Diese Arbeit wurde durch Auszeichnungen von HHMI 56006760 zu JDV, die National Institutes of Health (NIH) (2 TL1 RR 24158-6) zu dmaw, und aus der Ellison Medical Foundation (AG-SS-2465) und der NIH (GM45735 unterstützt, GM45735S1 und GM096445) auf LP. GM45735S1 wurde vom NIH im Rahmen des American Recovery and Reinvestment Act von 2009. Die Mikroskope für diesen Studien verwendet wurden zum Teil durch ein NIH / NCI Zuschuss (5 P30 CA13696) unterstützt.

1. Transformation von Hefezellen mit den Biosensoren <ol><li> Verwandeln Sie den gewünschten Hefestamm mit Plasmid Lager mito-roGFP oder mitGO-ATeam2 mit dem Lithiumacetatverfahren 27. </li><li> Zur Transformation mit dem Plasmid-borne Biosensor zu bestätigen und um den Verlust des Plasmids zu verhindern, auszuwählen und aufzubewahren Transformanten auf den entsprechenden selektiven synthetischen Vollmedium (SC-Ura für Mito-roGFP oder SC-Leu für mitGo-ATeam2). Wenn das fluoreszierende Sonde in einem anderen Plasmid als hier beschrieben subkloniert worden, verwenden Sie die entsprechende selektiven Medium. Visualisieren Transformanten mittels Fluoreszenzmikroskopie, um zu bestätigen, dass sie die fluoreszierenden Biosensor ausdrücken und zeigen normale mitochondriale Morphologie. </li></ol> 2. Wachstum von Zellen und Vorbereitung für den Imaging Zellfunktion und Ansprechen auf medikamentöse Behandlung sind stark abhängig von der Zelldichte und Stoffwechselaktivität. Die besten Ergebnisse werden erhalten, wenn die Zellenaktiv Teilen (mid-log-Phase, ~ 0.5 - 1 x 10 7 Zellen / ml). Der zuverlässigste Weg bis zur mittleren logarithmischen Phase Kulturen gleichmäßige Dichte zu erzeugen, ist von einer stationären Phase pre-Kultur zu impfen. <ol><li> Bereiten Sie einen stationären Phase Vorkultur: wählen Sie eine einzelne Kolonie von transformierten Zellen von einem Teller und impfen selektiven flüssigen Medien (5 ml in einem 50 ml konischen Boden-Rohr). Wachsen bei 30 ° C unter Schütteln bei 225 rpm, bis die optische Dichte der Kultur bei 600 nm (OD 600) ein Plateau (24-48 h) erreicht hat. </li><li> Bereiten Sie eine mid-log-Phase Kultur für die Beobachtung: verwenden Sie die entsprechende Volumen Vorkultur bis 5 ml selektives Medium in einem 50 ml konischen Röhrchen-bottom impfen. YPD Medien autofluoreszierenden und sollte nicht für diese Studien eingesetzt werden. Verwenden synthetische vollständige, Glucose basiert, Dropout (SC-Ura) Medien. Wachsen Zellen bei 30 ° C, Schütteln bei 225 rpm für 4-16 h, bis sie Mitte der log-Phase (~ 0.5 - 1 x 10 7 Zellen / ml) zu erreichen. Die Zelldichte bestimmt werdendurch Messung OD 600; kalibrieren Spektralphotometer, um die korrekte Lesung OD 600 zu bestimmen. Auf unserer Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN), entspricht mid-log-Phase bis zu einer OD 600 von 0,1-0,3. </li></ol> Mito-roGFP1 Sinne Schwankungen in der Organellen in Reaktion auf metabolische Veränderungen. Zum Beispiel wird in diesem Assay mitochondrialen Redox-Zustand ändert, wenn Hefe auf fermentierbaren Kohlenstoffquellen (zB Glucose, wie in SC-Medien) im Vergleich zu nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquellen (zB Glycerin, wie in SGlyc Medien) wachsen, und sogar in verschiedenen Chargen des gleichen Medien. Daher verwenden die gleiche Charge von Medien für alle Experimente. <ol start="3"><li> Zellen bereit für die Konzentration (siehe Schritt 2.4) und Bildgebung, wenn keine Behandlung durchgeführt wird. Wenn Zellen behandelt werden, inkubieren Zellen mit der entsprechenden Behandlung und fahren Sie mit dem nächsten Schritt. </li><li> Konzentrat 1 ml Kultur durch Zentrifugation bei 6.000 xg für 15 sec undResuspension des Zellpellets in 20 ul Medien. Diese Bedingungen zur Maximierung der Anzahl der unterscheidbaren Zellen im Blickfeld. </li><li> Tragen Sie 2 ul der resuspendierten Zellen auf einen Objektträger. Deckel mit einem Deckglas (Nr. 1,5, vorzugsweise High-Performance 170 ± 5 um Dicke), und die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack oder valap (siehe Reagenzien). Um mit valap versiegeln, schmelzen Sie eine kleine Menge auf einem Metall-Spatel, indem es über einen Bunsenbrenner, dann können Sie ein wenig an den Rändern des Deckglases. </li><li> Pflegen Zellen bei 30 ° C während der Bildgebung. Ein Ziel Heizer an den 100x Ölimmersionslinse zur Abbildung funktioniert gut für diese Anwendung. Unter diesen Bedingungen bleiben Mitochondrienmorphologie, Redox-Zustand und ATP-Spiegel während der Bildgebung für 10-15 min unverändert. </li></ol> 3. Imaging-Setup <ol><li> Setup for Imaging mito-roGFP1 auf einer Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop Die Schritte werden hier zum AxioObse zugeschnittenrver.Z1 Mikroskop mit einer Colibri LED Erregungsquelle, einem Weitwinkel-Kamera und Orca ER Axiovision Erwerb Software ausgestattet. Photobleaching beider Kanäle und Photokonversion oxidiert mito-roGFP1 deutlich mit LED-Beleuchtung im Vergleich zu Quecksilberbogenlampe Beleuchtung (siehe unten) reduziert. Um Signal und Auflösung zu maximieren, verwenden Sie die höchste numerische Apertur möglich in das Ziel und die niedrigste Vergrößerung für die ausreichende räumliche Auflösung bietet. Darüber hinaus ist für mito-roGFP Bildgebung, sicherzustellen, dass das Ziel auch bei 365 nm überträgt. Die 100x/1.3NA EG PlanNeofluar Objektiv (Zeiss) funktioniert gut für diese Anwendung. Konfigurieren Sie die Software, um die Übernahme oxidierten und reduzierten mito-roGFP1 Arten zu erfassen. Wir verwenden die folgenden Bedingungen. <ol><li> Konfigurieren Sie den Kanal für oxidierte mito-roGFP der Anregung bei 365 nm (100% LED-Leistung) und einer Emission Filter geeignet für GFP, wie der 38 HE Filter Set (Zeiss) verwenden, mit dem mitgelieferten excitation-Filter aus dem Cube entfernt. Entfernen der Anregungsfilter ermöglicht Anregung bei 365 nm und sowohl 470 nm, ohne dass Filter wechseln, wodurch erreichbar Zeitauflösung. </li><li> Konfigurieren Sie den Kanal für reduzierte mito-roGFP auf Anregung bei 470 nm (100% Leistung LED) nutzen und, wie oben erwähnt, das gleiche Emissionsfilters Würfel für die oxidierte mito-roGFP verwendet. Stellen Sie die Kamera auf 1x1 Binning auf räumliche Auflösung zu optimieren. </li><li> Set Software az Stapel bestehend aus 11 Scheiben mit 0,5 um Abstand, sammeln beide Kanäle an jeder z-Position zu erwerben. Diese Art der Erfassung ist langsamer als der Erwerb jedes z Stapel wiederum, aber es verhindert Artefakte aus mitochondrialen Bewegung zwischen Erwerb der oxidierten und reduzierten Kanäle. </li><li> Bild mehrere Zellen zu bestimmen, eine geeignete Belichtungszeit, die Erzeugung eines starken, aber nicht sättigenden Signals. Es ist wichtig, das Verhältnis der Belichtungszeiten für oxidierten und reduzierten Mito-roGFP1 für alle Experiment erhaltens. Zum Beispiel sollte, wenn die Belichtungszeiten für oxidierten und reduzierten mito-roGFP1 sind 300 und 100 ms, bzw. dann die Belichtungszeit für oxidierte mito-roGFP1 3 mal sein, dass für reduzierte mito-roGFP für alle Experimente. </li></ol></li><li> Setup for Imaging mitGO-ATeam2 auf einer spektralen konfokalen Mikroskop Um ATP-Spiegel mit mitGO-ATeam2, die Fluoreszenz von GFP (Emissionsmaximum 510 nm) zu quantifizieren müssen aus, dass von OFP (Emissionsmaximum 560 nm) unterschieden werden. Es gibt Fluoreszenzfilter Sätze, die die Fluoreszenz von diesen Fluorophoren emittierte lösen. Allerdings finden wir, dass eine spektrale Detektor, auf vielen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskope, funktioniert am besten für diese Anwendung. Eine spektrale Detektor trennt die Fluoreszenzemission in viele Komponenten (typischerweise 32 oder mehr) entsprechend der Wellenlänge. Mehrere benachbarte Wellenlängenbändern kann in einem Bild Kanal kombiniert werden. Die Wellenlängen kombiniert werden empirisch so Signals von G maximiert wirdFP und OFP bei gleichzeitiger Vermeidung von Crossover-Signal, das würde beschämen die FRET-Messung. Verwenden Sie die höchste numerische Apertur Objektiv zur Verfügung. Wir verwenden eine 100x/1.49 oder 60x/1.49 Apo-TIRF Objektiv. Wir verwenden die Nikon A1R konfokalen Mikroskop NIS Elements Software. Konfigurieren Sie die Software, um die Übernahme ATP-gebundenen und ungebundenen ATP-mitGO-ATeam2 Arten zu erfassen. Wir verwenden die folgenden Bedingungen. <ol><li> Set Lochkamera bis 1,0 Airy-Einheiten (AU), die auf unserem System entspricht az Auflösung von etwa 0,42 um. </li><li> Set Scan Zoom, um die Nyquist Grenze, die räumliche Information in das Bild zu maximieren nähern. Auf unserem System die Pixelgröße beträgt 0,12 um. </li><li> Weil Mitochondrien während der Bildgebung bewegen kann, kann es hilfreich sein, Imaging Geschwindigkeit durch Beschneiden des Feldes zu 512 x 256 Pixel erhöhen. Die gesamte Zeit benötigt, um Bilder einzeln in unserem System beträgt 1,0 sec, darunter ein 2-fach-Scan Durchschnitt. Je nach gewünschten räumlichen Auflösung kann das Feld weiter zuneh beschnitten werdene Zeitauflösung. </li><li> Excite bei 488 nm, und sammeln Emission 500-520 nm für GFP, und 550 bis 580 nm für OFP. Tatsächliche optimalen Werte können mit Merkmalen des bildgebenden Systems variieren. </li><li> Die optimale Laserleistung für unser System ist zwischen 6,0 und 6,4%. Die optimale Laserleistung für jede Mikroskopsystem variieren, aber wird idealerweise so niedrig wie möglich und dabei dennoch eine interpretierbare Bild. Eine interne oder externe Leistungsmesser Änderungen der Laserleistung, welche normalerweise im Laufe der Zeit in einem optischen System zu überwachen. </li><li> Stellen-Verstärkung und Beleuchtungslichtintensität um den erfassten Bereich von Pixelwerten zu maximieren aber vermeiden Sättigung des Signals, so viele Zellen wie möglich. Nicht analysieren alle Zellen mit mehr als 1% gesättigten Pixel. Bild alle Proben mit dem gleichen Ziel, Laserleistung, Scan Zoom, Pixelgröße, Gain und Offset. </li></ol></li></ol> 4. Image Acquisition <ol><li> Suchen Sie den Schwerpunkt pla<html> ne von Zellen von Interesse mit Durchlicht zu minimieren Bleichen der fluoreszierenden Sonde. </li><li> Nach dem Auffinden einer oder mehrerer Zellen von Interesse, muss eine z-Reihe durch die gesamte Tiefe einer typischen Zelle (ca. 7 um) mit einer Schrittweite von 0,5 um. </li><li> Bild anderen Zellen von Interesse auf der Folie, aber nicht ein einziges Bild Rutsche für länger als 15 min. Nach 15 min auf der Folie, verlieren Zellen Lebensfähigkeit. </li></ol> 5. Analyse Mitochondriale ATP-Ebene wird durch die Messung des Verhältnisses der mitGO-ATeam2 Emission bei 560 nm zu der bei 510 nm bestimmt 27 Die Redox-Zustand der Organellen als oxidiert (R / O)-Verhältnis von Mito-roGFP reduziert gemessen wird;. Dh Emission bei 510 nm nach Anregung bei 470 nm Emission bei 510 nm nach Anregung bei 365 nm unterteilt. Vor der Berechnung des Verhältnisses, subtrahieren wir Hintergrund und Bestimmen eines Schwellenwertes für Pixel, die zu der fluoreszierenden Mitochondrien. Zelt &quot;&gt; Public Domain (zB ImageJ 30) oder im Handel erhältlich (z. B. Volocity, Perkin-Elmer) Software für die Analyse von Mito-roGFP1 oder mitGO-ATeam2. Je nach Software für die Bildaufnahme verwendet und für die Analyse verwendet werden können, werden die Bilder können müssen zunächst in ein anderes Format umgewandelt werden, wie z. B. TIFF, vor dem Öffnen in der Analyse-Software. Werden Bilder umgewandelt werden, ist es wichtig zu überprüfen, ob Pixelwerte nicht während der Konvertierung geändert. Analyse der mito-roGFP1 Daten mit beide Programme ist unten beschrieben. Die Programm-Menüs und Optionen innerhalb jedes Menü in fett und kursiv hervorgehoben. 5.1 ImageJ Analyse <ol><li> Öffnen von Bildern und Art der Änderung auf 32-Bit: Bild → Typ → 32 bit. </li><li> Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) in einem Gebiet, wo es keine Zellen. Berechnen Sie die mittlere Intensität in dieser ROI: Analysieren → Messen. </li><li> Subtrahieren Sie die berechnete Mittelwert Hintergrund aus dem Stapel: Prozess → Math → Subtrahieren. </li><li> Mit dem Z-Stapel abgezogen, um den mittleren Scheibe und die Schwelle von Mitochondrien: Bild → Einstellen → Threshold und klicken Sie an der Schwelle Fenster auf Übernehmen. Auf alle Scheiben in dem Stapel. Prüfen Set Hintergrund Pixel auf NaN. </li><li> Erstellen Sie das Verhältnis z Stapel: Prozess → Bild Calculator Teilen Sie die reduzierten Stapel durch den oxidierten für Z-Stapel für mito-roGFP1 Analyse. Teilen Sie die 560 nm (ATP gebundenen) Bild von den 510 nm (ATP ungebundenen) für mitGO-ATeam2 Analyse. </li><li> Zeichnen Sie eine ROI um den Bereich von Interesse. Wählen Analysieren → Extras → ROI-Manager, und klicken Sie auf Hinzufügen, um den ROI aufzeichnen. Mehrere Bereiche können im Manager gespeichert werden. In ROI-Manager, wählen Sie alle ROIs, dann wählen Sie MErz → Multi-Measure, um alle Stapel Scheiben zu messen. Exportieren von Daten in eine Tabellenkalkulation für die Analyse. </li></ol> 5.2 Volocity Analyse <ol><li> Importieren von Bildern in einem Volocity Bibliothek und erstellen Sie eine Bildsequenz mit 2 Kanälen. </li><li> Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) in einem Gebiet, wo es keine Zellen. Wählen Sie: Extras → Verhältnis. </li><li> Verwenden Volocity, um den Hintergrund zu berechnen: Holen Von ROI. </li><li> Stellen Sie die Schwelle zur mitochondrialen Strukturen umfassen. </li><li> Aktivieren Sie die Option, um einen Regenbogen LUT dem Verhältnis Kanal anwenden. Die intensitätsmoduliert Kanal kann einen weniger laut Bild für Präsentations-, aber es sollte nicht zur Quantifizierung der durchschnittlichen Verhältnis verwendet werden. </li><li> Wählen Sie die Registerkarte Messung, wählen Sie das Verhältnis Kanal und ziehen eine ROI um den Bereich von Interesse. Messen Sie den Kanal-Verhältnis, ohne Null-Werte. Mehrere Bereiche können ausgewählt und gemessen werdengleichzeitig. Exportieren von Daten in eine Tabellenkalkulation für die Analyse. </li></ol>

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	<li>Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+as+sensors+and+regulators+of+calcium+signalling.">Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling.</a> Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+quality+control+during+inheritance+is+associated+with+lifespan+and+mother-daughter+age+asymmetry+in+budding+yeast.">Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast.</a> Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).</li><li>Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+oxidative+damage+to+DNA+increase+with+age.">Does oxidative damage to DNA increase with age.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).</li><li>Cadenas, E., Davies, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+free+radical+generation,+oxidative+stress,+and+aging.">Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 29 (3-4), 222 (2000).</li><li>Mammucari, C., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+mitochondrial+dysfunction+and+aging.">Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).</li><li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases.">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li><li>Schon, E. A., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+the+next+(neurode)generation.">Mitochondria: the next (neurode)generation.</a> Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).</li><li>Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -. K., Hirst, J., Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+glutathionylation+of+complex+I+increases+mitochondrial+superoxide+formation.">Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).</li><li>Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutaredoxin+2+catalyzes+the+reversible+oxidation+and+glutathionylation+of+mitochondrial+membrane+thiol+proteins:+implications+for+mitochondrial+redox+regulation+and+antioxidant+defense.">Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).</li><li>Tretter, L., Adam-Vizi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Krebs+cycle+enzymes+by+hydrogen+peroxide:+A+key+role+of+[alpha]-ketoglutarate+dehydrogenase+in+limiting+NADH+production+under+oxidative+stress.">Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).</li><li>Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+mitochondrial+function+by+hydrogen+peroxide.">Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).</li><li>Gardner, P. R., Fridovich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+glutathione+on+aconitase+in+Escherichia+coli.">Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).</li><li>Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+radical+and+iron+modulate+aconitase+activity+in+mammalian+cells.">Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).</li><li>Schafer, F., Buettner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+environment+of+the+cell+as+viewed+through+the+redox+state+of+the+glutathione+disulfide/glutathione+couple.">Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).</li><li>Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+monitoring+of+ATP+levels+in+living+insulin+secreting+cells+expressing+cytosolic+firefly+luciferase.">Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase.</a> FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).</li><li>Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ATP+synthesis+in+permeabilized+cells:+Assessment+of+the+ATP/O+values+in+situ.">Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ.</a> Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).</li><li>Strehler, B. L., Totter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luminescence+in+the+study+of+energy+transfer+mechanism+in+substrates+and+enzymes+determinations.">Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations.</a> Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).</li><li>Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphate:+Continuous+measurement+in+mitochondrial+suspension+by+firefly+luciferase+luminescence.">Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).</li><li>Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+method+for+measuring+ATP+formation+in+rat+muscle+mitochondria.">A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).</li><li>Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A., Pon, L. A., Schon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+Mitochondrial+ATP+Synthesis+in+Animal+Cells.">Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells.</a> Methods in Cell Biology, Mitochondria. 65, 133-145 (2001).</li><li>DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase.">Firefly luciferase.</a> Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).</li><li>Atamna, H., Frey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mitochondrial+dysfunction+and+energy+deficiency+in+Alzheimer's+disease.">Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease.</a> Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).</li><li>Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+mitochondrial+redox+potential+with+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+indicators.">Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).</li><li>Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dynamic+redox+changes+in+mammalian+cells+with+green+fluorescent+protein+indicators.">Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators.</a> J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).</li><li>Schwarzl&#228;nder, M., Fricker, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+glutathione+redox+potential+in+living+plant+cells.">Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells.</a> Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).</li><li>Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++regulation+of+mitochondrial+ATP+synthesis+visualized+at+the+single+cell+level.">Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).</li><li>Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+reporter+of+ATP:ADP+Ratio.">A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio.</a> Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+yeast+by+lithium+acetate/single-stranded+carrier+DNA/polyethylene+glycol+method.">Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method.</a> Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Dairaku, N., Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomycin+and+antimycin+A+prevent+nitric+oxide-induced+apoptosis+by+blocking+cytochrome+c+leakage.">Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage.</a> J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).</li><li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-engineering+redox-sensitive+green+fluorescent+protein+for+improved+response+rate.">Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate.</a> Protein Sci. , 45-57 (2006).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Hier beschreiben wir Methoden, um mito-roGFP1 und mitGO-ATeam2 als Biosensoren nutzen zu mitochondrialen Redox-Zustand und ATP-Spiegel in lebenden Hefezellen zu beurteilen. Wir finden, dass die Expression von Plasmid-borne mito-roGFP1 oder mitGO-ATeam Ergebnisse in quantitativer Ausrichtung auf Mitochondrien, ohne offensichtliche Wirkung auf die mitochondriale Morphologie oder die Verbreitung oder auf zellulären Wachstumsraten. 3 Mito-roGFP1 können Änderungen in der mitochondrialen Redox-Zustand von stark ...

Mitochondrien sind Organellen wichtig für die ATP-Produktion, Biosynthese von Aminosäuren, Fettsäuren, Häm, Eisen-Schwefel-Clustern und Pyrimidine. Mitochondrien spielen auch eine entscheidende Rolle bei Calcium-Homöostase, und in der Regulation der Apoptose. 1 Zunehmende Anzeichen Links Mitochondrien Altern und altersbedingte Krankheiten wie Parkinson, Alzheimer, Amyotrophe Lateralsklerose und Huntington-Krankheit. 2 Während Einzelpersonen ihr ganzes Leben leben Mutationen in mitochondrialer Proteine, die mit neurodegenerativen Erkrankungen assoziiert sind, treten die Krankheitssymptome erst im späteren Leben. Dies deutet darauf hin, dass Veränderungen in den Mitochondrien mit zunehmendem Alter, die Krankheit Pathologie entstehen lassen. Tatsächlich mitochondrialen Fitness mit insgesamt Zelle Gesundheit und Lebensdauer in Hefe-und Säugerzellen korreliert ist. 3,4 Hier beschreiben wir, wie man genetisch kodierten, ratiometrischen Fluoreszenzbiosensoren verwenden, um zwei kritische Merkmale Mitoc beurteilenhondria in lebenden Hefezellen: Redox-Zustand und ATP-Spiegel. Funktion der Mitochondrien bei der aeroben Energie Mobilisierung ist gut etabliert. Mitochondrialen Redox-Zustand ist ein Produkt der reduzierenden und oxidierenden Spezies in der Organelle, wie NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, Glutathion / Glutathion-disulfid (GSH / GSSG) und reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Uncoupling Mitochondrien oder Hypoxie beeinflusst mitochondrialen Atmungskette Aktivität und verändert das Verhältnis von NAD + zu NADH in der Organellen. ROS, die durch ineffiziente Elektronentransfer zwischen Komplexe der Atmungskette in der inneren mitochondrialen Membran, sowie von der Desaminierung von Aminen über Monoaminoxidase in der äußeren mitochondrialen Membran 5 Schaden Lipide, Proteine ​​und Nukleinsäuren hergestellt werden und wurde zum Altern und altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen 6,7,8 verknüpft. ROS spielen auch eine Rolle bei der Signaltransduktion in mitochondria, durch Oxidation von GSH. Zum Beispiel, NADH-Dehydrogenase trägt nicht nur zur ROS-Produktion, sondern auch durch Wechselwirkungen mit der Glutathion-Pool 9,10 geregelt. α-Ketoglutarat-Dehydrogenase und Aconitase, Komponenten des TCA-Zyklus, zeigen reduzierte Aktivität in oxidierenden Umgebungen 11,12. Tatsächlich ist Redox-abhängige Regulation der Aconitaseaktivität von Bakterien bis zu Säugetieren 13,14 konserviert. So, die Überwachung der Redox-Zustand und ATP-Konzentrationen von Mitochondrien ist entscheidend für das Verständnis ihrer Funktion und Rolle in Pathologie. Biochemische Methoden wurden verwendet, um das Redox-Zustand oder ATP-Spiegel von ganzen Zellen oder isolierten Mitochondrien beurteilen. Weit verbreitet Methoden, um die Redox-Zustand von ganzen Zellen oder beurteilen isolierten Mitochondrien sind auf der Messung der Werte des Redoxpaares GSH / GSSG 15 basiert. Das Luciferin-Luciferase-System wird häufig verwendet, um zu messen mitochondrialenATP-Spiegel entweder in permeabilisierten ganzen Zellen oder isolierten Mitochondrien. 16,17,18,19,20 In diesem Assay bindet Luciferase und ATP katalysiert die Oxidation von Luciferin und Chemilumineszenz. 21 die Intensität des emittierten Lichts ist proportional zu der Menge von ATP in der Reaktionsmischung. 22 Diese Methoden wurden grundlegende Informationen zur mitochondrialen Funktion, einschließlich der Feststellung, dass Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit, abnormal niedrigen ATP-Spiegel haben gezeigt. 23 sie jedoch nicht verwendet werden, um Aufnahmen von lebenden, intakten Zellen werden. Darüber hinaus bieten Methoden Ganzzell-Analyse einen Durchschnitt von Redox-Zustand oder ATP-Spiegel in allen Kammern der Zelle. Messungen in isolierten Organellen sind potentiell problematisch, weil mitochondrialen Redox-Zustand oder ATP-Spiegel während der subzellulären Fraktionierung ändern kann. Schließlich zeigen neuere Studien aus unserem Labor und andere, dieMitochondrien innerhalb der einzelnen Zellen sind in ihrer Funktion heterogen, was sich wiederum auf die Lebensdauer von Mutter und Tochter-Zellen. 3 So gibt es eine Notwendigkeit, mitochondriale ATP-Spiegel und Redox-Status in lebenden Zellen mit subzellulären Auflösung zu messen. Die Biosensoren für die Funktion der Mitochondrien hier beschrieben werden sowohl auf Basis von GFP. Redox-sensitive GFP (roGFP) 24,25 ist eine GFP-Variante, in der Oberflächen-exponierten Cysteine ​​an das Molekül angefügt werden. roGFP wie Wildtyp-GFP, zwei Anregung Peaks (bei ~ 400 nm und ~ 480 nm) und ein Emissionsmaximum bei ca. 510 nm liegt. Oxidation der Cysteinreste in roGFP führt zu einer Erhöhung der Erregung bei ~ 400 nm. Reduction dieser Cysteine ​​begünstigt Anregung bei ~ 480 nm. Somit zeigt das Verhältnis von 510 nm Emission bei Anregung roGFP bei 480 nm und 400 nm die relative Menge von reduziertem und oxidiertem roGFP, die die Redox-Zustand des Fluorophors der Umgebung reflektiert. Zwei versIonen roGFP sind weit verbreitet: roGFP1 und roGFP2. Sowohl die gleichen Cystein Insertionen. roGFP1 auf Wildtyp-GFP und roGFP2 basierend auf S65T-GFP, die eine effizientere Anregung bei 480 nm hat und weniger effiziente Anregung bei 400 nm im Vergleich zu wtGFP 24 basiert. roGFP1 ist weniger empfindlich als pH roGFP2 und seine Dynamikbereich erstreckt sich weiter in die reduzierte Reichweite. So kann roGFP1 mehr nützlich für die Überwachung stärker reduzierenden Kompartimente wie Mitochondrien oder das Cytosol und Fächer mit variablen pH-Wert, wie Endosomen. roGFP2 bietet heller Signal und, in einigen Studien eine größere Dynamik als roGFP1 24,26. Studies in Arabidopsis thaliana zeigen, dass die Zeit für das Ansprechen auf Änderungen in Redox-Zustand erforderlich ist ähnlich für beide Sensoren (t ½ für die Oxidation, 65 und 95 sec und t ½ für die Reduktion, 272 und 206 sec für roGFP1 und roGFP2 bezeichnet) ist. 26 MitGO-ATeam2 ist eine minimal-invasive, sichereSensor, der mitochondrialen ATP-Maßnahmen in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam ist ein Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Sonde, die der ε-Untereinheit des F o F 1-ATP-Synthase besteht die zwischen FRET-Donor und Akzeptor fluoreszierende Proteine ​​(GFP und orange fluoreszierenden Protein (OFP), respectively). 27 Bindung von ATP an der ε-Untereinheit führt zu Konformationsänderungen in dem Protein, das die FRET-Donor bringen in enger Nähe zu dem Akzeptor und damit für Energieübertragung vom Donator zum Akzeptor. Es gibt zwei Varianten von GO-ATeam, GO-GO-ATeam1 und ATeam2. GO-ATeam2 hat eine höhere Affinität für MgATP als GO-ATeam1, so dass es für die Messung der in der Regel niedriger [ATP] in den Mitochondrien im Vergleich zum Cytosol. 27 Um mitochondrialen Redox-Zustand untersuchen, konstruierten wir ein Fusionsprotein (mito-roGFP1), bestehend aus roGFP1 fusioniert mit dem ATP9 Leader-Sequenz einnd ausgedrückt aus einer Zentromer-basierte (low copy number) Hefe-Expressionsplasmid unter Kontrolle des starken Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GPD) Promotor (p416GPD, Addgene). Wir verwendeten roGFP1 die Redox-Status von Mitochondrien in zunehmender Alterung des Modells Pilz Saccharomyces cerevisiae sondieren. Wir finden, dass roGFP1 können Veränderungen in der mitochondrialen Redox-Zustand, während des Alterns und in Reaktion auf die Verfügbarkeit von Nährstoffen auftreten, aber keinen offensichtlichen nachteiligen Effekt auf die Hefe-Zellen zu detektieren. Wir sehen auch, Variabilität in der Redox-Zustand der Mitochondrien innerhalb der einzelnen lebenden Hefezellen, ein Befund, der die Bedeutung eines Biosensors mit subzelluläre räumliche Auflösung unterstreicht. MitGO-ATeam2 ist eine Variante des GO-ATeam2, die die mitochondriale Signalsequenz von Cytochrom c Oxidase Untereinheit VIIIA am Aminoterminus von GO-ATeam2 eingesetzt ist. 27 Wir modifizierten die mitGO-ATeam2 Sonde (freundlicherweise vom Labor bereitgestellt H. Noji, Institut of Scientific and Industrial Research, Osaka University, Japan) zur Verwendung in Hefe durch Subklonierung es über Xba1 und HindIII in den Hefe-Expressionsvektor pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, USA), ein low-copy Plasmid mit dem starken konstitutiven GPD-Promotors. Wir drückten mitGO-ATeam2 in Bäckerhefe, und finden Sie durch Gegenfärbung mit dem DNA-bindenden Farbstoff DAPI, dass es lokalisiert ausschließlich auf Mitochondrien, wo es als ein effektives Sonde zu physiologischen Veränderungen in der mitochondrialen ATP-Spiegel zu messen. roGFP und GO-ATeam sowohl genetisch codiert. Als Ergebnis können sie eingeführt und stabil beibehalten in intakten Zellen, und Informationen über Redox-Zustand oder ATP-Spiegel in einzelnen lebenden Zellen. Darüber hinaus überwachen beide Biosensoren Änderungen in Redox-Zustand oder ATP-Spiegel, die auftreten, unter physiologischen Bedingungen. 28. Beide Sonden sind auch ratiometrischen. Als Ergebnis werden die Messungen mit diesen Fühlern aus nicht schwiernges in Biosensor Konzentration oder Probenbeleuchtung oder Dicke. Schließlich bieten beide Biosensoren subzelluläre räumliche Auflösung. Tatsächlich roGFP auf Mitochondrien, ER wurde gezielt Endosomen und Peroxisomen 24 und kann Änderungen in Redox-Zustand von jedem dieser Organellen, weitgehend unabhängig vom pH erkennen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>1397-94-0</td>
			<td>Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. 
			 
			Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glycerol 
			0.05% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura 
			**omit for SGlyc-Leu</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 
			0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 
			3% Glucose 
			2 mg/ml adenine 
			2 mg/ml uracil* 
			1 mg/ml L-arginine 
			1 mg/ml L-histidine 
			1 mg/ml L-leucine** 
			3 mg/ml L-lysine 
			2 mg/ml L-methionine 
			4 mg/ml L-phenylalanine 
			2 mg/ml L-tryptophan 
			3 mg/ml L-tyrosine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valap</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 &deg;C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: 
			Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipment and Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides</td>
			<td>Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)</td>
			<td>3050</td>
			<td>Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY)</td>
			<td>474030-9000-000</td>
			<td>These are less variable in thickness (170&plusmn;5 &mu;m) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5</td>
			<td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)</td>
			<td>12-545E</td>
			<td>Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 &mu;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective</td>
			<td>Nikon (Melville, NY)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software</td>
			<td>Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 3D Image Analysis software</td>
			<td>Perkin Elmer (Waltham, MA)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health (Bethesda, MD)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ratiometric biosensors that measure mitochondrial redox state and atp in living yeast cells

Mitochondrien haben Rollen in vielen zellulären Prozessen, von Energiestoffwechsel und Calcium-Homöostase auf zellulärer Lebensdauer und den programmierten Zelltod steuern. Diese Vorgänge beeinflussen und werden durch die Redox-Status und die ATP-Produktion durch Mitochondrien beeinträchtigt. Hier beschreiben wir die Verwendung von zwei ratiometrischen, genetisch kodierte Biosensoren, die mitochondrialen Redox-Zustand und ATP-Spiegel in subzellulären Auflösung erkennen in lebenden Hefezellen können. Mitochondrialen Redox-Zustand wird unter Verwendung von Redox-sensitive Green Fluorescent Protein (roGFP), die an der mitochondrialen Matrix ausgerichtet ist. Mito-roGFP enthält Cysteine ​​an den Positionen 147 und 204 der GFP, die reversibel und umwelt-abhängige Oxidation und Reduktion, die wiederum verändern das Anregungsspektrum des Proteins unterzogen. MitGO-ATeam ist ein Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Sonde, in dem der ε-Untereinheit des F o F 1-ATP-Synthase eingeklemmt zwischen FRET-Donor und Akzeptor fluozierenden Proteinen. Die Bindung von ATP an die ε-Untereinheit führt zu Konformationsänderungen im Protein, die bringen FRET-Donor und Akzeptor in unmittelbarer Nähe und ermöglichen Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer vom Spender zum Akzeptor.

Messen mitochondrialen Redox-Zustand mit Mito-roGFP Hier zeigen wir, dass mito-roGFP1 den dynamischen Bereich hat, um Änderungen in der mitochondrialen Redox-Zustand von vollständig oxidiert zu erfassen, um in lebenden Hefezellen reduziert, ohne die Hefe das Zellwachstum oder die mitochondriale Morphologie. Zunächst finden wir Zellen, Mitochondrien gezielte GFP und roGFP1 wachsen zu normalen Tarifen (Abbildung 1A). Die maximale Wachstumsrate, wie maximale Steigung der Wachst...

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Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Wir beschreiben die Verwendung von zwei ratiometrischen, genetisch kodierte Biosensoren, die auf GFP basieren, zu mitochondrialen Redox-Zustand und ATP-Spiegel in subzellulären Auflösung in lebenden Hefezellen überwachen.

Ratiometric Biosensors, dass die mitochondriale Redox Staats-und ATP in lebenden Hefezellen Messen

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

ratiometric-biosensors-that-measure-mitochondrial-redox-state-atp

Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.9K Aufrufe.  Columbia University. Wir beschreiben die Verwendung von zwei ratiometrischen, genetisch kodierte Biosensoren, die auf GFP basieren, zu mitochondrialen Redox-Zustand und ATP-Spiegel in subzellulären Auflösung in lebenden Hefezellen überwachen.

Serie: Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Herstellung von elektrochemischen DNA Biosensoren für die Reagenzienfreier Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinen und kleinen Molekülen

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Forschung

Biotechnik

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Fluorescence Lifetime Imaging für molekulare Rotoren in lebenden Zellen

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

Räumlich-zeitliche Manipulation kleiner GTPase-Aktivität in subzellulären Ebene und auf Zeitskala von Sekunden in lebenden Zellen

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

Hohle Mikronadel-basierten Sensor für Multiplex Transdermale elektrochemische Nachweis

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Optische Detektion von<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterien durch Mesoporous Silicon Biosensoren

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

Isolierung von Cellular Lipid Droplets: Zwei Reinigungstechniken Ausgehend von Hefezellen und menschlichen Plazenten

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Optische Kontrolle von lebenden Zellen elektrische Aktivität von konjugierten Polymeren

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Ein Protokoll für die Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensoren mechanische Kräfte über den Kern LINC-Komplex zu messen

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

Unter Verwendung der synthetischen Biologie lebenden Zellen zu entwickeln, die Schnittstelle mit programmierbarer Materialien

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...