Die Autoren möchten Chao Cui danken, Etage de Kort, Esther Stoop und Ralph Carvalho für Bilder in Abbildung 4, Ulrike Nehrdich und Davy de Witt für Fische Pflege, Labor und andere Mitglieder für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wird durch die Smart-Mix des niederländischen Wirtschaftsministeriums und des Ministeriums für Bildung, Kultur und Wissenschaft, der Europäischen Kommission 7. Rahmenprogramm Projekt ZF-Health (HEALTH-F4-2010-242048), das Europäische Marie-Curie unterstützt Initial Training Network FishForPharma (PITN-GA-2011-289209), und von der australischen NHMRC (637.394). Das australische Institut für Regenerative Medizin wird durch Zuschüsse der Regierung des Bundesstaats Victoria und der australischen Regierung unterstützt.

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Biol. 7, 42-42 (2007).</li><li>Gray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+intravital+imaging+of+macrophage+and+neutrophil+behaviour+during+inflammation+using+a+novel+transgenic+zebrafish.">Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish.</a> Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Infektion Methoden in diesem Artikel beschrieben werden häufig verwendet, um die Funktion des Host angeborenen Immunität Gene oder bakteriellen Virulenz-Gene 1 studierst. Die intravenöse Injektion Mikro-Methoden (Protokolle 5 und 6.1) werden am häufigsten für solche Untersuchungen eingesetzt. Die Schwanzvene Blut an der hinteren Insel ist die bequemste Lage für die intravenöse Injektion von 1-Tage alten Embryonen. Da die Schwanzvene wird es schwieriger, in späteren Phasen durchdringen, bevorzugen wir den Kanal von Cuvier als intravenöse Injektion Standort für Embryonen bei 2-3 dpf. In allen Fällen ist es entscheidend, um die Embryonen mit gleichbleibender Anzahl von Bakterien, die durch Plattieren Injektion Inokula für cfu Zählung überprüft werden sollte zu injizieren. Die folgenden Aspekte zu berücksichtigen, um reproduzierbare Injektionen zu erreichen. Erstens ist es wichtig, hochwertige Glas-Mikrokapillare Injektionsnadeln haben. Wenn die Nadelspitze zu groß ist, wird die Injektion einen Reifenschaden Loch groß genug für Blutungen auftreten, erstellen unddie injizierten Bakterien austreten wird der Blutkreislauf. Zweitens muss Bakterien direkt in den Blutkreislauf injiziert werden. Wenn die Nadelspitze ist nicht im Inneren der Vene oder wenn Injektionsflüssigkeit Spreads in den Dottersack Verlängerung, muss der Embryo aus dem Experiment verworfen werden. Drittens, mit PVP40 als Träger zum Einspritzen M. marinum wird verhindert, dass die Bakterien vor dem Versinken in der Glas-Nadel zu unterstützen. PVP40 verbessert die Homogenität der Suspension, was zu mehr reproduzierbare Inokula während der gesamten Dauer der Injektionen. PVP40 kann auch verwendet werden für S. typhimurium Injektionen, aber hier ist es weniger wichtig, weil die größere Größe und helle Fluoreszenz der Bakterien ermöglicht eine visuelle Kontrolle über die Injektion Inokulum während der Experimente. Zum Üben der Injektionen empfehlen wir die Verwendung von Phenol roten Farbstoff (1% v / v) oder 1 um fluoreszierende Kugeln in verschiedenen Farben erhältlich (Invitrogen). Sobald die Technik beherrscht wird, dauert es etwa 30 minutES zu injizieren 50-100 Embryonen, einschließlich der Zeit zum Ausrichten der Embryonen auf Agarose-Platten und das Einstellen der bakteriellen Injektionsvolumen erforderlich. Während die intravenöse Injektionen in das Blut Insel (Protokoll 5) oder in den Kanal von Cuvier (Protokoll 6.1) am häufigsten verwendet werden, haben die alternativen Routen von Infektionen in diesem Video Artikel beschrieben bewährt, Makrophagen und Neutrophilen-Chemotaxis zu studieren (Protokolle 6.2, 6.3 und 6.4), um das Wachstum von abgeschwächten Bakterienstämmen (Protokoll 6.5) zu studieren, und um das Zebrafisch-Infektion Modell für Anwendungen mit hohem Durchsatz (Protokoll 6.6) 8.4 anzupassen. Die Mikroinjektion beschriebenen Verfahren können auch zur Injektion von Viren 18, 19, Pilzsporen 14, 20 oder Protozoen-Parasiten (Maria Forlenza, persönliche Mitteilung) aufgebracht werden. Eine sinnvolle Ergänzung zu den Injektions-Verfahren in diesem Artikel beschriebenen Video ist ein erst kürzlich beschriebenen Verfahren für die subkutane Injektion von Bakterien in zebrafish Embryonen 21. Dieses Verfahren angewendet wurde, um die Phagozytose von Bakterien durch Neutrophile, die effizient verschlingen Bakterien auf Gewebeoberflächen wurden gefunden, aber zu studieren, im Gegensatz zu Makrophagen, waren praktisch nicht Bakterien nach der Injektion phagozytieren in das Blut oder in mit Flüssigkeit gefüllten Körperhöhlen. Für subkutane Injektionen Embryonen positioniert sind ähnlich wie bei den Schwanz Muskel Injektionen in diesem Video-Artikel beschrieben, aber die Nadel direkt unter die Haut eingesetzt, um die Bakterien über einen Somiten zu injizieren. Es ist wichtig zu beachten, dass der Mikroinjektion im wesentlichen eine künstliche Infektionsweg. Allerdings sind frühe Embryonen sehr robust gegen äußere Exposition gegenüber bakteriellen Erregern. In der Tat sind Eintauchen Assays, in denen die Embryonen in einer Bakteriensuspension getaucht werden, nicht reproduzierbar in der Hand 22. Während einige Embryonen können sich infizieren beim Eintauchen, haben wir eine große Variation in der Mortalitätsraten und in der ausdrücklichen beobachtetion von entzündlichen Marker-Gene zwischen einzelnen Embryonen in solchen Assays. Die Mikro-Injektion Methoden in diesem Artikel beschriebenen erreichen reproduzierbare Infektionen und sind besonders nützlich, um bakterielle Interaktionen mit Host-Zellen des angeborenen Immunsystems zu untersuchen. Ein effizienter Ansatz für die bakterielle Infektion in einzelnen Embryonen zu quantifizieren ist, die Fluoreszenz-Bilder von infizierten Embryonen mit maßgeschneiderten, dedizierten Pixel Quantifizierung Software 17, 23 zu analysieren. Dieser Ansatz hat sich gezeigt, eine gute Korrelation mit den Ergebnissen der Keimzahlen nach dem Ausplattieren der infizierten Embryonen. In ähnlicher Weise haben relative Veränderungen in Leukozyten-Zahlen pro Embryo durch digitale Bildanalyse in transgenen Leukozyten-Fluorophor Reporter Linien quantifiziert worden; dieser Ansatz anwendbar wäre, um die Quantifizierung der Host leukopoietische Reaktion auf eine Infektion 24. Die Funktion des angeborenen Immunsystems Host-Gene lassen sich effizient in vivo untersucht werden, durch die Kombination der beschriebenen Modelle Infektionmit Morpholino Knockdown. Morpholinos sind synthetische Antisense-Oligonukleotide, die spezifische RNAs ausgerichtet und zur Verringerung der Expression der Genprodukte, wenn sie in 1-Zellen-Stadium Zebrafisch-Embryonen injiziert wie in anderen Video Artikel in dieser Zeitschrift 10, 25 gezeigt. In Morpholino Knockdown Studien ist es von großer Bedeutung, dass alle Embryos zu vergleichenden Gruppen richtig inszeniert vor der bakteriellen Injektionen. Dies ist besonders wichtig, da Embryonen eine sich entwickelnde Immunsystem, die zunehmend im Laufe der Zeit wird zuständigen haben. Es gibt verschiedene transgene Reporter Linien derzeit zur Verfügung stehen die wichtigsten angeborenen Immunsystems Teilmengen, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten, in Zebrafisch-Embryos zu unterscheiden. Der MPX und Lyz Promotoren wurden verwendet, um neutrophile Reporter Linien 16, 26, 27 erzeugen, und die CSF1R (FMS) und MPEG1-Promotoren wurden verwendet, um zu produzieren Makrophagen-Reporter 14, 28. Während CSF1r (fms) zusätzlich in Xanthophoren ausgedrückt, MPEG1 Expression ausschließlich in Makrophagen. Wie in diesem Video-Beitrag gezeigt, sind die neu entwickelten MPEG1 Reporter Linien sehr nützlich für bildgebende bakterielle Phagozytose durch Makrophagen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Lieferant </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Phenolrot </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td></tr><tr><td> Glycerin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 228210 </td></tr><tr><td> Difco Middlebrook 7H10 Agar </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 262710 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook OADC Enrichment </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 211886 </td></tr><tr><td> Difco Middlebrook 7H9 Bouillon </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 271310 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook ADC Enrichment </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 211887 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidon (PVP40) </td><td> Calbiochem, Merck KGaA </td><td> 529504 </td></tr><tr><td> N &lt;/ Em&gt;-Phenylthioharnstoff (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td></tr><tr><td> Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonatsalz (Tricaine) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> Methylcellulose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0387 </td></tr><tr><td> SeaPlaque Agarose (Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt) </td><td> Lonza Inc. </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 mu m, rot fluoreszierende (580/605)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8821 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 mu m, gelb-grün fluoreszierend (505/515)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8823 </td></tr></tbody></table>

infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens

Zebrafisch (Danio rerio) Embryonen werden zunehmend als ein Modell zur Untersuchung der Funktion des Wirbeltier angeborenen Immunsystems im Wirt-Pathogen-Interaktionen 1 verwendet. Die wichtigsten Zelltypen des angeborenen Immunsystems, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten, in den ersten Tagen der Embryogenese vor der Reifung von Lymphozyten, die für adaptive Immunantworten benötigt werden, zu entwickeln. Die Leichtigkeit, an eine große Zahl von Embryonen, deren Zugänglichkeit durch äußere Entwicklung, die optische Transparenz der Embryonal-und Larvenstadien, ein breites Spektrum an genetischen Werkzeugen, umfangreiche Ressourcen und Mutanten-Sammlungen von transgenen Reporter Linien, die alle auf die Vielseitigkeit des Zebrafisch hinzufügen Modell. Salmonella enterica Serovar Typhimurium (S. typhimurium) und Mycobacterium marinum kann intrazellulär wohnen in Makrophagen und werden häufig verwendet, um Wirt-Pathogen-Interaktionen in Zebrafisch-Embryos zu studieren. Die Infektion dieser beiden Prozessebakterielle Erreger sind interessant zu vergleichen, weil S. typhimurium Infektion akut und tödlich innerhalb eines Tages, während M. marinum Infektion chronisch und kann bis zum Larvenstadium 2, 3 abgebildet werden. Der Standort der Mikro-Injektion von Bakterien in den Embryo (Abbildung 1) legt fest, ob die Infektion rasch zu systemischen oder wird zunächst lokalisiert bleiben. Eine schnelle systemische Infektion kann gegründet werden durch Mikro-Injektion von Bakterien direkt in den Blutkreislauf über die Schwanzvene Blut an der hinteren Insel oder über den Kanal von Cuvier, eine weite Verbreitung Kanal auf dem Dottersack verbindet das Herz mit dem Stamm Gefäßsystem. Bei 1 dpf, wird, wenn Embryonen in diesem Stadium phagocytically aktiven Makrophagen haben aber Neutrophile sind noch nicht ausgereift, Einspritzen ins Blut Insel bevorzugt. Für Injektionen bei 2-3 dpf, wenn Embryonen auch funktionelle (Myeloperoxidase-produzierenden) Neutrophile, entwickelte der Kanal von Cuvier als t bevorzugter an der Injektionsstelle. Um gerichtete Wanderung von myeloischen Zellen gegenüber lokalen Infektionen zu studieren, können Bakterien in den Schwanz Muskel-, Ohr-Vesikel, oder Hinterhirn Ventrikel 4-6 injiziert werden. Darüber hinaus ist die Chorda, eine Struktur, die normalerweise nicht zugänglich myeloischen Zellen erscheint, ist sehr anfällig für lokale Infektion 7. Eine sinnvolle Alternative für Anwendungen mit hohem Durchsatz ist die Injektion von Bakterien in den Dotter von Embryonen innerhalb der ersten 8 Stunden nach der Befruchtung. Die Kombination fluoreszierende Bakterien und transgenen Linien mit fluoreszierender Zebrafisch Makrophagen oder Neutrophilen schafft ideale Voraussetzungen für Multi-Color-Imaging von Wirt-Pathogen-Interaktionen. Dieses Video Artikel wird detaillierte Protokolle für die intravenöse und lokale Infektion von Zebrafisch-Embryos mit S. beschreiben typhimurium oder M. marinum Bakterien und für die anschließende Fluoreszenz-Imaging von der Interaktion mit Zellen des angeborenen Immunsystems.

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Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Transparente Zebrafischembryonen haben nützliches Modell Gastgeber zu visualisieren und funktionell Studie Wechselwirkungen zwischen Zellen des angeborenen Immunsystems und intrazelluläre bakterielle Erreger wie bewiesen<em&gt; Salmonella typhimurium</em&gt; Und<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt;. Mikro-Injektion von Bakterien und Multi-Color-Fluoreszenz-Imaging sind wesentliche Techniken bei der Anwendung von Modellen Zebrafischembryo Infektion beteiligt sind.

Die Infektion von Zebrafisch-Embryos mit Intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

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Immunology and Infection

43.4K Aufrufe.  Leiden University. Transparente Zebrafischembryonen haben nützliches Modell Gastgeber zu visualisieren und funktionell Studie Wechselwirkungen zwischen Zellen des angeborenen Immunsystems und intrazelluläre bakterielle Erreger wie bewiesen Salmonella typhimurium Und Mycobacterium marinum. Mikro-Injektion von Bakterien und Multi-Color-Fluoreszenz-Imaging sind wesentliche Techniken bei der Anwendung von Modellen Zebrafischembryo Infektion beteiligt sind.