We would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher, Alexander Boes and Veronique Bei&#223; for providing the transgenic tobacco seeds, and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. The authors wish to thank Dr. Richard M. Twyman for editorial assistance as well as G&#252;ven Edg&#252; for providing the MSP1-19 reference. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ''Future-Pharma'', proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.

1. Pflegen Sie die Tabakpflanzen <ol><li> Schreibt jede Mineralwolle-Block mit 1 bis 2 l entionisiertem Wasser und anschließend mit 1 l von 0,1% [w / v] Düngemittellösung. Legen Sie einen Tabaksamen in jedem Block aus Mineralwolle und sanft bündig mit 0,25 l Düngerlösung ohne den Samen 16 Waschen entfernt. </li><li> Pflegen Sie die Tabakpflanzen für 7 Wochen in einem Gewächshaus mit 70% relativer Luftfeuchtigkeit, eine 16 Stunden Photoperiode (180 &amp; mgr; mol sec - 1 m - 2; λ = 400 - 700 nm) und einem 25/22 ° C Hell / Dunkel - Temperaturregelung. </li><li> Ernten Sie alle Blätter mit Ausnahme der vier cotyledon Blätter, die an der Basis der Pflanze Stiel angeordnet sind. </li></ol> 2. Optional: Wärmeniederschlag durch Blanchieren Hinweis: die Schritte in den Schritten vornehmen 2,1-2,12 um Tabak HCP auszufällen von blanchiert. Überspringen Sie den gesamten Abschnitt 2, wenn die Vertreter des Gesundheitswesens wird gefällt werdenin einem beheizten Behälter (Abschnitt 4) oder einen Wärmetauscher (Abschnitt 5) verwenden. <ol><li> Nehmen Sie sich 50 g Pflanzenmaterial und Durchführung von Extraktion ohne blanchiert (Abschnitt 3). Nehmen Sie eine Probe dieses Extrakts als eine interne Kontrolle bei der anschließenden Analyse (Kapitel 7). </li><li> Einrichten eines 8-L Arbeitsvolumen Wasserbad, beispielsweise 50 x 40 x 40 cm, in einem wärmeisolierten Polystyrolschaum Eimer oder dergleichen. Montieren Sie den regelbarer Thermostat auf dem Wasserbad für nachfolgende Temperatursteuerung (Schritt 2.7). </li><li> Übertragen Sie die gesamte Baugruppe auf eine magnetische Rührplatte und legen Sie eine Rührfisch im Wasserbad. Stellen Sie sicher, dass das Magnetfeld stark genug ist, den Rührstab zu drehen. </li><li> Umgeben den Rührstab mit mindestens vier Stützplatten, auf denen ein Polypropylen-Korb (Schritt 2.6) wird später während des Abblassen Verfahrens platziert werden. Stellen Sie sicher , dass die Stützplatten aus einem nichtmagnetischen Material hergestellt sind (beispielsweise Edelstahllegierung , die Nickel) , und dass siehöher sind als der Rührstab (Abbildung 2). </li><li> In 8 l VE-Wasser in das Wasserbad. HINWEIS:. Unter Verwendung eines Puffers, zB 50 mM Natriumphosphat (pH 7,5), kann die Zielproteinausbeuten verbessern , wenn niedrige pH - Fällung ist ein Problem. </li><li> Legen Sie eine 23 x 23 x 23 cm Polypropylen Korb auf den Trägerplatten und stellen Sie sicher, dass der Korb nicht mit dem Rührstab Rotation nicht stört und dass es vollständig in die Flüssigkeit eingetaucht. Falls erforderlich, zusätzliches Wasser / Puffer, bis der Korb voll untergetaucht ist, dann wieder in den Korb zu entfernen. ACHTUNG: Alle nachfolgenden Schritte bis zu 2,12 betreffen den Umgang mit heißer Flüssigkeit. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung einschließlich thermisch isolierte Handschuhe. </li><li> Verwenden Sie den einstellbaren Thermostat das Wasserbad auf 70 ° C zu bringen (oder die Temperatur für die Versuche erforderlich). Wartezeit von mindestens 15 min nachdem die gewünschte Temperatur erreicht einen therma erreicht hat, die gesamte Baugruppe zu gewährleisten,l Gleichgewicht. </li><li> Bereiten Sie 150 g-Proben aus den geernteten Tabakblätter. Platzieren eines Aliquots in den Korb unter Vermeidung irreversible Kompression und Beschädigung der Blätter, beispielsweise durch Reißen. Vermeiden Sie den Korb mit Pflanzenmaterial oder einer dichten Packung des letzteren überfüllen. </li><li> Vorsichtig aber schnell den Korb in die heiße Flüssigkeit tauchen und es auf den Stützplatten legen. Legen Sie einen Block aus rostfreiem Stahl auf der Oberseite des Korbes Flotation zu verhindern. </li><li> Inkubieren Sie die Blätter für 5 min in der blanchiert Flüssigkeit, oder wählen Sie eine Zeit, um das experimentelle Design passend. Überwachen Sie die Flüssigkeitstemperatur während der gesamten Inkubationszeit. </li><li> Restflüssigkeitsablauf aus den Blättern für 30 Sekunden Entfernen Sie vorsichtig den Korb aus dem blanchiert Flüssigkeit und lassen. Dann nehmen Sie die Pflanze aus dem Korb verlässt, übertragen sie in den Mixer geben und sofort die Extraktion (Abschnitt 3) starten. HINWEIS: Die Pflanzen können für längere Zeiträume nach dem Blanchieren und vor dem Beginn der th gehalten werdene Extraktion, beispielsweise mehr als 30 min auf Eis oder mehrere Wochen bei -20 ° C eingefroren wurde erfolgreich getestet. Jedoch kann die Stabilität des Produktes sinken mit Lagerzeiten zu erhöhen und damit die sofortige Verarbeitung wird empfohlen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2,8-2,11 mit frischem Blattmaterial, bis die gesamte geerntete Biomasse verarbeitet wird. </li></ol> 3. Proteinextraktion aus Tabakblättern ACHTUNG: Die nächsten Schritte beinhalten einen Mixer mit rotierenden Messern. Nicht in den Mixer Eimer arbeiten, während es auf dem Mixer Motor montiert ist. <ol><li> Legen Sie 150 g (Feuchtmasse) geerntet (Schritt 1.3) oder blanchiert (Schritt 2.11) verlässt in den Mixer geben und mit 450 ml Extraktionspuffer (50 mM Natriumphosphat, 500 mM Natriumchlorid, 10 mM Natriumdisulfit, pH 8,0). HINWEIS: Die Extraktionspufferzusammensetzung hängt von dem Protein extrahiert werden und kann so eine Einstellung erfordern, beispielsweise die Verwendung eines anderen pH oder Pufferkomponente, wie Trist. </li><li> Homogenisieren die Blätter für 3 x 30 sec Impulse mit 30 Sekunden Pausen durchsetzt. Stellen Sie sicher, dass die Blätter werden homogenisiert und nicht verstopfen den Mixer Eimer. Stoppen Sie den Mixer geben und heben Sie die Blätter nicht verstopft werden kann, wenn nötig, und dann weiter die Homogenisierung. </li><li> Nehmen Sie eine 1 ml Probe jeder Extrakt, der für die nachfolgende Analyse (Abschnitt 7) erzeugt wird. Wenn das Pflanzenmaterial blanchiert wird, im Abschnitt weiter 6. Sonst mit Hitzefällung in einem Gefäß (Abschnitt 4) oder Wärmetauscher (Abschnitt 5) weiterhin in Abhängigkeit von der gewählten experimentellen Ansatz. </li></ol> 4. Optional: Wärmeniederschlag in einem Rührgefäß HINWEIS: Führen Sie die beschriebenen Schritte in den Abschnitten 4.2 bis 4.11 um Tabak HCP in einem Rührkessel zu fällen. Überspringen Sie den gesamten Abschnitt 4, wenn Vertreter des Gesundheitswesens haben durch blanchiert (Abschnitt 2) ausgefällt worden oder werden ausgefällt mit einem Wärmetauscher (Abschnitt 5). <ol><li> Richten Sie zwei 8-L Arbeitsvolumen WasserBäder, beispielsweise 50 x 40 x 40 cm, in wärmegedämmten Polystyrolschaum oder ähnliches. Im ersten Bad, montieren Sie die regelbarer Thermostat für die anschließende Temperaturregelung (Schritt 4.6). In der zweiten, werden 5 l entionisiertem Wasser und 2 kg Eis zur anschließenden Kühlung (Schritt 4.9). </li><li> Übertragen Sie das erste Wasserbad auf eine magnetische Rührplatte und legen Sie die 2-l-Edelstahlbehälter in das Wasserbad, so dass die Mitte des Behälters zu der Mitte der Rührplatte ausgerichtet ist. </li><li> Legen Sie einen magnetischen Rührstab im Edelstahlbehälter. Stellen Sie sicher, dass das Magnetfeld stark genug ist, den Rührstab zu drehen. </li><li> Füllen Sie das Wasserbad mit entionisiertem Wasser auf 5 cm unterhalb der Oberkante des Edelstahlgefäßes. Dann füllen Sie das Gefäß mit Extraktionspuffer. Legen Sie einen Polystyrolschaum Deckel auf dem Behälter. ACHTUNG: Alle nachfolgenden Schritte bis zu 4,9 betreffen den Umgang mit heißer Flüssigkeit. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung einschließlich thermisch inslierten Handschuhe. </li><li> Legen Sie ein Thermometer in den Behälter aus rostfreiem Stahl durch ein suiting Loch in der Polystyrolschaum Deckel. Stellen Sie die Wasserbadtemperatur auf 78 ° C und Inkubation für 15 min die gesamte Anordnung ein thermisches Gleichgewicht zu erreichen. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur im Behälter 70 ° C, ca. 8 ° C unter dem Sollwert des Wasserbades. </li><li> Wenn die Temperatur in dem Behälter aus rostfreiem Stahl von 70 ° C abweicht, Einstellung der Temperatur des Wasserbades entsprechend und lassen das System für weitere 15 min äquilibrieren. Wiederhole diesen Schritt, bis die Temperatur im Behälter 70 ° C oder wie für das Experiment erforderlich ist, und den leeren Behälter aus rostfreiem Stahl. </li><li> Gießen Sie 300 ml Extrakt (Schritt 3.2) in den Edelstahlbehälter, während es noch im Wasserbad ist und einen Timer starten. Rühren Sie den Extrakt bei 150 Umdrehungen pro Minute und Inkubation für 5 min. Stellen Sie sicher, dass der Extrakt mindestens 2 min während dieser Inkubationszeit eine Temperatur von 70 ° C erreicht. </li><li>Entfernen Sie die heißen Wasserbad aus dem Magnetrührer, nehmen Sie den Behälter aus rostfreiem Stahl heraus und legen Sie es in der eiskalten Eimer. Legen Sie die letztere auf den Magnetrührer und entfernen Sie den Polystyrolschaum Deckel. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Anlage Homogenat gut bei 150 Umdrehungen pro Minute gerührt wird, legen Sie das Thermometer im Extrakt und brüten, bis sie eine Temperatur von 20 ° C oder die Temperatur durch den Versuchsaufbau angegeben erreicht. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,7-4,9 für alle Teilmengen. Nehmen Sie eine 1 ml Probe gefällt jeder Wärme zu entziehen, sobald es die endgültige Temperatur erreicht hat, dann mit Abschnitt 6 fort. </li></ol> 5. Optional: Wärmeniederschlag in einem Wärmetauscher HINWEIS: Führen Sie die beschriebenen Schritte in den Abschnitten 5,2-5,12 um Tabak Vertreter des Gesundheitswesens mit einem Wärmetauscher zu fällen. Überspringen Sie den gesamten Abschnitt 5, wenn Vertreter des Gesundheitswesens haben durch blanchiert (Abschnitt 2) oder in einem beheizten Behälter (Abschnitt 4) gefällt worden. <ol><li> Richten Sie zwei 8-L ArbeitsvolumenWasserbäder, beispielsweise 50 x 40 x 40 cm, in wärmegedämmten Polystyrolschaum Eimer oder dergleichen. Im ersten Bad, montieren Sie die regelbarer Thermostat für die nachfolgende Temperaturregelung (Schritt 5.3). In der zweiten, werden 5 l entionisiertem Wasser und 2 kg Eis zur anschließenden Kühlung (Schritt 5.10). ACHTUNG: Alle nachfolgenden Schritte bis zu 5,9 betreffen den Umgang mit heißer Flüssigkeit. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung einschließlich thermisch isolierte Handschuhe. </li><li> Füllen Sie das erste Wasserbad mit 8 l VE-Wasser. Stellen Sie die Temperatur auf 74,5 ° C, um den Thermostat. Inkubieren Sie die Baugruppe für 15 Minuten ein thermisches Gleichgewicht zu erreichen. </li><li> Bereiten Sie einen isolierten Vorratsbehälter durch einen 0,5-L-Plastikbecher in einen 1-L-Plastikbecher platzieren und die Lücken mit Watte füllen. Alternativ können Sie einen gewidmet wärmeisolierte Behälter mit einem Arbeitsvolumen von 0,5-L. </li><li> Verbinden den Wärmetauscher an die peristaltische Pumpe an einem Ende und mit einem Auslass Schlauch am other Ende L / S 24 Schläuche verwenden. Legen Sie beide Schlauchenden mit einem Thermometer in dem isolierten Vorratsbehälter entlang und füllen Sie es mit 300 ml Extraktionspuffer (Abbildung 2). </li><li> Setzen Sie den Wärmetauscher in das heiße Wasserbad und starten Sie die peristaltische Pumpe mit einer Geschwindigkeit von 300 ml min -1. Stellen Sie sicher, dass die resultierende Temperatur im Behälter 70 ° C beträgt, etwa 4,5 ° C unter dem Sollwert des Wasserbades, nach 3 min. </li><li> Wenn die Temperatur in isoliertem Behälter von 70 ° C abweicht, Einstellung der Temperatur des Wasserbades entsprechend und lassen das System für weitere 15 min äquilibrieren. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Temperatur der Extraktionspuffer steigt von Raumtemperatur bis 70 ° C in weniger als 3 min, oder gleich dem für das Experiment erforderlich ist, und leeren Sie den Edelstahlbehälter. </li><li> Entsorgen Sie den Extraktionspuffer aus dem isolierten Gefäß und bereiten 300-ml-Teilmengen des Pflanzenextraktes. Füllen Sie das isolierte Behälter mit einem aliquoten. </li><li> Pumpen Sie den Pflanzenextrakt (Abschnitt 3.3) durch den Wärmetauscher bei 300 ml min -1 für 5 min. Sicherzustellen, dass die Ablufttemperatur 70 ° C nach 3 min ist, oder gleich der Temperatur in der Versuchsanordnung definiert. </li><li> Nach 5 Minuten, legen Sie den Wärmetauscher in den eiskalten Wasserbad während der Extrakt noch gepumpt wird. in dieser Einstellung inkubieren, bis die Temperatur genau 20 ° C erreicht hat, oder die Temperatur in dem experimentellen Design definiert. </li><li> Entfernen Sie den Zulaufschlauch zur Schlauchpumpe aus dem isolierten Behälter verbunden und weiterhin das Pumpen von in dem Wärmetauscher Nachwärme präzipitiert Pflanzenextrakt zu sammeln. Dann die Pumpe an. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,7-5,10 für alle Teilmengen. Nehmen Sie einen 1-ml-Probe jeder Wärme gefällte Extrakt, sobald es die endgültige Temperatur erreicht hat, dann auf den Extrakten passieren zu Beutel Filtration (Abschnitt 6). HINWEIS: Nach einem ersten Zyklus 5,7-5,10 Schritte durch wird es keine Extraktionspuffer sein,verwerfen in Schritt 5.7. </li></ol> 6. Beutel Filtration des Pflanzenextrakt <ol><li> Halterung ein Sackfilter in die entsprechende Stützkorb, der in das Filtergehäuse eingebaut ist und stellt eine mechanische Unterstützung für das flexible Filtermaterial. Legen Sie einen 1-l - Gefäß unter dem Korb und Anwendung der Extrakt Aliquots (Abschnitt 3.3, 4.10 oder 5.11 abhängig von der gewählten Wärmebehandlung) an der Tasche mit einer Geschwindigkeit von 150 ml min -1. </li><li> die Trübung einer Verdünnung von 1:10 Filtrat in Extraktionspuffer mit dem Turbidimeter Nach der Filtration messen. </li><li> Nehmen Sie eine 1 ml Probe und verarbeiten , um den Beutel Filtrat wie im experimentellen Design definiert, zB Tiefenfiltration und Chromatographie 7,10. </li></ol> 7. Probenanalyse <ol><li> Messen Sie die Menge des gesamten löslichen Proteins (TSP) unter Verwendung des Bradford - Methode 24,25. <ol><li> In dreifacher Ausfertigung, Pipette 2,5 ul jeder Probe in die einzelnen Vertiefungen einer96-Well-Platte. Fügen Sie acht Rinderserumalbumin (BSA) Standards in dreifacher Ausfertigung Abdeckung Bereich von 0 - 2000 &amp; mgr; g ml -1. </li><li> In 200 ul Bradford-Reagenz in jede Vertiefung und gründlich mischen durch Pipettieren auf und ab, aber sanft genug, um zu vermeiden, Blasen zu bilden. </li><li> bei 22 ° C für 10 min inkubieren und die Extinktion bei 595 nm in einem Spektrophotometer gemessen werden. Berechne die TSP-Konzentration in der auf einer Standardkurve durch die BSA Referenzpunkten Proben. </li></ol></li><li> Quantifizierung Vax8 durch Oberflächenplasmonresonanz - Spektroskopie 26. <ol><li> Setup der Oberflächenplasmonresonanz-Instrument mit 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), Laufpuffer (10 mM HEPES, 3 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1500 mM Natriumchlorid, 0,05% v / v Polysorbat 20, pH 7,4) und eine carboxymethylierte Dextranoberfläche Chip in das Gerät montieren. Verwenden Sie die Hauptfunktion, das System zu spülen und eine manuelle Lauf mit einer Flussrate von 30 beginnen&amp; mgr; l min -1 über Durchflusszellen 1 und 2. Spritzen 30 mM Chlorwasserstoff zweimal für 60 sec mit einem 60 sec eingestreuten Injektion von 25 mM Natriumhydroxid. </li><li> Bereiten 200 ul einer 500 ug ml - 1 mAb 5.2 Lösung in 10 mM Natriumacetat (pH 4,0). Auftau - 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimidhydrochlorid (EDC) und N - Hydroxysuccinimid (NHS) Vials und zentrifugieren bei 16.000 × g für 1 min. Mischen Sie 70 ul EDC mit 70 ul NHS und Transfer zu einem 7-mm-Kunststoffröhrchen. </li><li> Aktiviere die carboxymethylierte Dextranoberfläche Oberfläche Chip durch das EDC / NHS - Gemisch über Durchflusszellen 1 und 2 für 10 min mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 &amp; mgr; l min -1 Injizieren. </li><li> Stellen Sie den Strömungspfad zu fließen Zelle 2 nur. Paar mAb 5.2 durch 15 min bei einer Geschwindigkeit von 10 &amp; mgr; l min -1 injiziert wird . </li><li> Schaltet den Strömungsweg zu strömen Zellen 1 und 2 und injizieren Äthanolamin für 7 min mit einer Rate von 5 &amp; mgr; l min -1 um ​​die Oberfläche zu deaktivieren. Then injizieren 30 mM Chlorwasserstoff zweimal für 60 sec mit einem 60 sec eingestreuten Injektion von 25 mM Natriumhydroxid. </li><li> Injizieren Sie die Proben und MSP1 - 19 Standards mit einer Geschwindigkeit von 30 &amp; mgr; l min -1 für 180 sec. Stellen Sie sicher , dass die Vax8 Konzentration 50 - 1000 ng ml -1. Bereiten vorgeVerdünnungen in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung mit EDTA und Polysorbat 20 (HBSEP), falls erforderlich. </li><li> Subtrahieren des Spitzensignals des Strömungszelle 1 von der Strömungszelle 2 und die Differenz verwenden , um die Konzentration in Proben Vax8 Berechnung basierend auf dem Signal des MSP 1-19 Injektion mit einer bekannten Proteinkonzentration von 500 ng ml -1. </li><li> Regenerieren der Chipoberfläche nach jeder Probe oder MSP 1-19 Injektion durch Behandlung mit 30 mM Chlorwasserstoff für 60 sec bei einer Strömungsrate von 30 &amp; mgr; l min -1. </li></ol></li><li> QUANTIFY fluoreszenzspektrometrisch DsRed <ol><li> In dreifacher Ausfertigung, Pipette 50 ul jeder Probe in die einzelnen Vertiefungen einer schwarzen Halb area 96-Well-Platte. Fügen Sie sechs DsRed Standards Bereich von 0 abdeckt - 225 &amp; mgr; g ml -1. </li><li> Messen Sie die Fluoreszenz in zweifacher Ausfertigung eine 530 ± 30 nm Anregungsfilter und 590 ± 35 nm Emissionsfilter in einem Spektralphotometer. Berechne die DsRed-Konzentration in den Proben basierend auf einer Standardkurve durch die DsRed Referenzpunkte. </li></ol></li><li> Bestimmung der Partikelgrößenverteilungen <ol><li> Waschen einer Küvette mit 1 ml Isopropanol und dann mit 2 ml deionisiertem Wasser Staubteilchen zu entfernen. Pipette 850 ul der Probe in die Küvette. </li><li> Setzen Sie die Küvette in das Zeta-Potential und Partikelgrößenanalyse. Öffnen Sie die &quot;Software&quot; und starten Sie eine manuelle Messung mit &quot;Protein&quot;, wie das Material und &quot;PBS&quot; als Dispergiermittel. Wählen Sie eine Temperatur von 25 ° C und einer Gleichgewichtszeit von 180 sec. </li><li> Wählen Sie die &quot;DTS0012&quot; Zelle und messen bei 173 ° Backscatter. Überprüfen Sie die &quot;auto&quot; FunktIon für die Messdauer und wählen Sie drei Messungen ohne streuten Verzögerung. </li><li> Untersuchung der Verteilung Peakprofil Partikelgröße, sobald die Messung durch Auswahl der drei Messungen der Probe in dem Experiment Ansicht abgeschlossen ist. Wählen Sie die &quot;Volume PSD&quot; aus. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>PhRMA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 2013 Report: Medicines in Development - Biologics. , (2013).</li><li>Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+development+strategies+in+plant+molecular+farming.">Process development strategies in plant molecular farming.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).</li><li>Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+molecular+pharming+for+the+treatment+of+chronic+and+infectious+diseases.">Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 65, 743-768 (2014).</li><li>Melnik, S., Stoger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+factories+for+biopharmaceuticals.">Green factories for biopharmaceuticals.</a> Curr. Med. Chem. 20, 1038-1046 (2013).</li><li>Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+downstream+processing+of+plant-derived+recombinant+proteins.">Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins.</a> Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).</li><li>Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+and+purification+of+plant-made+recombinant+proteins.">Recovery and purification of plant-made recombinant proteins.</a> Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale-down+models+to+optimize+a+filter+train+for+the+downstream+purification+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+produced+in+tobacco+leaves.">Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves.</a> Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flocculation+increases+the+efficacy+of+depth+filtration+during+the+downstream+processing+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+produced+in+tobacco.">Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco.</a> Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).</li><li>Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose-based+filter+aids+increase+the+capacity+of+depth+filters+during+the+downstream+processing+of+plant-derived+biopharmaceutical+proteins.">Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins.</a> Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+chromatography-based+purification+strategies+accelerate+the+development+of+downstream+processes+for+biopharmaceutical+proteins+produced+in+plants.">Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants.</a> Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).</li><li>Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+quantitative+structure-activity+relationship+models+to+develop+optimized+processes+for+the+removal+of+tobacco+host+cell+proteins+during+biopharmaceutical+production.">The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production.</a> J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).</li><li>Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethyleneimine+precipitation+versus+anion+exchange+chromatography+in+fractionating+recombinant+beta-glucuronidase+from+transgenic+tobacco+extract.">Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract.</a> J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downstream+processing+of+biopharmaceutical+proteins+produced+in+plants:+the+pros+and+cons+of+flocculants.">Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants.</a> Bioengineered. 5, 138-142 (2014).</li><li>Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+extraction+of+monoclonal+antibodies+targeted+to+different+subcellular+compartments+in+transgenic+tobacco+plants.">Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants.</a> Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).</li><li>Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyclonal+antibodies+can+effectively+detect+tobacco+host+cell+proteins+after+RuBisCO+depletion+and+endotoxin+removal.">Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal.</a> Biotechnol. J. , (2015).</li><li>Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+host+cell+protein+heat+precipitation+step+simplifies+the+subsequent+purification+of+recombinant+proteins+from+tobacco.">Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco.</a> Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+juice+extractor+can+simplify+the+downstream+processing+of+plant-derived+biopharmaceutical+proteins+compared+to+blade-based+homogenizers.">A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers.</a> Process Biochem. 50, 859-866 (2014).</li><li>Beiss, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-precipitation+allows+the+efficient+purification+of+a+functional+plant-derived+malaria+transmission-blocking+vaccine+candidate+fusion+protein.">Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein.</a> Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).</li><li>Ma, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+approval+and+a+first-in-human+phase+I+clinical+trial+of+a+monoclonal+antibody+produced+in+transgenic+tobacco+plants.">Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants.</a> Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).</li><li>Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postharvest+treatments+of+fresh+produce.">Postharvest treatments of fresh produce.</a> Philos T R Soc A. 372, (2014).</li><li>Menzel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+blanching+reduces+the+host+cell+protein+content+and+substantially+enhances+the+recovery+and+stability+of+two+plant+derived+malaria+vaccine+candidates.">Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates.</a> Front. Plant Sci. , (2015).</li><li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+complex+systems+using+the+design+of+experiments+approach:+transient+protein+expression+in+tobacco+as+a+case+study.">Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study.</a> J. Vis. Exp. , e51216 (2014).</li><li>Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+to+evaluate+the+efficiency+of+flocculants+for+the+removal+of+dispersed+particles+from+plant+extracts.">Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts.</a> J. Vis. Exp. , e53940 (2016).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 76, (2006).</li><li>Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+models+for+the+accumulation+of+a+fluorescent+marker+protein+in+tobacco+leaves+according+to+the+promoter/5'UTR+combination.">Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination.</a> Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).</li><li>Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+biosensing.">Surface plasmon resonance biosensing.</a> Methods Mol. Biol. 503, 65-88 (2009).</li><li>Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+behavior+of+proteins:+Heat-resistant+proteins+and+their+heat-induced+secondary+structural+changes.">Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes.</a> Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).</li><li>Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+heat-stable+proteins+in+Escherichia+coli.">Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli.</a> Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).</li><li>Komarnytsky, S., Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Alam, M. Z., Raskin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+in+tobacco+guttation+fluid.">Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid.</a> Plant Physiol. 124, 927-933 (2000).</li><li>Drake, P. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+rhizosecretion+as+a+production+system+for+recombinant+proteins+from+hydroponic+cultivated+tobacco.">Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco.</a> FASEB J. 23, 3581-3589 (2009).</li><li>Turpen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+mosaic+virus+and+the+virescence+of+biotechnology.">Tobacco mosaic virus and the virescence of biotechnology.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond., Ser. B: Biol. Sci. 354, 665-673 (1999).</li><li>Kingsbury, N. J., McDonald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Evaluation+of+E1+Endoglucanase+Recovery+from+Tobacco+Leaves+Using+the+Vacuum+Infiltration-Centrifugation+Method.">Quantitative Evaluation of E1 Endoglucanase Recovery from Tobacco Leaves Using the Vacuum Infiltration-Centrifugation Method.</a> Biomed. Res. Int. , (2014).</li><li>Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numeric+simulation+can+be+used+to+predict+heat+transfer+during+the+blanching+of+leaves+and+intact.">Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact.</a> Biochem. Eng. J. , (2015).</li><li>Mandal, M. K., Fischer, R., Schillberg, S., Schiermeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protease+activity+by+antisense+RNA+improves+recombinant+protein+production+in+Nicotiana+tabacum+cv.+Bright+Yellow+2+(BY-2)+suspension+cells.">Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) suspension cells.</a> Biotechnol. J. 9, 1065-1073 (2014).</li><li>Welty, J. R., Wicks, C. E., Wilson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamentals of momentum, heat, and mass transfer. , (1976).</li><li>Lowe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation,+stability,+and+formulation+of+human+antibody+therapeutics.">Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics.</a> Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).</li><li>Gong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+human+antibody+constant+domains+with+increased+stability.">Engineered human antibody constant domains with increased stability.</a> J. Biol. Chem. 284, 14203-14210 (2009).</li><li>Rouet, R., Lowe, D., Christ, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+engineering+of+the+human+antibody+repertoire.">Stability engineering of the human antibody repertoire.</a> FEBS Lett. 588, 269-277 (2014).</li><li>Stabel, J. R., Lambertz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+pasteurization+conditions+for+the+inactivation+of+Mycobacterium+avium+subsp+paratuberculosis+in+milk.">Efficacy of pasteurization conditions for the inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk.</a> J. Food Prot. 67, 2719-2726 (2004).</li><li>Wichers, H., Mills, C., Wichers, H., Hoffmann-Sommergruber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+12.">Ch. 12.</a> Managing Allergens in Food. , 336 (2006).</li><li>Davis, P. J., Williams, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+modification+by+thermal+processing.">Protein modification by thermal processing.</a> Allergy. 53, 102-105 (1998).</li><li>Dubois, M. F., Hovanessian, A. G., Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-shock-induced+denaturation+of+proteins.+Characterization+of+the+insolubilization+of+the+interferon-induced+p68+kinase.">Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase.</a> J. Biol. Chem. 266, 9707-9711 (1991).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Die drei Verfahren zur Hitzefällung oben beschrieben , kann effektiv Tabak HCP vor jeder chromatographischen Reinigungsschritt 16,17 entfernen. Sie ergänzen andere Strategien , die anfängliche Produktreinheit zu erhöhen zielen darauf ab , zum Beispiel Guttation 29, rhizosecretion 30 oder Zentrifugalextraktion 31,32, die alle auf sekretierte Proteine ​​beschränkt sind. Jedoch können die Wärmebasierte Verfahren nur dann sinnvoll genutzt werden, wenn das Zielp...

Moderne Gesundheitssysteme zunehmend von biopharmazeutischen Proteinen 1. Herstellung dieser Proteine ​​in Pflanzen ist vorteilhaft , aufgrund der geringen pathogen Belastung und höhere Skalierbarkeit im Vergleich zu herkömmlichen Expressionssysteme 2-4. Allerdings ist die Downstream-Processing (DSP) von pflanzlichen Arzneimitteln kann eine Herausforderung sein, weil die störenden Extraktionsverfahren in einer hohen Partikelbelastung zur Folge haben, mit Trübungen von mehr als 5.000 nephelometrischen Trübungseinheiten (NTU) und Wirtszellprotein (HCP) Konzentrationen oft 95 überschreitet % [m / m] 5,6. Aufwendige Klärungsverfahren sind erforderlich , um dispergierte Teilchen zu entfernen 7-9, aber Chromatographie Ausrüstung ist weniger teuer in bind-and-eluieren Modus während der anfänglichen Produktgewinnung zu betreiben , wenn ein früherer Schritt für die effiziente Entfernung von HCPs 10,11 ist. Dies kann entweder erreicht werden, indem das Zielproteinfällungs floccul VerwendungAmeisen 12 oder niedrigen pH 13,14 sowie durch die HCPs zu aggregieren verursacht. Die selektive Aggregation von Ribulose-1,5-bisphosphat - Carboxylase / Oxygenase (RuBisCO), das am reichlichsten vorhandene HCP in grünen Pflanzen wie Tabak (Nicotiana tabacum), kann durch Zugabe von Polyethylenglykol 15 gefördert werden, dies ist jedoch teuer und nicht mit großer -Skala Fertigung. Wärmebehandlung wurde mehr als 95% des Tabaks HCPs gezeigt zu denaturieren und auszufällen, während Protein Malaria - Impfstoffkandidaten wie Vax8 stabil bleiben in Lösung 16-18. Drei verschiedene Ansätze wurden verwendet , um die wärmeinduzierte Ausfällung von Tabak HCPs zu erreichen: (i) blanchiert, das heißt das Eintauchen von intakten Blättern in heiße Flüssigkeit, (ii) ein temperaturgesteuertes Gefäß gerührt, und (iii) einen Wärmetauscher ( Abbildung 1) 16. Für intakte Blätter, Blanchieren der eine schnelle und effiziente Fällung von HCP erreicht und war auch leichtFertigungsprozesse zu skalieren und kompatibel mit bestehenden großen , die einen ersten Schritt umfassen 19 die pflanzliche Biomasse zu waschen. Im Gegensatz dazu, temperaturgeregelten Behälter sind bereits in einigen Prozessen zur Verfügung und kann für die thermische Behandlung von Pflanzen 20 extrahiert verwendet werden, aber ihre Skalierbarkeit und Energieübertragungsrate begrenzt , weil die Oberfläche-zu-Volumen - Verhältnis der Tanks schrittweise verringert wird und wird im Prozessmaßstab ungeeignet. Ein Wärmetauscher ist ein technisch gut definierte alternative Rührkessel zu erwärmenden erfordert aber eine reichliche Zufuhr von Heiz- und Kühlmedien, beispielsweise Dampf und kaltem Wasser sowie eine streng kontrollierten Volumenstrom, der zu dem Wärmetauscher Geometrie angepasst ist , und Medieneigenschaften, z. B. die spezifische Wärmekapazität. Dieser Artikel zeigt, wie alle drei Methoden können für die wärmeinduzierte Ausfällung von Tabak Vertreter des Gesundheitswesens und Pflanzen Vertreter des Gesundheitswesens im Allgemeinen verwendet werden. Die Errichtung und der Betrieb von each Methode in einer Laborumgebung kann verwendet werden, um ihre Eignung Prozesse für größere zu bewerten. Die große Herausforderung ist für jede Operation, die die Geräte und Bedingungen in angemessenem Umfang verkleinerten Modellen und Betriebsbedingungen zu identifizieren, während im Prozessmaßstab Herstellung verwendeten ähneln. Die hier präsentierten Daten beziehen sich auf Versuche mit transgenen Tabakpflanzen durchgeführt DsRed die Malaria - Impfstoffkandidaten Vax8 und fluoreszierende Protein exprimieren , 16, aber das Verfahren auch auf N. erfolgreich angewandt wurde benthamiana Pflanzen transient exprimieren andere biopharmazeutische Proteine ​​21. Ein Design-of-Experiments (DoE) Ansatz 22 kann die Prozessentwicklung zu erleichtern, und Flockungsmittel 23 in diesem Zusammenhang auch von Vorteil sein kann , wie zuvor 8 beschrieben. Der wesentliche Unterschied zwischen dem Bleichen, dem beheizten Behältern und Wärmetauscher ist, dass Abblassen auf intakte Blätter früh in den Prozess während der ot angewendet wirdihr sind Pflanzenextrakte (Abbildung 1) aufgebracht. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54343/54343fig1.jpg" /> Abb . 1: Fließschema Prozess zeigt die Umsetzung der drei verschiedene Methoden zur Tabak HCP Wärme Precipitation Das Pflanzenmaterial wird gewaschen und homogenisiert vor Klärung und Reinigung. Die Ausrüstung für die Blanchierschritt (rot) leicht an die vorhandenen Maschinen hinzugefügt werden. Im Gegensatz dazu ist ein Rührkessel (orange) mit und insbesondere einen Wärmetauscher (blau) erfordert eine oder mehrere zusätzliche Geräte und Schläuche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54343/54343fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54343/54343fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1026">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">2100P Portable Turbidimeter</td>
			<td style="width:195px;">Hach</td>
			<td style="width:119px;">4650000</td>
			<td style="width:352px;">Turbidimeter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Amine Coupling Kit</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">BR100050&#160;</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Autoclaving basket</td>
			<td style="width:195px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">6917-0230</td>
			<td>Basket for leaf blanching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Biacore T200</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9750-01</td>
			<td>SPR device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Bio Cell Analyser BCA 003 R&#38;D with 3D ORM</td>
			<td style="width:195px;">Sequip</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>Particle size analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Blender</td>
			<td style="width:195px;">Waring</td>
			<td style="width:119px;">800EG</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">BP-410</td>
			<td style="width:195px;">Furh</td>
			<td style="width:119px;">2632410001</td>
			<td>Bag filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5424 000.410</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Centrifuge tube 15 mL</td>
			<td style="width:195px;">Labomedic</td>
			<td style="width:119px;">2017106</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Centrifuge tube 50 mL self-standing</td>
			<td style="width:195px;">Labomedic</td>
			<td style="width:119px;">1110504</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">CM5 chip</td>
			<td style="width:195px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">BR100012&#160;</td>
			<td>Chip for SPR measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Cuvette 10x10x45</td>
			<td style="width:195px;">Sarsted</td>
			<td style="width:119px;">67.754</td>
			<td>Cuvette for Zetasizer Nano ZS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Design-Expert(R) 8</td>
			<td style="width:195px;">Stat-Ease, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>DoE software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Disodium phosphate</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">&#160;4984.3&#160;</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Ferty 2 Mega</td>
			<td style="width:195px;">Kammlott</td>
			<td style="width:119px;">5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Forma -86C ULT freezer</td>
			<td style="width:195px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Greenhouse</td>
			<td style="width:195px;">n.a.</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>For plant cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Grodan Rockwool Cubes 10x10cm</td>
			<td style="width:195px;">Grodan</td>
			<td style="width:119px;">102446</td>
			<td>Rockwool block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length)</td>
			<td style="width:195px;">n.a. (custom design)</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>Heat exchanger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">HEPES</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">9105.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">K200P 60D</td>
			<td style="width:195px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">5302303</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">KS50P 60D</td>
			<td style="width:195px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">B12486</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Lauda E300</td>
			<td style="width:195px;">Lauda Dr Wobser GmbH</td>
			<td style="width:119px;">Z90010</td>
			<td>Water bath thermostat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">L/S 24</td>
			<td style="width:195px;">Masterflex</td>
			<td style="width:119px;">SN-06508-24</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:360px;">mAb 5.2</td>
			<td style="width:195px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:119px;">HB-9148</td>
			<td>Vax8 specific antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Masterflex L/S</td>
			<td style="width:195px;">Masterflex</td>
			<td style="width:119px;">HV-77921-75</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Miracloth</td>
			<td style="width:195px;">Labomedic</td>
			<td style="width:119px;">475855-1R</td>
			<td>Filter cloth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">MultiLine Multi 3410 IDS</td>
			<td style="width:195px;">WTW</td>
			<td style="width:119px;">WTW_2020</td>
			<td>pH meter / conductivity meter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Osram cool white 36 W</td>
			<td style="width:195px;">Osram</td>
			<td style="width:119px;">4930440</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Phytotron</td>
			<td style="width:195px;">Ilka Zell</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>For plant cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Sodium disulfit</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">8554.1</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:195px;">Carl Roth GmbH</td>
			<td style="width:119px;">P029.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:360px;">Stainless-steel vessel; 0.7-kg 2.0-L; height 180 mm; diameter 120 mm</td>
			<td style="width:195px;">n.a. (custom design)</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>Container for heat precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Synergy HT</td>
			<td style="width:195px;">BioTek</td>
			<td style="width:119px;">SIAFRT</td>
			<td>Fluorescence and spectrometric plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">VelaPad 60</td>
			<td style="width:195px;">Pall</td>
			<td style="width:119px;">VP60G03KNH4</td>
			<td>Filter housing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Zetasizer Nano ZS</td>
			<td style="width:195px;">Malvern</td>
			<td style="width:119px;">ZEN3600</td>
			<td>DLS particle size distribution measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Zetasizer Software v7.11</td>
			<td style="width:195px;">Malvern</td>
			<td style="width:119px;">n.a.</td>
			<td>Software to operate the Zetasizer Nano ZS device</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comparison of tobacco host cell protein removal methods by blanching intact plants or by heat treatment of extracts

Pflanzen bieten nicht nur Nahrung, Futter und Rohstoffen für Menschen, sondern auch als wirtschaftliche Produktionssystem für biopharmazeutischer Proteine, wie Antikörper, Impfstoffe und Enzymen entwickelt. Diese müssen von der pflanzlichen Biomasse gereinigt werden, sondern Chromatographieschritte werden durch die hohen Konzentrationen von Wirtszellproteinen (HCPs) in Pflanzenextrakten behindert. Jedoch aggregieren meisten HCPs irreversibel bei Temperaturen über 60 ° C erleichtert die anschließende Reinigung des Zielproteins. Hier werden drei Methoden vorgestellt, die Wärme Ausfällung von Tabak HCP entweder in intakten Blättern oder Extrakte zu erzielen. Das Blanchieren von intakten Blättern kann leicht in bestehende Prozesse integriert werden, aber negative Auswirkungen auf die nachfolgende Filtrationsschritte haben können. Das Gegenteil ist für die Wärme Ausfällung von Blattextrakten in einem Rührkessel wahr, der die Performance des Downstream-Aktivitäten, wenn auch mit großen Veränderungen in Prozessanlagen Design verbessern können, wie zum BeispielHomogenisator Geometrie. Schließlich wird ein Wärmetauscher-Setup auch im Hinblick auf die Wärmeübergangsbedingungen und leicht zu Skala gekennzeichnet, aber die Reinigung kann schwierig sein, und es kann einen negativen Einfluss auf die Filterkapazität sein. Das Design-of-Experimente Ansatz können die meisten relevanten Prozessparameter beeinflussen HCP Entfernung und Produktgewinnung zu identifizieren. Dies erleichtert die Anwendung der einzelnen Methoden in andere Expressionsplattformen und die Identifizierung der am besten geeignete Methode für eine gegebene Reinigungsstrategie.

Wärme Fällung von Tabakwirtszellproteine ​​durch blanchiert Die blanchiert Verfahren in Abschnitt 2 beschrieben, wurde erfolgreich verwendet HCP auszufällen von Tabak mit 70 ° C verlässt, um 96 ± 1% des TSP reduziert (n = 3) während der Genesung zu 51% des Vax8 Zielproteins auf, damit seine zunehmende Reinheit von 0,1% bis 1,2% vor der chromatographischen Trennung 16. Es war auch möglich, 83 ± 1% wiederherzustellen (n = 3) des fluoreszierenden Prot...

Watch this Scientific Journal Video about Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts at JoVE.com

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Drei Wärmefällungsverfahren vorgestellt werden, die effektiv mehr als 90% der Wirtszellproteine ​​(HCP) von Tabak entfernen Extrakte vor jeder anderen Reinigungsschritt. Die Anlage HCPs aggregieren irreversibel bei Temperaturen über 60 ° C.

Vergleich von Tabakwirtszellprotein Abbaumethoden von Intact Pflanzen oder Blanchieren durch Wärmebehandlung von Extrakten

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

comparison-tobacco-host-cell-protein-removal-methods-blanching-intact

Research

JoVE Journal

Biology

9.0K Aufrufe.  Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V..  Drei Wärmefällungsverfahren vorgestellt werden, die effektiv mehr als 90% der Wirtszellproteine ​​(HCP) von Tabak entfernen Extrakte vor jeder anderen Reinigungsschritt. Die Anlage HCPs aggregieren irreversibel bei Temperaturen über 60 ° C. 

Serie: Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Forschung

Biologie

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Vorbereitung und Fraktionierung von Xenopus laevis Egg Auszüge

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

Erkennung von Post-translationale Modifikationen auf Native Intact Nukleosomen mittels ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Die MultiBac Protein Complex Produktion Platform am EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Erzeugung transgener<em&gt; Hydra</em&gt; Durch Mikroinjektion Embryo

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Glucocorticoid-Analyse: Nicht-invasive Monitoring-Adrenal in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DAMiD-seq: Genomweite Mapping von Protein-DNA-Wechselwirkungen von Hochdurchsatz-Sequenzierung von Adenin-methylierten DNA-Fragmenten

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Vergleich von drei verschiedenen Methoden zur Bestimmung Zellproliferation in Brustkrebs-Zelllinien

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...