Bewegen Sie die Tropfen mit den ausgerichteten entkernte Eizellen. Fix eine Eizelle mit dem Betrieb Nadel durch Anlegen von Vakuum. Setzen Sie den Kerntransfer Nadel (die Kerne sollten weg von der Öffnung) angrenzend an die Zona pellucida und gelten Piezo-Puls, bis die Nadel durch die Zona pellucida gegangen ist. Vorsichtig bewegen einen Kern an der Spitze der Nadel, die Nadel in die Eizelle, bis die Spitze der Nadel 2 / 3 im Inneren. Tragen Sie eine kleine Unterdruck, so dass ein wenig von der Eizelle Membran in die Nadel. </li><li> Der nächste Schritt ist sehr kritisch, da es das einzige Mal, wenn die Eizelle ist eigentlich &quot;offen&quot;. Tragen Sie einen einzigen Impuls von Piezo, drücken Sie den Kern aus der Nadel durch die Anwendung von Überdruck, vorsichtig wieder die Nadel so, dass die Spitze ist ca. 1 / 3 in die Eizelle, und wenden Sie dann Unterdruck und weiter ziehen Sie die Nadel Siegel der Eizelle. Wiederholen Sie diesen Schritt mit jeder Eizelle. </li><li> Nachdem alle Eizellen von einer Gruppe einen Kern erhalten haben, werden sie gewaschen und in KSOM-AA Medien kultiviert. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit allen Eizellen. </li><li> Nach der letzten Gruppe hat Kulturen in KSOM-AA wurde für mindestens 30 min, sind die SCNT-Embryonen in Tropfen Ca-freien Aktivierungs-haltigen Medien SrCl2 übertragen. </li><li> Nach 6 Stunden der Aktivierung wird die Menge von Pseudo-Vorkerne (PPN)-positive SCNT-Embryonen bestimmt. Die Embryonen werden dann gewaschen und kultiviert, in KSOM-AA Tropfen für weitere 3,5 Tage, bis sie das Blastozysten-Stadium erreicht haben. </li><li> Drogen oder Chemikalien der Wahl (wie Trichostatin A) kann die Aktivierung und Kulturmedien zugesetzt werden. </li></ol></li></ol> 3.Derivation von embryonalen Stammzellen Die SCNT-Blastozysten kann entweder übertragen sie in pseudo-schwangere Frauen (auch als direkte oder Ein-Schritt-Klonen genannt) oder zur Ableitung von embryonalen Stammzellen (auch als indirekte oder Zwei-Schritt-Klonen genannt) werden. Da es viel effizienter, ES-Zellen zu erzeugen, wählen wir die Zwei-Schritt-Verfahren. Im Falle der Wissenschaftler in direkter Klonen interessiert ist, kann der Blastozysten direkt in pseudo-schwangere Frauen übertragen werden, wie in Abschnitt 5 beschrieben. Es gibt viele Protokolle beschreiben die Gewinnung von embryonalen Stammzellen. Die hier beschriebene ist eine Standard-Technik, die Feeder-Zellen und fetalem Kälberserum verwendet. <ol><li> Der zweite Tag nach dem Kerntransfer, bereiten Sie einen 96-U-Well-Platte für ES-Zell-Ableitung. </li><li> 100 l Gelatine in jedes Well einer 96-U-Well-Platte, für ein Minimum von 10 min inkubieren, und entfernen Sie sie danach. </li><li> Thaw Feeder-Zellen und Zellen in ein entsprechendes Volumen von ESD Medium, zB Feeder-Zellen entspricht einer Fläche von 25 cm 2 werden in 10 mL ESD mittel-und 200 ul der Zellsuspension resuspendiert wird in jede der Gelatine-behandelten hinzugefügt. </li><li> Legen Sie die Platte in einen Inkubator und Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Nach 3,5 Tagen sollte die Embryonen im Blastozysten-Stadium sein. </li><li> Bereiten Sie eine sterile bakterielle Gericht durch Plattieren ein paar Tropfen ES-Zell-Medium und sauren thyrode. </li><li> Die Blastozysten werden zunächst aus der KSOM-AA Tropfen zu Tropfen mit normalem ES-Zell-Medium überführt und zweimal gewaschen. </li><li> Sorgfältig Transfer einer Gruppe von Blastozysten (5-10 Blastozysten) in einem Tropfen sauren thyrode und halten dort, bis der Zona pellucida gelöst hat. </li><li> Die Blastozysten werden dann in einen Tropfen mit ES-Medium überführt, zweimal, und dann in den Feeder-beschichtete 96-U-Well-Platte (eine Blastozyste zu einer gut). </li><li> Die Embryonen werden dann für 5-7 Tage in einem Brutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 kultiviert, ohne sie zu stören. Dies verleiht dem Embryo Zeit, um einettach der Feeder-Schicht, und ein Auswuchs bilden. </li><li> Bereiten 24-Well-Platten, durch Plattieren Anleger in ESD-Medium in jede Vertiefung, zB resuspendieren ein Äquivalent von 50 cm 2 Feeder in 12 mL ESD Medium, und fügen Sie 500 ul der Zellsuspension in jede Vertiefung. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die ESD Medium aus dem 96-U-Well-Platte mit den Embryonen, die jeweils gut waschen zweimal mit je 250 ul Hepes (oder PBS), mit 50 ul Trypsin und Inkubation für ca. 5 min bei 37 ° C. </li><li> Pipette nach oben und unten mehrere Male, bis Auswuchs hat außer in einem einzigen-Zell-Suspension, Transfer in eine 24-Well-Platte und bei 37 ° C, 5% CO 2. Gesunken </li><li> Wenn ESC Ableitung erfolgreich war, sollte ESC Kolonien werden nach 7-10 Tagen sichtbar. </li></ol> 4.Blastocyst Injektion Die Injektion von Blastozysten ist eine Routine-Technik für jede Art von transgenen Mausmodell zu generieren. Es ist wichtig zu erwähnen, dass die Injektion von Blastozysten und die anschließende Überführung in pseudo-schwangere Weibchen gut getimten werden muss. <ol><li> Prime weiblichen Mäusen mit PMS und HCG, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben. Nach HCG-Injektion setzen weibliche Mäuse mit männlichen Mäusen (eine weibliche und eine männliche Maus pro Käfig). </li><li> Am nächsten Tag überprüfen Frauen für Stecker. Dies wird als 0.5dpc (Tage post coitus) gezählt. </li><li> Befruchteten Embryonen werden dann aus dem Eileiter, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben, und kultiviert in KSOM-AA für weitere 3 Tage isoliert. </li><li> Bereiten Sie ES-Zellen am Tag der Blastozyste Injektion (3.5dpc). </li><li> Entfernen Sie Medium aus ES-Zellen, zweimal waschen mit Hepes (oder PBS), fügen Trypsin und Inkubation für 5 min bei 37 ° C. </li><li> Resuspendieren trypsiniert Zellen mit ES-Medium, Platte in eine Schüssel, und inkubieren für 45-60 min bei 37 ° C, 5% CO 2 in Höhe von Feeder-Zellen (Feeder-Zellen schneller als ES-Zellen haften) zu reduzieren. </li><li> Übertragen Sie die Zellsuspension durch eine Zelle Sieb (40 oder 70 um) in ein Röhrchen und zentrifugieren für 5 min bei 1000rpm. </li><li> Überstand entfernen, resuspendieren Zellpellet in 500 ul ES Medium und speichere sie auf Eis, bis sie benötigt. </li><li> Bereiten Sie den Deckel eines sterilen bakteriellen Gericht durch Ausplattieren Tropfen mit PVP und HCZB. </li><li> Bereiten Sie eine 15 mu m Nadel durch Belastung mit Quecksilber, indem sie in Position und Waschen mit PVP. </li><li> Legen Sie eine Gruppe von Blastozysten (10-30 Blastozysten) in einen Tropfen mit HCZB, und fügen 5-50 ul ES-Zell-Suspension (abhängig von der Konzentration) in einen anderen Tropfen HCZB. </li><li> Pick-up-ES-Zellen (50-100 Zellen) mit der Injektionsnadel. </li><li> Gehen Sie zum Drop mit der Blastozysten. Richten Sie die Blastozysten horizontal und fix man mit der Holding Nadel durch Anlegen von Vakuum. </li><li> Mit der Injektionsnadel wiederum die Blastozyste, bis der inneren Zellmasse (ICM) ist an der 9-Uhr-Position. </li><li> Zeigen Sie mit der Injektionsnadel bei 3 Uhr, stellen Sie sicher, dass es keine ES-Zellen an der Spitze der Nadel, und wenden Piezo-Puls, bis die Injektionsnadel dringt durch die Zona pellucida und die Trophektoderm in die blastocoel. </li><li> Veröffentlichung ein paar ES-Zellen (5-15 Zellen), so dass die ES-Zellen der ICM-Stick. Fort, bis alle Blastozysten einer Gruppe mit ES-Zellen injiziert worden. </li><li> Nach einer Gruppe von Blastozysten fertig ist, waschen Sie sie zweimal in KSOM-AA und bewahren Sie sie in einen Tropfen mit KSOM-AA, bis alle Blastozysten injiziert werden. </li></ol> 5. Embryotransfer Die Übertragung der Embryonen in pseudo-schwangere Frauen stellt einen chirurgischen Eingriff, die sehr sorgfältig und nach den Richtlinien des Forschers Institut durchgeführt werden muss. <ol><li> Betäuben weiblichen Empfängermäuse, rasieren unteren rechten Quadranten und zu desinfizieren. </li><li> Mit einer Schere öffnen Sie die Haut, und trennen Sie das Bauchfell von der Haut. </li><li> Suchen Sie den Eierstock durch das Bauchfell (roter Punkt), und öffnen Sie das Bauchfell in der Nähe des Eierstocks. </li><li> Mit einer Pinzette vorsichtig greifen die Eileiter und ziehen Sie die Gebärmutter. </li><li> Pick-up eine Gruppe von etwa 10 Blastozysten mit einer Kapillare verbunden mit einem Mund pipettieren. </li><li> Fix die Gebärmutter mit einem Pinzette, Punsch eine kleine ganze hinein mit einer kleinen Nadel, und legen Sie die Kapillare mit der Blastozysten in das Lumen des Uterus. </li><li> Nach vorsichtiger Embryonen in die Gebärmutter, und entfernen Sie Ihre Kapillare. </li><li> Drücken Sie die Gebärmutter zurück in die Bauchhöhle. </li><li> Suchen Sie die Kanten des Bauchfells und schließen Sie es mit ein paar Stichen. </li><li> Schließen Sie die Haut der Maus mit ein paar Klammern. </li><li> Für post-operativen Schmerzen, verwalten 5 ug Carprofen pro mg Körpergewicht. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Somatic cell nuclearÜbertragung von vordefinierten T-Zellen in B6CF1 Hintergrund. Absolute und relative Anzahl von Embryonen aus CD8 + T-Zellen und embryonale Stammzellen aus Blastozysten gewonnen SCNT generiert. <img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Representative durchflusszytometrische Analyse von chimären Mäusen mit SCNT embryonale Stammzellen injiziert. Tor und Anzahl (Prozent insgesamt CD8 + T-Zellen) zeigt das Vorhandensein von spezifischen CD8 + T-Zellen in chimären Mäusen.

<ol>
	<li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=V(D)J+recombination.">V(D)J recombination.</a> Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).</li><li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements.">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).</li><li>Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).</li><li>Kishigami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer.">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).</li><li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cloning+with+nucleus+donor+cells+of+different+age+and+type.">Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type.</a> Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).</li></ol>

Wir haben hier, dass SCNT verwendet werden, um transnuclear Mäuse von T-Zellen mit vordefinierten Spezifität generiert werden gezeigt. Obwohl hier nicht gezeigt, sollte die Technik auch nutzbar sein, um transnuclear Mäuse von B-Zellen mit vordefinierten Spezifität zu generieren. Eine wichtige Sache zu prüfen, ist die Belastung und das Geschlecht der Maus, die infiziert oder geimpft und verwendet werden, um T-oder B-Zellen von Interesse zu isolieren. Da T-und B-Zellen eine sehr geringe Umprogrammierung Effizienz im Allgemeinen haben, empfehlen wir die Verwendung F1-Hybriden gewünschten Haplotyp. Da der Donor-Zelle bestimmt auch das Geschlecht, empfehlen wir die Verwendung T-oder B-Zellen aus männlichen Mäusen. Dies bedeutet, dass nur männliche chimäre Mäuse würden die TCR-oder BCR durch die Keimbahn übertragen, mit männlichen Mäusen wird einfacher und schneller zu züchten. Zusammen genommen denken wir, dass epigenetische Reprogrammierung via SCNT stellt ein leistungsfähiges Tool, um eine neue Art von Maus-Modellen, die von großem Vorteil für die immunologische Feld erzeugt.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Red Blood Cell lysis Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R7757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell strainer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>REF 352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pregnant Mare Serum (PMS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>367222</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human Chorionic Gonadotropin (HCG)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>230734</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4272</td>
<td>Type IV-S</td>
</tr>
<tr>
<td>KSOM-AA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MR-106-D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HCZB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MR-173-D</td>
<td>Customized medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Ca-free medium for activation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>MR-174-D</td>
<td>Customized medium</td>
</tr>
<tr>
<td>SrCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>255521</td>
<td>100mM = 10x</td>
</tr>
<tr>
<td>AlbuMAX I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11020-021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PVP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biotech</td>
<td>102787</td>
<td>Make 10% solution using HCZB, and add 0.1% AlbuMAX I</td>
</tr>
<tr>
<td>Cytochalasin B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C6762</td>
<td>500&mu;g/ml = 100x</td>
</tr>
<tr>
<td>Trichostatin A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8552</td>
<td>5mM = 1000x</td>
</tr>
<tr>
<td>Mineral Oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Holding needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Humagen</td>
<td>MPH-SM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Injection and transfer needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Humagen</td>
<td>4-15, 7-15, 15-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouth pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Instruments</td>
<td>14088-10</td>
<td>or something similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Instruments</td>
<td>11251-10</td>
<td>or something similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Wound Clip Applicator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>427630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Wound Clips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>427630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>K871H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D6429</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30071.03</td>
<td>15%</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-602E</td>
<td>100x</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutamin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>101806</td>
<td>200mM = 100x</td>
</tr>
<tr>
<td>Non-essential Aminoacids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>11140050</td>
<td>100x</td>
</tr>
<tr>
<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>21985-023</td>
<td>5&mu;l in 500ml</td>
</tr>
<tr>
<td>LIF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>ESG1106</td>
<td>1000x</td>
</tr>
<tr>
<td>MEK inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling</td>
<td>9900L</td>
<td>For ES derivation only, add to ES medium (final concentration 50&mu;M)</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

transnuclear mice with pre-defined t cell receptor specificities against toxoplasma gondii obtained via scnt

Lymphozyten, wie T-Zellen, eine genetische V (D) J-Rekombination, die an einen Rezeptor mit einer bestimmten Spezifität 1 zu erzeugen. Mäuse transgene für eine neu Antigen-spezifischen T-Zell-Rezeptor (TCR) haben ein unverzichtbares Werkzeug, um T-Zell-Entwicklung und Funktion untersucht worden. Allerdings sind solche TCRs in der Regel aus dem jeweiligen T-Zellen nach einer Langzeit-Kultur oft nach wiederholter Antigen-Stimulation, die unvermeidlich wählt für T-Zellen mit hoher Affinität isoliert. Zufällige genomische Integration der TCR α-und β-Kette und Ausdruck von Nicht-endogenen Promotoren können auf Veränderungen in Expression und Kinetik führen. Epigenetische Reprogrammierung über Kerntransfer somatischer Zellen bietet ein Werkzeug, um embryonale Stammzellen und Mäuse aus jeder Zelle von Interesse zu erzeugen. Folglich wird, wenn SCNT um T-Zellen des bekannten Spezifität angewendet wird, werden diese genetischen V (D) J Umlagerungen der SCNT-embryonalen Stammzellen (ESZ) und die Mäuse aus ihnen abgeleiteten übertragen, während epigenetische Markierungen zurückgesetzt werden. Wir haben gezeigt, dass T-Zellen mit vordefinierten Spezifitäten gegen Toxoplasma gondii verwendet werden, um Maus-Modelle, die die spezifischen TCR Ausdruck von ihren endogenen Loci, ohne experimentell genetische Veränderung zu erzeugen. Die relative Leichtigkeit und Geschwindigkeit, mit der solche transnuclear Modelle gewonnen werden können verspricht für den Bau anderer Krankheitsmodelle.

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Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Wir zeigen hier, dass epigenetische Reprogrammierung über Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) als Instrument zur Maus-Modellen mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor (TCR) Besonderheiten erzeugen kann verwendet werden. Diese transnuclear Mäuse exprimieren die entsprechenden TCR von ihren endogenen Locus unter die Kontrolle des endogenen Promotors.

Transnuclear Mäuse mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor Spezifitäten gegen Toxoplasma gondii Via SCNT Erhalten

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

transnuclear-mice-with-pre-defined-t-cell-receptor-specificities

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

14.0K Aufrufe.  Whitehead Institute for Biomedical Research. Wir zeigen hier, dass epigenetische Reprogrammierung über Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) als Instrument zur Maus-Modellen mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor (TCR) Besonderheiten erzeugen kann verwendet werden. Diese transnuclear Mäuse exprimieren die entsprechenden TCR von ihren endogenen Locus unter die Kontrolle des endogenen Promotors.

Serie: Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

Gewinnung von hochgradig gereinigter Toxoplasma gondii Oocysten durch eine diskontinuierliche Cäsiumchloridgradienten

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma gondii Zystenwand Formation in Activated Knochenmark abgeleiteten Makrophagen und Bradyzoite AGB

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Ein genetischer Screen zu isolieren Toxoplasma gondii Host-Zelle Egress Mutanten

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Genetische Manipulation in<em&gt; Δku80</em&gt; Die Stämme für Funktionelle Genomanalyse<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Zukunfts Genetics Screens Mit Makrophagen zu identifizieren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gene wichtig für die Resistenz gegenüber IFN-γ-abhängige Zell autonome Immunität

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Entwicklung von Stammzellen abgeleiteten Antigen-spezifische regulatorische T-Zellen gegen Autoimmunität

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

Identifikation von Mediatoren der T-Zell-Rezeptor Signalgebung über das Screening von chemischen Inhibitors Bibliotheken

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational methods, such as next generation sequencing (NGS), yield enormous sets of data on the antibody repertoire at the sequence level, functional data is required to identify which sequences are relevant for a particular antigen or set of antigens. Here, we describe a method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from a human blood donor. This method utilizes an initial enrichment of mature B cells and requires a combination of phenotypic cell markers and fluorescently-labeled protein to isolate IgG memory B cells via flow cytometry. The heavy and light chain variable regions are then cloned and re-screened. Although limited to the memory B cell compartment, this method takes advantage of flow cytometry to interrogate millions of B cells and returns paired heavy and light chain sequences from a single cell in a format ready for expression and confirmation of specificity. Antibodies recovered with this method can be considered for therapeutic potential, but can also link specificity and function with bioinformatic approaches to assess the B cell repertoire within individuals.

The BSelex method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from human peripheral blood mononuclear cells combines flow cytometry with single cell PCR and cloning.

Einzellige Screening-Methode zur Auswahl und Wiederherstellung von Antikörpern mit gewünschten Besonderheiten aus angereicherten menschlichen Gedächtnis B-Zellpopulationen

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...

Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of liver cancer. This is a major concern, especially in developing countries. Failure of the immune system to mount an effective response against HBV leads to chronic infection. Although HBV vaccine is present and novel antiviral medicines are being created, eradication of virus-reservoir cells remains a major health topic. Described here is a method for the generation of viral antigen (Ag) -specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) (i.e., iPSC-CTLs), which have the ability to suppress HBV replication. HBV replication is efficiently induced in mice through hydrodynamic injection of an HBV expression plasmid, pAAV/HBV1.2, into the liver. Then, HBV surface Ag-specific mouse iPSC-CTLs are adoptively transferred, which greatly suppresses HBV replication in the liver and blood as well as prevents HBV surface Ag expression in hepatocytes. This method demonstrates HBV replication in mice after hydrodynamic injection and that stem cell-derived viral Ag-specific CTLs can suppress HBV replication. This protocol provides a useful method for HBV immunotherapy.

Presented here is a protocol for the effective suppression of hepatitis B virus (HBV) replication in mice by utilizing adoptive cell transfer (ACT) of stem cell-derived viral antigen (Ag)-specific T lymphocytes. This procedure may be adapted for potential ACT-based immunotherapy of HBV infection.

Stammzell-abgeleitete virale Ag-spezifische T-Lymphozyten unterdrücken HBV-Replikation bei Mäusen

Hepatitis B virus (HBV) infection is a global health issue. With over 350 million people affected worldwide, HBV infection remains the leading cause of ...