MKK dankt dem britischen Engineering and Physical Science Research Council (EPSRC) Life Sciences Interface-Programm für eine persönliche Gemeinschaft. Wir möchten auch die Finanzierung von der britischen Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) anerkennen.

Die Protokolle für FLIM Probenvorbereitung sich nicht von denen für die konfokale oder Wide-Feldstärke-basierte Fluoreszenzmikroskopie unterscheiden. Die Datenerfassung wird durch die Hauptaufgabe der Datenanalyse folgte, also Extrahieren der Fluoreszenz-Lebensdauern aus den Rohdaten. Sobald diese gewonnen wurden, hilft die Interpretation der Daten zu verifizieren oder zu falsifizieren Hypothesen. 1. Anfärben der Zellen mit molekularer Rotoren <ol><li> Vorbereiten einer Stammlösung (10 ml) durch Auflösen von ungefähr 1 mg / ml des Farbstoffs in einem geeigneten Lösungsmittel (zB Methanol BODIPY-C 12) unter Verwendung eines 6,7 genaue Gleichgewicht und einer Pipette. </li><li> Die Zellen (ein Modell-Zelllinie, HeLa in unserem Fall) zu färbenden auf in einer Multiwell-Platte mit einer Unterseite für die Mikroskopie coverslide geworden, in einem Inkubator bei 37 ° C mit einer 5% CO 2-Atmosphäre, bis ~ 80% konfluent . </li><li> In 10 bis 20 ul der Stammlösung zu den lebenden Zellen wachsen in einer Multi-WELl Platte (SmartSlide 50 Mikro-Inkubation System, WaferGen) in 4 ml Opti-MEM-Medium (GIBCO) pro Well für eine 6-Well-Platte. Dies ergibt eine Mikro-molaren Farbstoffkonzentration in dem Bohrloch. </li><li> Gibt die Multi-Well-Platte in einen Inkubator bei 37 ° C mit einer 5% CO 2-Atmosphäre für 10-45 Minuten für die Färbung. </li><li> Entfernen Sie die Multiwell-Platte aus dem Inkubator und Waschen der Zellen 3-4 mal mit 4 ml optisch klaren Zellkulturmedium (zB Opti-MEM), um überschüssige Farbe zu entfernen. </li><li> Übertragen der Multiwell-Platte auf dem Mikroskoptisch und eine Verbindung zu einem Temperaturregler / 5% CO 2 Gaseinlaß nach Bedarf, in Vorbereitung für die Bildgebung. </li></ol> 2. FLIM fluoreszierender molekularer Rotoren in Zellen <ol><li> Legen Sie die Probe auf dem Mikroskoptisch und erhalten eine Sende-und Fluoreszenz-Bild zu fluoreszierenden Zellen zu identifizieren. Ein schematisches Diagramm des experimentellen Aufbaus ist in gezeigt. 1.Verify, dass die Fluoreszenz geht von der Erfahrung StandortenCTED (zB Zellmembran, Zytoplasma). Erhalten ein Fluoreszenzemissionsspektrum und sicherzustellen, dass es, dass der Farbstoff oder Protein erwartet ist, in diesem Fall das Spektrum des molekularen Rotors. Als eine negative Kontrolle, Bild ein nicht-gefärbten Probe und sicherzustellen, dass es nicht fluoresziert. Dieser Schritt ist zwar nicht zwingend speziell für FLIM, ist es gute Praxis im Allgemeinen und nicht helfen zu überprüfen, ob die Probe ist, was Sie denken es ist. </li><li> Wechseln Sie zu FLIM-Modus - dieser wird einfach durch Bewegen eines Spiegels aus dem Fluoreszenz-Detektion Strahlengang (&quot;externe Detektor&quot;-Taste auf &quot;Beam Path Setting&quot;-Panel auf dem Leica TCS SP2 Erwerb Steuer-Software) durchgeführt. Eine entsprechende Fluoreszenzemission Filter auf jedes anregende Licht den Detektor erreicht blockieren müssen in der Fluoreszenz-Detektion Strahlengang sein. </li></ol><img alt="1" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig1.jpg" /> Abbildung 1. Experimentelle Anordnung zur Time-Domain-FLIM mit aconfocal Laser Scanning Mikroskop. <ol start="3"><li> Scannen Sie die Probe und prüfen, auf dem Computer die Steuerung der FLIM Erwerb, dass der Detektor Zählrate (schwarzer Balken gekennzeichnet CFD auf Erwerb Steuerungs-Software der Becker &amp; Hickl SPC 830 board) nicht mehr als etwa 1% des Laser-Wiederholrate ist ( grünen Balken markiert SYNC Erwerb Steuer-Software). Wenn ja, reduzieren die Laseranregung Intensität, zB indem ein Graufilter im Laserstrahlengang, um zu vermeiden, Massenkarambolage verzerrten Fluoreszenzabklingkurven. </li><li> Eignen Sie sich ein Bild FLIM, in der Regel für 3-5 min, Suche beenden und speichern Sie die Rohdaten (ein 3D-Daten &quot;Würfel&quot;, bestehend aus räumlichen Koordinaten x und y, und Zeit). </li><li> Öffnen Sie die Rohdaten in der Fluoreszenzabklingzeiten Analyse-Software-Paket, zum Beispiel Tri-2 14 oder kommerzielle Software, um die Intensität der Fluoreszenz Bild anzuzeigen. Das ist einfach das integrierte Fluoreszenzabklingzeiten, dh die Fläche unter dem Fluoreszenz-Abklingkurve, in jederPixel. </li><li> Wählen Sie einen typischen Pixel indem Sie den Cursor darauf und überprüfen den Fluoreszenzabklingzeiten in diesem Pixel. Wenn der Peak-Zahl unter 100, verwenden räumliche Binning von Pixeln. Die Zählungen der benachbarten Pixel (zB 3x3 oder 5x5) in das zentrale Pixel addiert, so dass eine höhere Spitzenleistung Zählung erhalten wird. Dies bietet eine höhere statistische Genauigkeit für den nächsten Schritt. Alternativ könnte die Messung für eine längere Erfassungszeit (Schritt 5) wiederholt werden. Für 30-50min, wird ein etwa 10-fach höhere Peak count (und Gesamtaktivität) erhalten, aber das ist viel zu lange Zeit eine Anschaffung für die meisten biologischen Proben wegen der Gefahr der Einführung Artefakte durch Bewegung der Probe, Drift-Mikroskop, Phototoxizität und Ausbleichen. </li><li> Wählen Sie einen globalen Pixel Schwellenwert (über dem der Zerfall in einem Bildpunkt vorhanden ist) und wenden Sie einen einzigen exponentiellen Abfall passen zu dem Bild. Das Ergebnis ergibt sich eine Fluoreszenzlebensdauer für jedes Pixel über dem Schwellenwert, der dann wiederum kodiertFarbe. Jedes Pixel wird mit dem Ergebnis der Anpassung gefärbt, und eine FLIM Karte erhalten wird. Überprüfen Sie die Chi-Quadrat-Werte für verschiedene Pixel - rund 1 (und bis zu 1,3) deutet auf eine gute Passform. Prüfen der entsprechenden Residuen, die zufällig um Null verteilt werden soll. </li><li> Die Fluoreszenz-Lebensdauer-Histogramm, wie oft bestimmte Fluoreszenzlebensdauern gegenüber der Fluoreszenz-Lebensdauer selbst auftreten. Passen Sie den Farbbereich, so dass die Fluoreszenz-Lebensdauer-Verteilung in die Farbpalette passt. </li><li> Wenn ein monoexponentielle Passform nicht nachgibt einen Chi-Quadrat-Wert von etwa 1 (und bis zu 1,3), und es gibt eine systematische Abweichung der Residuen von Null, wird ein komplexeres Modell erforderlich. Zum Beispiel versuchen Anbringen einer doppelt exponentiellen Modell auf die Fluorezenzzerfaelle zur Berücksichtigung für zwei verschiedene Umgebungen die Sonde auf sein kann Passung ergibt ebenfalls die präexponentiellen Faktoren oder Amplituden, die einen Hinweis auf die relative Menge des Farbstoffes in einem Umweltment oder das andere. Alternativ kann eine gestreckte Exponentialfunktion angebracht, eine Verteilung der Fluoreszenz-Lebensdauern ausmachen. </li><li> Die Ergebnisse für die Fluoreszenz-Lebensdauer, präexponentiellen Faktoren, und die Lebensdauer-Verhältnis und dem präexponentiellen Faktor Verhältnis für jedes Pixel können dann farbig kodiert werden. Jedes Pixel ist farbig nach seinen Wert, und der Kontrast durch Fluoreszenz-Lebensdauern, präexponentiellen Faktoren und deren Verhältnisse erreicht wird. Wieder finden Sie die Chi-Quadrat-Werte (die auch in Farbe kodiert werden und angezeigt als Bild) - rund 1 (und bis zu 1,3) deutet auf eine gute Passform. Untersuchen Sie die Residuen, die zufällig um Null verteilt werden sollten. </li><li> Fluoreszenz-Lebensdauer-Histogramme sollten alle Bilder zur einfachen Visualisierung von mittleren Fluoreszenzlebensdauer Werte, und die Fluoreszenz-Lebensdauer-Verteilung begleiten. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Fluorezenzzerfaelle für gemessendas fluoreszierende molekulare Rotor bei steigender Viskosität in Methanol / Glycerin-Mischungen sind in Abb. 2. Die Fluoreszenz-Zerfälle sind monoexponentielle, und die Fluoreszenz-Lebensdauer variiert stark in Abhängigkeit von der Viskosität. Sie steigt von rund 300 PS in Methanol (Viskosität 0,6 cP) bis 3,4 ns in 95% Glyzerin (Viskosität 950 cP). <img alt="2" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig2.jpg" /> Abbildung 2. Fluoreszenz-Abklingverhalten für BODIPY-C 12 in Methanol / Glycerin mit unterschiedlicher Viskosität. 6 Die logarithmische Eichkurve Fluoreszenzlebensdauer τ gegen die Viskosität η für die fluoreszierende molekulare Rotor ist in Abb. 3. Es ist eine gerade Linie durch den Förster Hoffman Gleichung 9 gefordert <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq1.jpg" alt="Gleichung 1" /> wobei k 0 ist die radiative Geschwindigkeitskonstante, und z und x Konstanten sind, und mit 0 &lt;x &lt;1 ist. Logarithmieren auf beiden Seiten ergibt <img src="/files/ftp_upload/2925/2925eq2.jpg" alt="Gleichung 2" /> wobei x die Steigung der geraden Linie. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig3.jpg" /> Abbildung 3. Eine Auftragung von log Fluoreszenz-Lebensdauer vs log Viskosität für BODIPY-C 12 ergibt sich eine gerade Linie in Übereinstimmung mit dem Förster-Hoffmann-Gleichung. 6 Nach der Inkubation von lebenden Zellen mit dem fluoreszierenden molekularen Rotor eine punktförmige Verteilung Farbstoff wird in den Fluoreszenz-Bildern beobachtet. FLIM Bilder von HeLa-Zellen mit einem meso-substituierten BODIPY Farbstoff inkubiert sind in Abb. 4. Die Fluoreszenz-Zerfälle in jedem Pixel des Bildes adäquat ausgestattet werden mit einer einzigen exponentiellen Modell. 4. (A) Fluoreszenzintensität und (b) FLIM Bilder von HeLa-Zellen mit BODIPY-C 12-gefärbt. Die hellen, punktförmigen Regionen weisen eine kürzere Lebensdauer als andere Regionen. Diese kürzere liftime entspricht einer niedrigeren Viskosität im Puncta, wahrscheinlich Fetttröpfchen, gemäß der Förster-Hoffmann Gleichung. Durch Auftragen der Lebensdauern von jedem Pixel extrahiert, erhalten wir eine Fluoreszenz-Lebensdauer-Histogramm des gesamten Bildes, wie in Abb. 5. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/2925/2925fig5.jpg" /> Abbildung 5. Histogramme der Fluoreszenz-Lebensdauern von FLIM Bilder von HeLa-Zellen mit meso-substituierten BODIPY molekularer Rotoren gefärbt.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

FLIM bietet einige entscheidende Vorteile gegenüber Intensität-basierte Fluoreszenz-Imaging. Es kann auf photophysikalische Ereignisse, die schwierig oder unmöglich zu Fluoreszenzintensität Bildgebung beobachten sind zu berichten, da es sie von Fluorophorkonzentration Effekte zu trennen kann. Dies ist besonders nützlich für die Zuordnung intrazellulären Viskosität durch Abbilden fluoreszierenden molekularen Rotoren. Die Fluoreszenz-Lebensdauer kann leicht zu einer Viskosität unter Verwendung einer Eichkurve umgewandelt werden, wie in gezeigt. 3, unabhängig von der Konzentration der fluoreszierenden molekularen Rotoren. In FLIM kann es zu Artefakten, die die Interpretation der Daten erschweren kann. Instrumental 10 Ausstellungsstücken zählen Streulicht, die Show wird als Peak auf der Oberseite des Anfang des Fluoreszenzabklingzeiten und kann mit einer kurzen Abklingzeit verwechselt werden, oder eine kleine Spitze, nachdem der IRF welche sich durch Reflexionen im Innern des Mikroskops verursacht werden. Diese Streulicht Artefakte können als solche identifiziert werdenweil sie mit spektralen Diskriminierung unterschieden werden können - sie sind immer auf der gleichen Wellenlänge wie das anregende Licht. Daran erinnernd, dass in Luft, Licht 30 cm bewegt sich in 1 Nanosekunde hilft, den Ursprung von Reflexionen zu lokalisieren. Filter-oder Glas-Fluoreszenz könnten auch dazu führen, ein Artefakt, insbesondere bei niedrigen Probenfluoreszenz, aber dies kann leicht durch eine Messung ohne Probe identifiziert werden: wenn ein Zerfall unter diesen Umständen gewonnen wird, ist es aufgrund des Instruments und hat nichts zu tun mit der Probe! Auf der anderen Seite, dass Probe Autofluoreszenz kann auch mit einem Fluoreszenzabklingzeit wirken. In zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (TCSPC), Time-to-Amplituden-Wandler (TAC) Nichtlinearitäten können zu einer schlechten passt, kann aber durch die Blockierung der Anregung und glänzenden Umgebungslicht, zB aus dem übertragenen Lichtquelle auf die Probe identifiziert werden und Messen der Timing. Eine konstante Hintergrund sollteerhalten in jedem Pixel des Bildes. Regionen, in denen Abweichungen von einer konstanten Hintergrund ablaufen, wird niemals zu ergeben eine gute Passform und sollte für die Messung vermieden werden, wenn sie nicht durch Einstellen der Parameter für die TCSPC Karte eliminiert werden. Ein berühmt-berüchtigten Artefakt in TCSPC Photon ist Pile-Up, das durch zu hohe Erkennungsrate eines Photons verursacht. 11,12 Dies führt zu einer nur des ersten Photons wird zeitlich und ignoriert alle nachfolgenden Photonen, weil die Elektronik beschäftigt sind Timing und der Verarbeitung des ersten Photons. Pile-up führt zu einer Verkürzung der Fluoreszenz-Lebensdauer, und der beste Weg, um dies zu vermeiden ist es, die Photonen-Zählrate bei rund 1% des Laser-Repetitionsrate zu halten. Ausblick Es gibt verschiedene Implementierungen von FLIM und, je nach Anwendung, jeder hat seine Vorteile und Nachteile. 13 Die ideale Fluoreszenzmikroskop erwerben würde die gesamte multidimensionale Fluoreszenz emission Kontur der Intensität, Position, Lebensdauer, Wellenlänge und Polarisation in einer einzigen Messung, mit Single-Photon-Empfindlichkeit, räumliche Auflösung maximale und minimale Messzeit. Es gibt gegenwärtig keine Technologie, mit dieser einzigartigen Kombination von Merkmalen, einen zu bauen und bleibt eine Herausforderung für die Messtechnik-Entwickler. Die Anwendung des neuen physikalischen Techniken, um wichtige Probleme in der Zellbiologie ist oft der Weg zu unerwarteten Entdeckungen, und es gibt einen langen Weg vor uns, bevor wir nah an sättigenden die Fähigkeiten von Fluoreszenz-Imaging für Zellbiologie sind. In der Tat sind Abbildung von Fluoreszenz-Parameter wie Lebensdauer, Spektrum und Polarisation, sowie bildgebende schneller in 3D bei hoher räumlicher Auflösung, bestimmte neue Aspekte in der Zellbiologie zu offenbaren.

Probe mit fluoreszierenden molekularen Rotoren Hardware: invertierte Leica TCS SP2 Rastermikroskop Coherent Mira 900 Ti: Saphir-Femtosekundenlaser mit einer Verdi-V6-Pumplaser oder Hamamatsu PLP-10 470 Pikosekunden Diodenlaser gepulsten Anregungsquellen Becker &amp; Hickl SPC 830 Board in 3GHz, Pentium IV, 1 GB RAM Computer mit Windows XP gekühlten Becker &amp; Hickl PMC100-01-Detektor Kopf auf Hamamatsu H5773P-01 Photomultipliern, auf Mikroskop-x1-Port angebracht, oder Hybrid-Detektoren basieren DCC-100 Detektor-Steuermodul Software: Tri-2 14 oder SPCImage 2,8 von Becker &amp; Hickl

fluorescence lifetime imaging of molecular rotors in living cells

Diffusion ist oft ein wichtiger geschwindigkeitsbestimmende Schritt in chemischen Reaktionen oder biologische Prozesse und spielt eine Rolle in einer Vielzahl von intrazellulären Ereignissen. Die Viskosität ist einer der wichtigsten Parameter, die die Diffusion von Molekülen und Proteinen, und Änderungen in der Viskosität haben, um Krankheit und Störung wurde auf zellulärer Ebene verknüpft. 3.1 Während Methoden, um die Masse zu messen Viskosität gut entwickelt sind, bleibt eine Herausforderung Bildgebung Mikroviskosität . Viskosität Karten von mikroskopisch kleinen Objekten, wie einzelne Zellen, haben bis vor kurzem noch schwer zu bekommen. Mapping Viskosität mit Fluoreszenz-Verfahren ist vorteilhaft, da, ähnlich wie bei anderen optischen Techniken, es minimal-invasiven, nicht-destruktiv ist und kann an lebenden Zellen und Geweben angewandt werden. Fluoreszierende molekularer Rotoren weisen Fluoreszenzlebensdauern und Quantenausbeuten, die eine Funktion der Viskosität ihrer Mikroumgebung sind. 4,5 Intramolekulare Verdrehen oderDrehung führt zu nicht-strahlenden Zerfall aus dem angeregten Zustand zurück in den Grundzustand. Ein viskoser Umwelt verlangsamt diese Rotation oder Verdrehung, die den Zugang zu dieser nicht-strahlenden Zerfall Weg. Dies führt zu einer Erhöhung der Fluoreszenz-Quantenausbeute und der Fluoreszenzlebensdauer. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) von modifizierten hydrophoben BODIPY Farbstoffe, die als fluoreszierende molekulare Rotoren wirken zeigen, dass die Fluoreszenz-Lebensdauer dieser Sonden eine Funktion der Mikroviskosität ihrer Umgebung ist. 8.6 eine logarithmische Darstellung der Fluoreszenz-Lebensdauer im Vergleich zu den Lösungsmittelviskosität Erträge eine gerade Linie, die die Förster Hoffman Gleichung gehorcht. 9 Dieses Grundstück dient auch als Eichkurve zur Fluoreszenz-Lebensdauer in Viskosität zu konvertieren. Nach der Inkubation von lebenden Zellen mit dem modifizierten BODIPY fluoreszierende molekulare Rotor wird eine punktförmige Verteilung in den Farbstoff Fluoreszenz-Bildern beobachtet. Die Viskosität Wert in th erhaltene puncta in lebenden Zellen ist etwa 100 mal höher als die von Wasser und Zytoplasma. 6,7 Zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropiemessungen nachgeben Rotationskorrelationszeiten im Einvernehmen mit diesen großen Mikroviskosität Werte. Zuordnen der Fluoreszenz-Lebensdauer ist unabhängig von der Intensität der Fluoreszenz, und ermöglicht somit die Trennung der Sonde Konzentration und Viskosität Effekte. Zusammenfassend haben wir eine praktische und vielseitige Herangehensweise an die Mikroviskosität in Zellen auf molekularer FLIM von fluoreszierenden Rotoren basierte Landkarten entwickelt.

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Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) wurden als wesentliche Technik, um Bild die Umwelt und die Interaktion bestimmter Proteine ​​und Farbstoffe, die in lebenden Zellen entstanden. FLIM fluoreszierender molekularer Rotoren ermöglicht die Zuordnung der Viskosität in lebenden Zellen.

Fluorescence Lifetime Imaging für molekulare Rotoren in lebenden Zellen

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.8K Aufrufe.  King's College London. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) wurden als wesentliche Technik, um Bild die Umwelt und die Interaktion bestimmter Proteine ​​und Farbstoffe, die in lebenden Zellen entstanden. FLIM fluoreszierender molekularer Rotoren ermöglicht die Zuordnung der Viskosität in lebenden Zellen.

Serie: Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Dreidimensionale Optische Auflösung photoakustische Mikroskopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Forschung

Biotechnik

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell death. These processes affect and are affected by the redox status of and ATP production by mitochondria. Here, we describe the use of two ratiometric, genetically encoded biosensors that can detect mitochondrial redox state and ATP levels at subcellular resolution in living yeast cells. Mitochondrial redox state is measured using redox-sensitive Green Fluorescent Protein (roGFP) that is targeted to the mitochondrial matrix. Mito-roGFP contains cysteines at positions 147 and 204 of GFP, which undergo reversible and environment-dependent oxidation and reduction, which in turn alter the excitation spectrum of the protein. MitGO-ATeam is a F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) probe in which the &epsilon; subunit of the FoF1-ATP synthase is sandwiched between FRET donor and acceptor fluorescent proteins. Binding of ATP to the &epsilon; subunit results in conformation changes in the protein that bring the FRET donor and acceptor in close proximity and allow for fluorescence resonance energy transfer from the donor to acceptor.

We describe the use of two ratiometric, genetically encoded biosensors, which are based on GFP, to monitor mitochondrial redox state and ATP levels at subcellular resolution in living yeast cells.

Ratiometric Biosensors, dass die mitochondriale Redox Staats-und ATP in lebenden Hefezellen Messen

Mitochondria have roles in many cellular processes, from energy metabolism and calcium homeostasis to control of cellular lifespan and programmed cell ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electro Studium der Lungenkrebszellen unter Verwendung eines Mehrkanal-Zwei elektrischen Feldes Mikrofluidik-Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Optische Kontrolle von lebenden Zellen elektrische Aktivität von konjugierten Polymeren

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Durchführung von mehreren Imaging-Modi mit einem Fluoreszenzmikroskop

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik in lebenden Zellen mit einer Kombination von fluoreszierenden Techniken

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...