Dieses Protokoll beschreibt ein zuverlässiges und effizientes Reverse-Genetik-System zur Herstellung rekombinanter Rotaviren. Es erklärt auch, wie rekombinante Rotaviren herzustellen sind, die fluoreszierende Markerproteine ausdrücken. Diese Methode ist einfach und erfordert eine minimale Anzahl von Plasmiden und kann rekombinante Rotaviren erzeugen, die separate Fluorproteine sowie virale Proteine exprimieren.
Beginnen Sie mit der Aussaat von BHKT7-Zellen auf 12-Well-Platten. Spülen Sie eine frisch konfluente Monoschicht von Zellen mit PBS. Dann die Monoschicht mit Trypsin-EDTA-Lösung stören und die Zellen in fünf Milliliter GMEM-Gesamtmedium wieder aussetzen.
Bestimmen Sie die Konzentration lebensfähiger BHKT7-Zellen mit Trypanblau und einem automatisierten Zellzähler. Dann samen Sie zwei mal 10 bis die fünften Zellen in einem Milliliter GMEM in jeden Brunnen einer 12-Well-Zellkulturplatte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator über Nacht.
Bereiten Sie am nächsten Tag die Plasmidmischung für die Transfektion nach Manuskriptanweisungen vor. Dann fügen Sie 110 Mikroliter vorgewärmt reduziertes Serummedium zu jeder Plasmidmischung und sanft Pipette nach oben und unten zu mischen. Fügen Sie 32 Mikroliter Transfektionsreagenz in die Mischung ein.
Führen Sie eine kurze Zentrifugation nach Wirbeln durch und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 20 Minuten lang. Spülen Sie die BHKT7-Zellen mit zwei Millilitern GMEM unvollständigem Medium. Fügen Sie jedem Brunnen einen Milliliter SMEM-Unvollständiges Medium hinzu und geben Sie die Platte an den Inkubator zurück.
Verwenden Sie nach der 20-minütigen Inkubation einen 200-Mikroliter-Pipettor, um die Transfektionsmischung Tropfen für Tropfen zu jedem Brunnen hinzuzufügen. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig und bringen Sie sie zum Inkubator zurück. Zwei Tage nach der Transfektion eine frisch konfluente Monoschicht von MA104-Zellen mit PBS abspülen.
Die Monoschicht mit Trypsin-EDTA-Lösung unterbrechen und die Zellen in fünf Milliliter DMEM-Gesamtmedium wieder aussetzen. Zählen Sie die Zellen und passen Sie die Konzentration auf acht mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter DMEM unvollständiges Medium an. Fügen Sie 0,25 Milliliter MA104-Zellen tropfenweise zu den Brunnen mit den transfizierten BHKT7-Zellen hinzu.
Stellen Sie die Konzentration von Trypsin auf 0,5 Mikrogramm pro Milliliter ein, indem Sie jedem Brunnen 0,8 Mikroliter zu einem Milligramm pro Milliliter Trypsin-Stammlösung hinzufügen. Verdünnen Sie die verbleibenden MA104-Zellen auf eine Konzentration von 1,5 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter in DMEM-Gesamtmedium und legen Sie zwei Milliliter in jeden Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte. Sechs Tage nach der Transfektion, erholen Sie das rekombinante Virus aus den transfizierten Zellen.
Untersetzen Sie die BHKT7 MA104-Zellen drei Zyklen Deshinaus/Tauens unter sterilen Bedingungen, indem Sie die Platten zwischen einem negativen Gefrierschrank von 20 Grad Celsius und Raumtemperatur bewegen. Transferlysate auf 1,5 Milliliter-Rohre. Zentrifugieren Sie die Rohre für 10 Minuten bei 500 mal g und vier Grad Celsius, um den zellulären Schmutz zu pellet.
Sammeln Sie den Überstand und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius. Fügen Sie Trypsin zu 100 Mikroliter geklärten Zelllysat zu einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Bereiten Sie dann eine 10-fache serielle Verdünnungsserie von 10 bis 10 bis 10 bis zur negativen Sieben im DMEM-Unvollständigen Medium vor.
Spülen Sie die MA104 Monolayer zweimal mit zwei MilliliterPBS und einmal mit DMEM unvollständigem Medium. Fügen Sie 400 Mikroliter Lysatverdünnungen in doppelter Weise zu den Platten hinzu und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, wodurch alle 10 bis 15 Minuten geschaukelt wird, um die Verdünnungen über die Monoschicht umzuverteilen. Bereiten Sie eine Agarose MEM-Overlay-Lösung vor, indem Sie gleiche Volumina von vorgewärmtem 2X EMEM mit 1,5% geschmolzener und gekühlter Agarose kombinieren.
Bewahren Sie diese Lösung bei 42 Grad Celsius in einem Wasserbad auf und passen Sie die Trypsinkonzentration unmittelbar vor dem Aufstellen auf die Zellen auf 0,5 Mikrogramm pro Milliliter an. Aspirieren Lysat Verdünnungen aus der Sechs-Well-Platte. Dann spülen Sie die Zellen einmal mit zwei Milliliter unvollständigen Medium.
Fügen Sie in jedem Brunnen vorsichtig drei Milliliter der Agarose-MEM-Overlay-Lösung auf die Zellmonolayer ein. Lassen Sie die Agarose bei Raumtemperatur aushärten. Dann geben Sie die Platten zum Inkubator zurück.
Drei Tage später bereiten Sie eine Agarose MEM-Overlay-Lösung wie zuvor beschrieben vor und fügen Sie neutrales Rot einer Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter unmittelbar vor Gebrauch hinzu. Fügen Sie zwei Milliliter der Overlay-Lösung auf die vorhandene Agarose in die Sechs-Well-Platten. Lassen Sie die Agarose aushärten und geben Sie die Platte an den Inkubator zurück, um sicherzustellen, dass die Platten mit neutralem Rot vor Licht geschützt werden.
Identifizieren Sie in den nächsten sechs Stunden Rotavirus-Plaques mit Hilfe eines Leuchtkastens. Verwenden Sie Einweg-Transferpipetten, um klar definierte Plaques auszuwählen und Agarose-Stecker zu bergen, die sich vollständig auf die Zellschicht erstrecken. Den Stecker in ein 1,5-Milliliter-Rohr mit 0,5 Milliliter DMEM-Unvollständigem Medium austreiben und die Probe 30 Sekunden lang wirbeln lassen.
Verstärken Sie das Plaque isolierte Virus, das durch Vermehrung auf MA104-Monolayern oder AT25-Kolben mit DMEM-Unvollständigem Medium und 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Trypsin in das Medium eluiert wird. Fügen Sie 600 Mikroliter geklärter infizierter Zelllysate und 400 Mikroliter Guanidiniumthiocyanat in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren ein. Wirbeln Sie sie für 30 Sekunden und inkubieren sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten.
Dann 200 Mikroliter Chloroform hinzufügen. Wirbeln Sie die Lösung für 30 Sekunden und inkubieren Sie es für drei Minuten. Nach einer fünfminütigen Mikrozentrifugation bei 13.000 mal g und vier Grad Celsius 550 Mikroliter der oberen wässrigen Phase in ein frisches Rohr geben.
Fügen Sie zwei Volumina kalten Isopropylalkohol hinzu und invertieren Sie das Rohr vier- bis sechsmal. Inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Dann zentrifugieren Sie es für 10 Minuten bei 13.000 mal g und vier Grad Celsius.
Entsorgen Sie den Überstand, der das RNA-Pellet verlässt. Waschen Sie die RNA, indem Sie der Röhre einmal einen Milliliter 75% Ethanol hinzufügen und sie fünf Minuten lang bei 7, 500 mal g und vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach sorgfältiger Entfernung des Ethanols die RNA fünf bis zehn Minuten trocknen lassen.
Dann lösen Sie das Pellet in 15 Mikroliter Nuklease freies Wasser. Fügen Sie zwei Mikroliter 6X DNA-Ladepuffer zu 10 Mikroliterderder gelöster RNA-Probe hinzu. Legen Sie es auf ein vorgegossenes 10%Polyacrylamid Mini-Gel.
Lösen Sie die RNAs durch Elektrophorese im Tris-Glycin-Laufpuffer für zwei Stunden unter einem konstanten 16 Milliamperestrom auf. Sobald der Gellauf abgeschlossen ist, tränken Sie das Gel fünf bis zehn Minuten in Wasser, das ein Mikrogramm pro Milliliter Ethidiumbromid enthält, und detektieren Sie die Genomsegmente des Rotavirus mit einem UV-Transilluminator. Dieses Reverse-Genetik-Protokoll wurde verwendet, um rekombinante SA11-Viren zu erzeugen, die leicht mit einem Plaque-Assay an MA104-Zellen identifiziert werden können, der eine Plaque-Isolierung ermöglicht.
Die dsRNA-Genome von Plaque-gereinigtem rSA11-Wildtyp und SA11-UnaG-Viren wurden mit einer Lösung extrahiert, die Phenol und Guanidiniumthiocyanat enthält, durch Elektrophorese auf einem 10%polyacrylamiden Gel gelöst und durch Färbung mit Ethidiumbromid nachgewiesen. Wie erwartet, migrierte das Segment sieben oder NSP3 dsRNA von rSA11-UnaG aufgrund des Vorhandenseins von 2A-3xFLUnaG-Sequenzen viel langsamer als das des rSA11-Wildtyps. Um die Expression des UnaG-Fluoreszenzproteins zu überprüfen, wurden MA104-Zellen mit Wildtyp und rekombinantem Virus infiziert und mit einem LebendenZellbilder untersucht.
Die Analyse zeigte, dass rSA11-UnaG grüne Fluoreszenz erzeugte, während keine Fluoreszenz in Zellen nachgewiesen wurde, die mit rSA11-Wildtyp infiziert waren. Immunoblot-Analyse wurde durchgeführt, um zu untersuchen, ob das 2A-Element von rSA11-NSP3-2A-xflUnaG die Expression von zwei separaten Proteinen förderte. Die Analyse ergab, dass NSP3-2A und 3xFL-UnaG tatsächlich als separate Proteine exprimiert wurden, die auf ein funktionelles 2A-Element hindeuten.
Für die erfolgreiche Wiederherstellung des rekombinanten Rotavirus ist es wichtig, hochwertige, gut erhaltene BHKT7-Zellen für die Transfektion und MA104-Zellen für übersaate sowie genaue Mengen hochreiner Plasmide zu verwenden. Obwohl in diesem Protokoll erklärt wird, wie das Rotavirus-NSP3-Gen mithilfe des Reverse-Genetik-Systems geändert wird, kann derselbe Ansatz verwendet werden, um andere Gene wie SP1 zu modifizieren.
