Die Autoren möchten die Kucenas Lab für wertvolle Diskussionen und Quorum Technologies, Inc. für hervorragende technische Unterstützung danken. Die Arbeit wurde von der UVa Fund for Excellence in Science and Technology (FEST) (SK) unterstützt.

1. Vorbereitung und Montage der Zebrafischembryonen für Ablation und Live-Imaging <ol><li> Bereiten Sie einen Vorrat von 0,8% niedrig schmelzende Agarose in Ei Wasser. Aliquot in 13X 100 mm Einwegglaskulturröhrchen und lagern bei 4 ° C bis zum Gebrauch. </li><li> Kreuz erwachsenen Zebrafisch mit stabil integriert Transgene fluoreszierend beschriften Motoneuronen und Gliazellen Arten von Interesse. Sammle Zebrafischembryonen in Ei und Wasser in 28,5 ° C Inkubator für richtige Inszenierung später 3. </li><li> Bei etwa 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF), zu entfernen Ei Wasser und fügen Sie 0,002% 1-Phenyl-2 Thioharnstoff (PTU) in Ei Wasser. Zurück Embryonen in den Inkubator. </li><li> Zwischen 24 und 96 HPF sollte Embryonen auf das Vorhandensein von gewünschten Transgene auf einem fluoreszierenden Binokular untersucht werden. Zeigen ausgewählt Embryonen in frischem Wasser und PTU Ei zurück in den Inkubator. </li><li> Als Larven haben 6 Tage nach der Befruchtung (DPF) (oder gewünschte Alter) erreicht, entfernen Sie sie aus dem InkubatorWählen Sie ein paar Larven für die Montage, und übertragen Sie sie auf einem kleineren Teller. </li><li> Entfernen Sie das Wasser aus der Schüssel und sofort mit etwa 0,02% Tricane ersetzen in PTU Ei Wasser. Erlauben Larven in Narkose sitzen ca. 5 min. </li><li> Einen aliquoten von 0,8% niedrig schmelzende Agarose in einem Becherglas mit Leitungswasser und Mikrowelle für 30 Sekunden oder bis die Agarose geschmolzen ist. Lassen Sie das Becherglas abkühlen, bis die Agarose in der Kultur Rohr fühlt lauwarmem im Griff (nicht heiß). </li><li> Wählen Sie einen betäubten Larve und überträgt es auf einem Single-oder Multi-well 35 mm Glasboden Gericht. Wasser, das sich mit der Larve übertragen wurde, dann sofort decken die Larve mit genügend warme Agarose den Glasboden-Teil der Schale zu füllen, aber nicht zu einer großen Kuppel. </li><li> Wie die Agarose erstarrt, verwenden Sie einen Präpariernadel die Larve auf seiner Seite an der Unterseite des Tellers platzieren, dann kippen die Larve nur leicht auf dem Rücken. Es ist zwingend notwendig für die Verletzung und die anschließende Bildgebung, dassdie Larve montiert berühren das Glas auf den Boden der Schale. Verwenden Sie die Präpariernadel die Larve in dieser Stellung zu halten, bis die Agarose erstarrt ist und die Larve immobilisiert ist. </li><li> Sobald die Agarose vollständig ausgehärtet ist, langsam pipettieren genug Tricane Wasser (es kann derselbe Tricane für Anästhesie verwendet werden) in die Schüssel vollständig zu bedecken und die Agarose Larve. </li></ol> 2. Laser Kalibrierung und Tests <ol><li> Schalten Sie alle konfokalen Mikroskop Instrumentierung, geeignete Diodenlaser für spannende Zebrafisch Transgene und der Stickstoff-gepumpten Farbstofflaser. Seien Sie sicher, dass das &quot;leere&quot; Strahlteiler in Kraft ist, ist die Laser-Dämpfer vollständig geöffnet ist, und die 435 nm Cumarinfarbstoff Zelle vorhanden ist. Auf dem Computer, öffnen Sie Bildbearbeitungs-Software. </li><li> Verschieben eines 63x 1.2NA Wasserimmersionsobjektiv in Position und wenden Sie einen kleinen Tropfen Wasser Immersionsmedium für Ziele auf dem Ziel. Ein 63x Ziel wird für gute Laserablation Genauigkeit und Wasser zu ermöglichen immersion ermöglicht einen größeren Arbeitsabstand, die notwendig ist, bei der Arbeit mit 6-7 dpf Zebrafischlarven. </li><li> Besorgen Sie sich einen Objektträger aus Glas mit einer gespiegelten Seite für die Kalibrierung des Lasers zu verwenden. Legen Sie den Objektträger, Spiegel nach unten auf dem Mikroskop Bühne. </li><li> Mit dem Okular unter Hellfeld, finden und konzentrieren sich auf einen Kratzer oder Ätzung in den Spiegel. Die Hellfeld werden shining Down auf dem Glasträger, aber nur bis zum Ziel passieren dort, wo der Spiegel verkratzt worden ist oder weggeätzt, was den Spiegel zu schauen durch das Okular schwarz, und die Radierungen wie Flecken aussehen oder Linien aus Licht. </li><li> Anzeigen und konzentrieren die Radierungen auf dem Computer-Bildschirm mit Imaging-Software. Öffnen Sie das Fenster, das die Laser-Kalibrierung und Energie-Einstellungen steuert. Legen Sie die Anzahl von Impulsen auf &quot;1&quot; und die Dämpfung Platte auf &quot;3&quot;% Transmission. Die Anzahl der Impulse die Anzahl der Male der Laser innerhalb einer Region von Interesse (RO abfeuertI) und die% Transmission für die Laserleistung. Achten Sie darauf, die richtige Einstellung für die Kalibrierung 63x 1.2NA Wasserimmersionsobjektiv ausgewählt ist. </li><li> Wählen Sie das Ellipse-Werkzeug aus der Werkzeugleiste und klicken Sie auf das Bild auf dem Bildschirm, um einen einzigen kreisförmigen ROI erstellen. Tun Sie dies 3 Mal, bis es 4 kreisförmige ROIs zufällig über das Bild verteilt sind. </li><li> Einige Systeme können eine Sicherheitsfunktion, die nicht zulassen, dass der Laser zu feuern, wenn der Lichtweg zu den Okularen ist offen. Wenn dies der Fall ist, manuell das Lichtweg zu den Okularen zu diesem Zeitpunkt. </li><li> Feuern des Lasers. Dies wird 4 kleinen Fleck Radierungen, 1 in jedem kreisförmigen ROI erstellen. Wenn der Laser nicht ausgelöst wird, überprüfen Sie, ob der Laser eingeschaltet ist und richtig angeschlossen, und daß der Lichtweg zu den Okularen wird geschlossen. Wenn die Laser feuert aber kein Ätzen gesehen wird, überprüfen Sie, ob die &quot;leere&quot; Strahlteiler ist vorhanden. Wenn alles an seinem Platz, erhöhen Sie die Laserleistung und &quot;frap&quot; bis zum Radierungen are sichtbar. Wenn ein Laserleistungseinstellung größer als 10 ist notwendig, zum Ätzen des Glases, kann dies auf der Laser-Plasma-Patrone ersetzt werden muss. </li><li> Wenn die geätzten Stellen zentriert innerhalb des ausgewählten ROIs erscheint, ist keine Kalibrierung notwendig (gehen Sie zu 2.12). Wenn diese Punkte nicht zentriert ist, muss die Einstellung der Kalibrierung aktualisiert werden. </li><li> So kalibrieren, klicken Sie auf das Update die Einstellung der Kalibrierung. Der Laser wird ausgelöst, und ein Bild erscheint mit einer einzigen geätzten Punktes. Wenn der Punkt nicht angezeigt wird, brechen Sie die Kalibrierung, erhöhen die Leistung des Lasers, und starten Sie die Kalibrierung erneut. </li><li> Klicken Sie in der Mitte des Spots. Der Laser wird wieder feuern, und ein weiterer Punkt erscheint. Klicken Sie auf diesen Punkt, und wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Kalibrierung abgeschlossen ist und 9 Punkte erscheinen in einem Raster Mode. Wiederholen Sie die Schritte 2,6-2,9 zu überprüfen, ob die Kalibrierung erfolgreich war. </li><li> Entfernen Sie den Objektträger aus dem Mikroskop Bühne und reinigen das Ziel. Öffnen Sie den Lichtweg zum oculars, und ersetzen Sie die &quot;leere&quot; Strahlteiler mit dem &quot;100% ILL&quot; Strahlteiler. </li></ol> 3. Nervendurchtrennung mit Laser Ablation und Zeitraffer-konfokale Bildgebung von Gliazellen Verhalten <ol><li> Entfernen Sie die Bühne verwendet, um die Objektträger aus Glas halten und ersetzen mit einer Bühne geeignet zur Aufnahme von 35 mm Glasboden Gerichte. Fahren Sie mit dem 63x 1.2NA Wasserimmersionsobjektiv verwenden. </li><li> Tragen Sie eine kleine Tropfen Wasser Immersionsmedium auf das Ziel, und die Schale mit montierten Larve auf der Bühne. Stabilisieren Sie das Gericht mit Clips. </li><li> Mit dem Okular und Weitfeld-Beleuchtung, konzentrieren die Larve und suchen Sie die motorischen Nerven. Scannen Sie die Nerven in hemisegments 10-20 und wählen Sie einen motorischen Nerv für Durchtrennung. </li><li> Bringen Sie eine Live-Ansicht des Nerven auf dem Computer-Bildschirm mit Imaging-Software. Wählen Sie Z-Ebenen und erwerben ein Bild der Axone und Gliazellen des unverletzten Nerven. </li><li> Bereiten Zeitraffer-Imaging-Einstellungen in der Imaging-Software zu erfassenZ-Projektionen aller Zelltypen in 5-30 min Abständen, je nach Experiment. Am besten ist es, alle notwendigen Einstellungen für die Zeitraffer vor der Durchführung der Ablation zu erstellen, so gibt es keine Verzögerung beim Starten der Zeitraffer einmal die Verletzung ist abgeschlossen. </li><li> Nehmen Sie die &quot;100% ILL&quot; Strahlteiler und ersetzen mit dem &quot;leeren&quot;. Schließen Sie den Lichtweg zu den Okulare. </li><li> Zurück zu den Live-Blick auf den Nerv. Verwenden Sie den entsprechenden Kanal, um die fluoreszierenden Axone, durchtrennt werden sehen. </li><li> Mit dem Ellipse-Werkzeug, erstellen Sie eine dünne elliptische ROI im Bereich abgetragen werden soll, dann erstellen Sie kleinere ROIs innerhalb der gewählten Region. </li><li> In dem Fenster, das die Laser-Einstellungen steuert, stellen Sie die Anzahl der Impulse auf &quot;2&quot; und die Dämpfung Platte &quot;18&quot;% Transmission. Feuern Sie die Laser innerhalb der ausgewählten ROIs. Wenn Fluoreszenz Überreste innerhalb der ROIs, erhöhen Sie die Laserleistung, warten Sie etwa 10 Sekunden, und feuern Sie den Laser wieder. Tun Sie dies, bis Sie eine Einstellung, die bewirkt, dass fluorescen erreichence innerhalb der ROIs verschwinden. </li><li> Warten Sie 10 oder mehr Sekunden und überprüfen Sie die abgetragene Fläche wieder für Fluoreszenz. Beachten Sie, dass ein ROI kann zunächst abgetragen, erscheinen, wenn es tatsächlich ist gebleicht. Wenn Fluoreszenz kehrt, erhöhen Sie die Laserleistung und feuern den Laser wieder. Wiederholen Sie dies, bis florescence verschwindet innerhalb der ROIs und nicht innerhalb von 10 Sekunden zurück. Am besten ist es mit einer geringeren Laserleistung beginnen und zu erhöhen, um die nötige Kraft. Die erforderliche Laserleistung auf einzelne Mikroskopen, Alter Coumarin-Farbstoff, Probenaufnahme, Alter der Larven, und die Dicke des Gewebes variieren. Sobald ein idealer Laserleistung festgelegt worden ist, kann diese Stufe wieder auf nachfolgende Nerven im gleichen Experiment verwendet werden. </li><li> Sobald die Ablation abgeschlossen ist, beginnen Zeitraffer-Bildgebung. </li><li> Wenn der Zeitraffer abgeschlossen ist, verwenden Imaging-Software, um Daten zu sammeln und zu erstellen Farbkomposit Z-Projektionen für jeden Zeitpunkt. Erstellen Sie einen QuickTime-Film, um das Verhalten zu analysierenvon Axonen und Gliazellen gleichzeitig. </li></ol>

<ol>
	<li>Geuna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3:+Histology+of+the+peripheral+nerve+and+changes+occurring+during+nerve+regeneration.">Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).</li><li>Hirata, K., Kawabuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+phagocytosis+by+macrophages+and+nonmacrophages+during+Wallerian+degeneration.">Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration.</a> Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development+of+the+Zebrafish.">Stages of Embryonic Development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning.">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137, 3985-3994 (2010).</li><li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos.">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).</li><li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB+signaling+directs+peripheral+nerve+regeneration+through+Sox2-dependent+Schwann+cell+sorting.">EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting.</a> Cell. 143, 145-155 (2010).</li><li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury.">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).</li><li>Stoll, G., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+injury,+axonal+degeneration+and+neural+regeneration:+basic+insights.">Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights.</a> Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).</li><li>Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types.">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Development. 7, 19 (2012).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+section+of+the+glossopharyngeal+and+hypoglossal+nerves+of+the+frog,+and+observations+of+the+alterations+pro-+duced+thereby+in+the+structure+of+their+primitive+fibres.">Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die wichtigsten Schritte des experimentellen Designs sind: 1) ordnungsgemäß Montage Larven für Verletzungen und anschließende in-vivo-Bildgebung und 2) die Kalibrierung des Lasers und die Auswahl der richtigen Energie-Einstellungen, um eine saubere Nervendurchtrennung schaffen, dass die Ergebnisse in minimal extra Gewebeschäden . Um eine erfolgreiche Axotomie für in-vivo-Bildgebung und die anschließende Analyse, montieren mehrere Larven entweder in einzelnen Petrischalen mit Glasboden oder in ei...

Zebrafisch wurden ausführlich die Entwicklung des Nervensystems aufgrund ihrer optischen Transparenz studieren und einfache Transgenese, die, wenn sie gekoppelt ist, für spektakuläre Darstellung von dynamischen Zelle Verhaltensweisen in einem lebenden Embryo erlauben verwendet. Darüber hinaus, da Zebrafisch und Säugetieren fast alle Gene für die Bildung des Nervensystems, zelluläre und molekulare Informationen in diesem Modell Organismus gesammelt erforderlich zu teilen, ist direkt zuordenbar anderen Wirbeltieren. Obwohl unglaublich mächtig für neuronale Entwicklungsstörungen Studien haben die Zebrafisch und seine einzigartigen Eigenschaften das Potenzial, auch Aufklärung der Mechanismen, die zu erhalten und den Wiederaufbau des Nervensystems nach Verletzung. Zebrafisch-Larven behalten ihre Lichtdurchlässigkeit in den späten Larvenstadien und Pigmentflecken können effektiv entweder mit dem Einsatz von pharmakologischen Inhibitoren der Melanin-Produktion oder genetische Mutanten, die Pigmentzellen fehlen gesperrt. So, mit diesem Modell Organismus studieren Verletzungen und Regeneration bei älteren Tieren ist möglich und bietet die einmalige Gelegenheit, direkt zu untersuchen, die zellulären und molekularen Mechanismen, die das Nervensystem wieder aufzubauen. In diesem Manuskript, beschreiben wir, wie man effizient und reproduzierbar verletzen Nerven im PNS von Zebrafisch-Larven. Diese Verletzung Paradigma eignet sich zur Untersuchung nicht nur Degeneration, sondern auch die Reaktionen von peripheren Gliazellen und Immunzellen sowie die Wechselwirkungen zwischen diesen Populationen während der Regeneration. Die PNS ist ein komplexes Netzwerk von motorischen und sensorischen Nerven, die erforderlich sind, um Information zwischen dem zentralen Nervensystem (CNS) und der Haut, Organe und Muskeln des Körpers vorbei ist, so dass ein Organismus mit seiner Umgebung zu interagieren und zu überleben. Entlang dieser Nerven, periphere Glia, einschließlich myelinisierenden und nicht myelinisierenden Schwann-Zellen und perineurale Glia sowie Bindegewebe umhüllen die Axone und bilden schließlich die reife Nervenzellen. Verletzung dieser Nerven initiiert einen Prozess known als Wallerdegeneration 10. Dieser Mechanismus der axonalen Fragmentierung, Immun-Rekrutierung, Schutt Clearance und Regeneration ist sehr stereotyp und genetisch reguliert 1. Frühere Studien in Säugersystemen haben die Rollen von Schwann-Zellen während Nervendegeneration und Regeneration 1, 2, 6, 8 beschrieben. In diesen Studien von fixiertem Gewebe oder Zellkultur, Schwann-Zellen nicht nur Makrophagen zum Ort der Verletzung in Schutt Zwischenraum unterstützen eingestellt, sondern auch in Myelin Phagozytose selbst unterstützt. Während diese Studien gewesen unglaublich informativ, wir haben noch nie zuvor visualisiert Gliazellen Reaktionen auf periphere Axon Verletzung in vivo in Echtzeit und keine andere Studien haben den Zusammenhang zwischen den verschiedenen Klassen der peripheren Gliazellen während dieser Ereignisse untersucht. In jüngster Zeit haben mehrere Labors Waller-Degeneration untersucht mit Zebrafisch und Laser-vermittelten Axon Verletzungen ähnlich dem, was wir hier beschreiben <sup&gt; 4, 5, 7, 9. In einigen dieser Studien wurden oberflächliche sensorischer Axone in jungen Larven mit einem speziell angefertigten, Zwei-Photonen-konfokalen Mikroskop 4, 5, 9 axotomisierten. In einer anderen Studie, die sehr ähnlich zu unserem eigenen ist, wurden tiefer Axone im ventralen motorischen Nerven in 5 Tage alten Larven mit einem handelsüblichen Laser-Ablation System 7 durchtrennt. In diesen beiden Versuchsanordnungen, lag der Schwerpunkt auf Waller-Degeneration und beide Axone und Immunzellen wurden abgebildet. Um auf diesen Studien erweitern beschreiben wir verletzen Motor Axone in älteren Larven mit reifer, myelinisierten Nerven und Test die Antwort aller Nerven-assoziierten peripheren Gliazellen während Degeneration und Regeneration. Um dies zu tun, wir durchschneiden motorischen Nerven in 6 und 7 Tage nach der Befruchtung (DPF) Larven und visualisieren die Reaktionen der einzelnen Gliazellen Populationen sowie untersuchen die Wechselwirkungen zwischen diesen Populationen entlang verletzten Axone. Mit Doppel-und Dreifach-transgenic Linien dieses Etikett peripheren Gliazellen, einschließlich Schwann-Zellen und Perineuralzellen Gliazellen, sowie als Marker für Axone, verwenden wir ein handelsübliches Laser-Ablation, bestehend aus einem Stickstoff-gepumpter Farbstofflaser (Wellenlänge 435 nm), die an einer sich drehenden Scheibe Konfokalsystem zu Axon Querschnitten erhalten erstellen. Dieser Versuchsaufbau erlaubt es uns, Live, Larven Zebrafisch visualisieren, zu verletzen spezifischen peripheren motorischen Axon Traktate und Zeitraffer-Bild die Antworten der verschiedenen Gliazellen Populationen Axon Verletzungen und ihre Beziehung zueinander. Dieses Protokoll kann weiter angepasst werden, um Nervenverletzungen im Zebrafisch unterschiedlichen Alters zu schaffen, mit verschiedenen transgenen Linien oder genetische Mutanten, verschiedene wissenschaftliche Fragen zu beantworten.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylthiourea</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7629-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222</td>
 <td>Argent Chemical</td>
 <td>C-FINQ-UE-100G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low melting point agarose</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9414-10G</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One</td>
 <td>VWR/Greiner</td>
 <td>89125-444</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick</td>
 <td>Willco Wells</td>
 <td><a href="http://www.willcowells.com/en/products/willco-dish-glass-bottom-dishes/gwst-3512/" target="_blank">GWSt-3512</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser System with all components</td>
 <td>Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc.</td>
 <td>2203-SYS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm)</td>
 <td>Andor Technology </td>
 <td>MP-27-435-DYE</td>
 </tr>
 <tr> </tr>
 </tbody>
 </table>

motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish

Das Nervensystem wird oft als fest verdrahtete Komponenten des Körpers beschrieben, obwohl es ein deutlich Fluid Organsystem, die auf äußere Reize in einem konsistenten, stereotype Weise reagiert wird, während eine unglaubliche Flexibilität und Plastizität. Anders als das zentrale Nervensystem (ZNS), ist das periphere Nervensystem (PNS), der bedeutende Reparatur, aber wir haben gerade erst begonnen, die zellulären und molekularen Mechanismen, die diesem Phänomen zu regieren verstehen. Mit Zebrafisch als Modellsystem, haben wir die einmalige Gelegenheit, Paar regenerative Studien mit in-vivo-Bildgebung und Genmanipulation. Periphere Nerven sind von Axonen durch Schichten von Glia-und Bindegewebe umgeben sind. Axone von myelinisierenden oder nicht myelinisierenden Schwann-Zellen, was wiederum zu einer fascicle durch eine zelluläre Mantel genannt Perineurium gewickelt sind umhüllt. Nach einer Verletzung, haben erwachsene peripheren Nerven die bemerkenswerte Fähigkeit, remove beschädigt axonal Schutt und re-innervieren Ziele. Um die Rollen aller peripheren Gliazellen in PNS Regeneration zu untersuchen, beschreiben wir hier ein Axon Durchtrennung Assay, einen handelsüblichen Stickstoff-gepumpten Farbstoff-Laser verwendet, um motorischen Nerven im Live-transgenen Zebrafisch axotomize. Weiterhin beschreiben wir die Methoden zu koppeln diese Experimente zu Zeitraffer-Aufnahmen von verletzten Nerven und Kontrolle. Diese experimentelle Paradigma kann verwendet werden, um nicht nur zu beurteilen, welche Rolle die Gliazellen spielen in Nervenregeneration, kann aber auch die Plattform für die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die das Nervensystem Reparatur regieren werden.

Die hier beschriebenen Assays können verwendet werden, um die Reaktion von Gliazellen und anderer Nerven-assoziierten Zellpopulationen axonale Verletzung in vivo zu bewerten. Film 1 zeigt ein Beispiel einer Nervenverletzung mit dieser Methode erstellt und die Reaktion der umgebenden Gliazellen. Dieses Experiment wurde in Tg durchgeführt (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed) Zebrafisch, in denen perineurale Glia eine Membran gezielt EGFP und Motoneuronen express cytosolischen d...

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Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Obwohl die peripheren Nervensystem (PNS) in der Lage ist signifikant Reparatur nach Verletzung, ist wenig über die zellulären und molekularen Mechanismen, die dieses Phänomen regeln bekannt. Mit Live-transgene Zebrafisch und einer reproduzierbaren Nervendurchtrennung Assay können wir dynamische Gliazellen Verhalten während Nerv Degeneration und Regeneration zu studieren.

Motor Nervendurchtrennung und Zeitraffer-Imaging von Gliazellen Verhalten im Live Zebrafisch

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

motor-nerve-transection-time-lapse-imaging-glial-cell-behaviors-live

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K Aufrufe.  University of Virginia. Obwohl die peripheren Nervensystem (PNS) in der Lage ist signifikant Reparatur nach Verletzung, ist wenig über die zellulären und molekularen Mechanismen, die dieses Phänomen regeln bekannt. Mit Live-transgene Zebrafisch und einer reproduzierbaren Nervendurchtrennung Assay können wir dynamische Gliazellen Verhalten während Nerv Degeneration und Regeneration zu studieren.

Serie: Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Viral vectors, plasmids or short interfering RNAs (siRNAs) can also be delivered to the vitreous chamber in order to infect or transfect retinal cells 5-12. The high tropism of Adeno-Associated Virus (AAV) vectors is beneficial to target RGCs, with an infection rate approaching 90% of cells near the injection site 6, 7, 13-15. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying siRNAs, plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 16-19 or injecting vectors into their target the superior colliculus 10. This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the injured neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. RGC apoptosis has a characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a window for experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis. Manipulations that directly target RGCs from the transected optic nerve stump are performed at the time of axotomy, immediately after cutting the nerve. In contrast, when substances are delivered via an intraocular route, they can be injected prior to surgery or within the first 3 days after surgery, preceding the initiation of apoptosis in axotomized RGCs. In the present article, we demonstrate several methods for experimental manipulations after optic nerve transection.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. This model is ideal for performing a number of experimental manipulations that target the retina globally or directly target the injured neuronal population of retinal ganglion cells.

Methoden für die experimentelle Manipulationen nach Optic Nerve Durchtrennung im Säuger-ZNS

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. The optic nerve can be ...

Forschung

Neurowissenschaften

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Langfristige Zeitraffer-Imaging von Maus Cochlear Explantate

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon guidance, has not been fully elucidated. This is partly due to technical limitations of traditional axon guidance assays. To identify additional axon guidance cues influencing the oculomotor nerve, an ex vivo slice assay to image the oculomotor nerve in real-time as it grows towards the eye was developed. E10.5 IslMN-GFP embryos are used to generate ex vivo slices by embedding them in agarose, slicing on a vibratome, then growing them in a microscope stage-top incubator with time-lapse photomicroscopy for 24-72 h. Control slices recapitulate the in vivo timing of outgrowth of axons from the nucleus to the orbit. Small molecule inhibitors or recombinant proteins can be added to the culture media to assess the role of different axon guidance pathways. This method has the advantages of maintaining more of the local microenvironment through which axons traverse, not axotomizing the growing axons, and assessing the axons at multiple points along their trajectory. It can also identify effects on specific subsets of axons. For example, inhibition of CXCR4 causes axons still within the midbrain to grow dorsally rather than ventrally, but axons that have already exited ventrally are not affected.

An ex vivo slice assay allows oculomotor nerve outgrowth to be imaged in real time. Slices are generated by embedding E10.5 IslMN:GFP embryos in agarose, slicing on a vibratome, and growing in a stage-top incubator. The role of axon guidance pathways is assessed by adding inhibitors to the culture media.

Ex Vivo Okulomotor Slice Culture von embryonalen GFP-ausdrückenden Mäusen für Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

3D Kinematische Analyse zur funktionellen Bewertung im Rattenmodell von Ischias-Nerven-Crush-Verletzungen

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

Zeitraffer Live Imaging und Quantifizierung der schnellen dendritischen Zweigdynamik bei der Entwicklung von Drosophila Neuronen

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Reinigung von Fibroblasten und Schwannzellen von sensorischen und motorischen Nerven in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...