Diese sensiblen Strategien können verwendet werden, um die Hemmungswirksamkeit von chemischen Inhibitoren zu bewerten und in Kombination mit CRISPR-Cas9 Gen-Deletion, um die Arzneimittelziele zu untersuchen. Anstatt einen Endpunkttest zu verwenden, kann das Parasitenwachstum im Laufe der Zeit überwacht werden, um die Berechnung der Parasitenverdoppelungszeit mit einem empfindlichen Reporterprotein zu ermöglichen. Dieser Assay kann potenziell in 384 oder 1, 536 Well-Mikroplatten für die Prüfung mehrerer Verbindungen oder für das Screening von Bibliotheken in einer hohen Durchsatz-Weise skaliert werden.
Diese Strategie kann modifiziert werden, um das Wachstum anderer intrazellulärer mikrobieller Krankheitserreger und ihre Reaktionen auf das Medikament von Interesse zu quantifizieren. Um einen auf Luziferase basierenden Toxoplasma-Wachstumstest durchzuführen, beginnen Sie mit der sorgfältigen Ansaugung des Mediums aus vorsaatierten 96-Well-Mikroplattenkulturen menschlicher Vorhaut-Fibroblasten und impfen Sie 150 Mikroliter Parasiten-B-Suspension in die Brunnen in einem dreisäulenförmigen Format. Nach einer vierstündigen Inkubation im Zellkultur-Inkubator, saugen Sie vorsichtig das Medium aus jedem Brunnen, um die nicht eingedrungenen Parasiten zu entfernen und füllen Sie die Brunnen in jeder, aber die erste Reihe mit Raumtemperatur phenol rotes medium.
Dann 100 Mikroliter einer 12,5 Mikromolar-Luziferase-Substratlösung in PBS in jeden Brunnen der oberen Reihe geben und die Mikroplatten 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um eine vollständige Zelllyse zu ermöglichen. Messen Sie am Ende der Inkubation die Luziferaseaktivität auf einem Mikroplattenleser. Jede Messung stellt die anfängliche Anzahl der eingedrungenen Parasiten nach vier Stunden nach der Infektion dar.
Wiederholen Sie die Analyse alle 24 Stunden für die nächsten vier Tage, ohne das Medium zu ändern. Um die normalisierte Faltenveränderung des Parasitenwachstums zu berechnen, kann jeder Messwert durch den ersten Messwert bei vier Stunden nach der Infektion geteilt werden. Das Protokoll 2 der normalisierten Faltenveränderung des Parasitenwachstums kann dann gegen jeden Zeitpunkt geplottet und einer linearen Regressionsfunktion unterzogen werden, um die Steigung zu erhalten, die die Verdoppelungszeit darstellt.
Um die Wirksamkeit der Hemmung einer Verbindung von Interesse auf Toxoplasma Wachstum zu bewerten, Kultur menschliche Vorhaut Fibroblasten in 96-Well-Mikroplatten für mindestens sieben Tage vor der Impfung jeder Bohrkörper von Zellen mit 150 Mikroliter Parasiten, wie für vier Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid gezeigt. Während der Inkubation die Zinsverbindung bei acht verschiedenen Konzentrationen in einem 12-Well-Reservoir durch serielle Verdünnung vorbereiten. Verdünnen Sie die Verbindungen in einem 12-Well-Reservoir bei einer Verdünnung von eins zu drei, indem Sie jedes Gemisch mehrmals mit einer Ein-Milliliter-Pipette nach oben und unten pipetieren.
Nach vier Stunden nach der Infektion, ersetzen Sie das Medium in jedem Brunnen aus den Spalten zwei bis neun mit 150 Mikroliter Medium mit jeder Verdünnung der Verbindung ergänzt, so dass die erste Spalte mit regulären Medium gefüllt, um als die unbehandelte Kontrolle dienen. Dann kehren Sie die Zellkulturen für 96 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück und messen Sie die Luziferase-Aktivität für jeden Brunnen, um den Prozentsatz der Wachstumshemmung in den Kulturen bei jeder Konzentration der Verbindung zu bestimmen. Um die normalisierte Luziferase-Aktivität als Prozentsatz zu berechnen, teilen Sie die durchschnittliche Luziferase-Aktivität für jede zusammengesetzte Konzentration durch die durchschnittliche Luziferase-Aktivität, die von den nicht behandelten Parasiten abgeleitet wird.
Dann verwenden Sie ein geeignetes Graphik-Programm, um die normalisierten Luziferase-Aktivitäten gegen die einzelne Verbindung zu zeichnen und die halbmaximale hemmende Konzentration für jede Verbindung zu berechnen. Um ein Plasmidkonstrukt zu erzeugen, das eine einzige Führungs-RNA und Cas9 zum Löschen eines Gens von Interesse ausdrückt, navigieren Sie zur Toxoplasma Genomics Resource-Seite und rufen Sie die gesamte Gencodierungssequenz einschließlich der Introns und Exons zusammen mit den 1,5 Kilobase fünf und drei wichtigsten unübersetzten Regionen ab. Kopieren Sie die abgerufene TgCPL-Sequenz in die Sequenzanalysesoftware und beschriften Sie die fünf und drei wichtigsten nicht übersetzten Regionen.
Klicken Sie auf der Seite Toxoplasma Genomics Resource auf Herunterladen, Datendateien und Current_Release. Wählen Sie im Ordner T.gondii GT1 FASTA aus. Laden Sie aus dem Datenordner die Toxoplasma gondii GT1-Stammsequenzdatei herunter.
Erstellen Sie dann einen lokalen Ordner namens Toxoplasma Genome in der DNA-Sequenzanalysesoftware und importieren Sie die Toxoplasma-Genomsequenzdatei in den Ordner. Wählen Sie Extras, Klonen und CRISPR-Sites suchen aus, und legen Sie drei erstklassige Cas9-Plätze für den PAM-Standort fest. Wählen Sie eine Single-Guide-RNA, die eine hohe Spezifitätsnote zeigt, im Allgemeinen größer als 98%, und fehlt ein G nach der NGG.
Die ausgewählte Single-Guide-RNA befindet sich in der Regel an Standorten in der Nähe des Start- und Stopp-Codons des Gens von Interesse. Verwenden Sie dann einen PCR-Premix mit den in der Tabelle angegebenen Einstellungen, um eine PCR-Reaktion durchzuführen, um das bereits vorhandene Plasmid zu modifizieren, das Single-Guide-RNA exemittiert, die auf das TgUPRT-Gen abzielt. Mischen Sie für die Toxoplasma-Transfektion zwei Mikrogramm reparierter Template-DNA mit 20 Mikrogramm der einleitenden RNA Cas9-Expressionsplasmide und mischen Sie 400 Mikroliter Parasitenresuspension, DNA und fünf Mikroliter 200 Millimolar ATP 500 Millimolar reduziert Glutathion in einem 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr.
Fügen Sie cytomix Puffer hinzu, um das Gesamtvolumen bei Bedarf auf bis zu 500 Mikroliter zu erhöhen und die Parasiten-DNA-Mischung mit Elektroporationsküvette auf einen Vier-Millimeter-Spalt zu übertragen. Dann elektroporate die Parasiten bei zwei Kilovolt und 50 Ohm Widerstand. Um Knockout-Parasiten zu klonen, führen Sie zunächst eine zweistufige Verdünnung der Parasiten durch, um eine 10 Parasiten pro Milliliter D10-Medium zu erreichen, die mit der entsprechenden Antibiotikakonzentration ergänzt werden.
Als nächstes übertragen Sie 150 Mikroliter der resuspendierten gereinigten Parasiten auf jeden Brunnen einer 96-Well-Mikroplatte, die mit Vorhaut-Fibroblasten vorgesät ist, und bebrüten die Mikroplatte sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Am Ende der Inkubation die Brunnen mit einer einzigen Plaque identifizieren und 75 Mikroliter der resuspendedn Toxoplasma-infizierten menschlichen Vorhaut-Fibroblasten aus jedem Brunnen der 96-Well-Mikroplattenkultur in einzelne 1,5-Milliliter-Röhren übertragen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie die Pellets in 10,25 Mikroliter Lysepuffer mit Verdünnungspuffer in DNA-Freisetzungsadditiv wieder auf.
Dann inkubieren Sie die Proben für vier Minuten bei Raumtemperatur und zwei Minuten bei 98 Grad Celsius, bevor Sie PCR durchführen, um die Integration der Arzneimittelresistenzkassette und den Verlust des Gens von Interesse zu testen. Die Hemmungseffizienzen von LHVS und Wildtyp in Delta-CPL-Stämmen können bestimmt werden, indem ihre Luziferase-Aktivitäten gegen verschiedene Inhibitorkonzentrationen geplottet werden. Nach pcR wird das mutierte Plasmid linearisiert und zur Überprüfung einer erfolgreichen Amplifikation in ein 1%Agarose-Gel geladen.
Nach der Gelextraktion und Der E.coli-Transformation können die Klone, die die erwarteten Plasmide enthalten, durch Restriktionsendonukleaseverdauung in der DNA-Sequenzierung gescreent werden. Nach der Reparatur-Schabliflifikation kann die Agarose-Gelelektrophorese verwendet werden, um die richtige Größe des PCR-Produkts zu überprüfen. Im Allgemeinen werden sieben bis acht Klone für das erste Screening ausgewählt, um die Löschung der Codierungssequenz des gens von Interesse zu überprüfen, gefolgt von der Erkennung der fünf und drei Hauptarme, um die Gesamtzahl der zu überprüfenden Klone zu minimalisieren.
Eine weitere Überprüfung kann durch Immunoblotting abgeschlossen werden, wenn Antikörper zur Erkennung des Zielproteins verfügbar sind. Vor der Erlangung von Luziferase-Aktivitätsmessungen sollte eine klare Mikroplatte mit einer Mock-Infektion unter dem Mikroskop überprüft werden, um sicherzustellen, dass die Parasiten die Wirtszellen nicht vollständig lysieren.
