Die Autoren möchten Malinda Spry für die technische Unterstützung danken. Wir haben auch aktuelle und frühere Finanzierungsquellen zu bestätigen: das National Cancer Institute (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), der Wendy Will Fall Cancer Research Fund, der Markey Cancer Foundation, die Kinder-Wunder-Netz und die Jennifer und David Dickens Melanoma Research Foundation.

1. Herstellung von Forskolin für die topische Verabreichung von einem Rohöl-Wurzel-Extrakt der Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii) Pflanzen <ol><li> Protokolle für Maus-Experimente folgten die Leitlinien für ethisches Verhalten in der Pflege und Verwendung von Tieren und wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der Universität von Kentucky (Protokoll # 00768M2004) zugelassen. Der Wurzelextrakt wird bei 40% Gewicht / Volumen in einem Standard dermatologische Grund 70% Ethanol, 30% Propylenglykol. </li><li> Wiegen Sie 200 g rohe Forskolin-Wurzel-Extrakt und übertragen sie in ein Becherglas. Zu 500 ml einer 40% (w / v) Lösung zu resuspendieren 200 g rohes Forskolin Wurzelextrakt durch Zugabe meisten, aber nicht das gesamte Volumen des Fahrzeugs (70% Ethanol, 30% Propylenglykol) und bringen die Lösung etwa 450 ml. </li><li> Rühre eine Stunde bei Raumtemperatur. Die Lösung wird etwas viskos sein und manuellen Rühren auf &quot;Lift&quot; der Extrakt in Lösung vor erforderlichder Rührstab in der Lage ist, zu übernehmen. </li><li> Nach einer Stunde Rühren wurde die Mischung in einen Meßzylinder und bringe das Volumen auf 500 ml mit Fahrzeug, das verwendet wurde, um &quot;ausspülen&quot; Becherglas, das verwendet wurde, um die Aufschlämmung zu rühren (zu Rückgewinnung von Forskolin aus dem Becherglas zu maximieren) . </li><li> Übertragen der Aufschlämmung auf 50 ml Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen. Zentrifuge (1.500 g, Raumtemperatur, 15 min) mit einer Tischzentrifuge. An diesem Punkt wird das unlösliche Material ziemlich verdichtet werden, so dass der Überstand leicht abgegossen werden. </li><li> Die Lösung wird durch ein 0,22 um-Celluloseacetat-Membran, um restliches unlösliches Material aus dem Extrakt zu entfernen. Wir verwenden eine Flaschenaufsatz-System für die Zellkultur entwickelt, zusammen mit der Verwendung von Pre-Filter, die mit dem Gerät kommen, um ein vorzeitiges Verstopfen der Membran von unlöslichen Bestandteilen des Wurzelextrakt zu verhindern. Bei der Herstellung großer Mengen des Extraktes, das Filter etwa 100 ml in einer Zeit, die Änderung der Vorfilter Wetteschen jedes zusätzliche Volumen. </li><li> Wenn sie bei Raumtemperatur gelagert, der Extrakt hält biologische Aktivität für bis zu einem Jahr. </li></ol> 2. Vorbereitung der C57Bl / 6 K14-SCF-Mäuse für topische Behandlungen <ol><li> Entfernen dorsale Fell von den Tieren durch elektrische Scheren. Kurz gesagt, die Tiere zu betäuben mit inhalativen Isofluran Scher von Rückenfell mit Elektroschere mit einer 0,25 mm chirurgischen Vorbereitungs Kopf (Fisher Scientific) ausgestattet erleichtern. Vorzugsweise jeweils nur eine Art der Anästhesie (zB Ketamin / Xylazin) um das Risiko von Narkosedosis zu minimieren. Die gesättigte Inhalationskammer Berufsrisiko trägt, wenn sie außerhalb einer Abzugshaube verwendet und liefert unbekannten Mengen von Narkose zu Tieren. Idealerweise ein Präzisions Verdampfer verwendet werden. </li><li> Um Resthaarstoppeln zu entfernen, die Pflege der Tiere mit einem chemischen Enthaarungscremes. Anästhesie verabreichen, um das Tier mit einer ip Injektion von Ketamin 40 mg / kg Xylazin und 4 mg / kg </li&gt; <li> Sobald die Tiere angemessen (wie von Zehe Prise beurteilt) anästhesiert, gelten eine Fingerspitze große Menge Enthaarungscreme zu scherRückenHaut mit einem behandschuhten Finger. Reiben Sie die Creme in die Haut für 30-60 Sekunden oder bis Haare deutlich in der Creme zu sehen, wie es wird, bewegt werden. Lassen Sie die Creme auf die nur für die Mindestzeit für die Haarentfernung erforderlich, da bei längerer Exposition führt zu chemischen Verbrennungen der Haut, der Epidermis Zusammenbruch und Tod aus dem Verlust der epidermalen Integrität. </li><li> Wischen Sie die Rückenhaut mit Wasser getränkten Gaze-Pads wiederholt, bis alle Creme entfernt wurde. Trocken Tiere mit weichen Papierhandtücher, und es ihnen ermöglichen, in einem warmen abgeschiedenen Lage (z. B. saubere Käfige auf einem Erwärmung Pad platziert) zu erholen. Enthaaren die Tiere ein-by-one und während des gesamten Verfahrens sorgfältig überwachen. </li></ol> 3. Die topische Verabreichung von Forskolin oder Vehicle Control <ol><li> Die Tiere sollten behandelt ein zu einer Zeit werden. Kurz mit einatmen betäubend Isofluran indem Sie die Maus auf einer form-Nylon luftdurchlässige Filter, unter denen wurde eine Isofluran-gesättigten Papiertuch in einem gesättigten Isofluran-Deckel klare Glas in einem Abzug gebracht. Setzen Sie die Maus, um Isofluran für eine ausreichende Zeit, um freiwillige Muskelbewegungen zu unterdrücken, sondern um Spontanatmung (in der Regel 10 bis 20 sec) zu bewahren. Verlassen Sie das Tier in Isofluran zu lang wird in der Atemunterdrückung und zum Tod führen. Es ist besser, auf der Seite des &quot;going Licht&quot; und mit neu setzen die Maus kurz auf mehr Isofluran und nicht an überbelichtet, das Tier auf die Droge und Risiko Tod irren. </li><li> Entfernen Sie das Tier aus der Isofluran-Kammer und legen auf eine saubere, saugfähige Unterlage Bank. </li><li> Mit einer 1000 ul Mikropipette mit einem Einweg-Polypropylen-Spitze ausgestattet, erarbeiten 400 ul von 40% Rohprotein Forskolinextrakt (Fahrzeugkontrolltiere werden mit 70% Ethanol, 30% Propylenglykol allein zu empfangen). </li><li> Übertragen Sie das Extrakt auf dieRücken des Tieres durch Eintropfen es auf die Haut und dann unter Verwendung der Seite der Pipettenspitze, Abstrich der Extrakt über die Rückenhaut bis die gesamte Haut bedeckt. Es besteht keine Notwendigkeit, um die Haut nach der Anwendung auslöschen. </li><li> Bringen Sie die Maus, um seinem Käfig, und genau zu beobachten, bis er aus der Narkose erholt. </li><li> Damit nicht-Pigment cAMP Effekte sollten nicht verwechseln UV-Empfindlichkeit Experimente, brechen alle topische Behandlungen 2 Tage vor der UV-Exposition (Pigment Wirkung hält über mehrere Tage letzten topischen Behandlung). </li></ol> 4. Hautfarbe Messung durch reflektierende Farbmetrik <ol><li> Kurz betäuben die Maus mit inhalativen Isofluran (siehe oben). </li><li> Kalibrieren Sie einen Minolta-Kolorimeter, indem Sie den beweglichen Kopf auf dem standardisierten weiße Fläche mit dem Farbmessgerät zur Verfügung gestellt. </li><li> Setzen Sie den tragbaren Messkopf des Colorimeter bündig mit der Rückenhaut des Tieres sicherzustellen, dass die 1 cm 2 runde AperturE ist vollständig auf die Haut gedrückt. Nehmen Sie sich mindestens drei separate Messungen in verschiedenen Bereichen der Rückenhaut. </li><li> Berechnung der mittleren L *-Score ± SD pro Tier und pro Behandlungsgruppe. Reflexionsfarbmessung kann an jeder Stelle in dem Experiment durchgeführt werden. </li></ol> 5. Bestimmung der UV-Empfindlichkeit durch Berechnung der &quot;Minimal Erythematöse Dose&quot; (MED) <ol><li> Verwenden Sie Tiere, die entweder mit Fahrzeug oder Forskolin, wie oben beschrieben vorbehandelt wurden. Betäuben Tiere intraperitoneale Injektion einer Standardmischung von Ketamin und Xylazin (siehe oben). </li><li> Bereiten Sie ein Stück UV-Verschlussband für MED-Tests. Um Löcher in der Band zu erzeugen, verwenden Sie einen schweren Locher mit einem 1 cm 2 kreisförmigen Ausschnitt (2A und B). Löcher mit definierter Größe und symmetrische Anordnung in dem Band erleichtert das Erkennen von Veränderungen der Haut nach Bestrahlung. In jedes Loch in der Band, eine kleine, aber leicht lösbare Stück<html> der Band, die zu definierten Zeitpunkten während der UV-Belichtung entfernt kann die Verwaltung von verschiedenen UV-Dosen zu ermöglichen. </li><li> Sobald die Tiere ausreichend sediert, legen Sie das Band auf der Rückenfläche. Augen Schmiermittel sollte immer unter Vollnarkose eingesetzt werden. </li><li> Schalten Sie die UV-Quelle, die aus zwei Westinghouse F15T8UV-B-Lampen mit einer Spitzenleistung von 313 nm und einem Bereich von 280-370 nm liegt. Lassen Sie die Lampe auf eine konstante UV-Leistung ins Gleichgewicht wie von einem UV-Photometer mit einem UVB Sensor gemessen (dauert in der Regel ein paar Minuten für die Lampen, um sich aufzuwärmen). </li><li> Auf der Grundlage der UV-Durchlässigkeitsrate, wie durch die UV-Photometer gemessen wird, zu berechnen UV-Belichtungszeit für jede gewünschte Dosis. Zum Beispiel, UVB-Ausstoß Maßnahmen unserer Lampe 2,4 mW / cm 2. Daher zu verabreichen 5 kJ / m 2 wäre die Haut benötigen, um 208 sec der UVB-Strahlung (die 3 min und 28 s ist), wie nachstehend berechnet ausgesetzt werden: upload/50670/50670eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Zeigen sediert Tiere (jeweils mit Verschlussband in place) Bauchfläche nach unten, auch UV-Bestrahlung zu gewährleisten. Um die gewählten Dosierungen von UV-Strahlung zu verabreichen, nacheinander entfernen Sie die kleine Verschlussbänder für die Löcher auf 1 cm an die richtigen Dosen von Strahlung aus zwei Bereichen der Haut. Daher kann unter Verwendung des obigen Beispiels, wenn 40 kJ / m 2 ist die größte Dosis in dem Experiment, dann das Tier unter der Lampe für 27 Min. und 47 Sek. insgesamt und der Haut in der 40 kJ / m 2 Zustand sein würde kein darüberliegenden Band die ganze Zeit. Jedoch würde Band über der 5 kJ / m 2 Zustand entfernt werden, wenn es in der Belichtungs restlichen 208 sek. Zeitpunkt der Bandentfernung sollte getan werden, so dass jeder Zustand Enden gleichzeitig. </li><li> Nach der UV-Exposition, ziehen Sie das Klebeband von der Rückenhaut vorsichtig, wobei nicht auf die Haut mit plötzlichen oder übermäßig kraftvolle Bewegungen rippen. Zeigen Tiere in einen warmen ruhigen Ort zu ermöglichenErholung von der Narkose. </li><li> Überwachung der Mäuse 24-48 h bis zur diskreten Bereichen Erythem (Rötung), Ödem oder schauen (Quellung) entsprechend den anatomischen Stellen auf die spezifische Dosis der UV-Bestrahlung ausgesetzt. Dokumentieren Hautbefunde fotografisch. </li><li> MED-Wert entspricht der minimalen Dosis von UV zu Entzündungen führt, wie durch Erytheme und / oder Ödeme der gesamten freiliegenden Kreis der Haut definiert. Beachten Sie, dass die Pigmentierung der Haut kann die Bestimmung der MED fordern jedoch, Erythem und Ödem kann immer noch in der Regel genau beurteilt, zum Teil dank der definierten Form der Öffnungen in der Band während der UV-Bestrahlung werden. </li></ol> 6. Statistische Analyse Analysieren von Daten zwischen Kohorten von Mäusen durch eine ANOVA mit Bonferroni Post-Test (Graph Pad PRISM). P-Werte &lt;0,05 werden als statistisch signifikant.

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Mit einem Tiermodell der hellhäutige Mensch, finden wir, dass die topische Anwendung einer Forskolin reichen rohen Wurzelextrakt robust dunkelt die Haut durch die Stimulierung der Melaninproduktion in der Haut. Epidermalen Melanin hängt von der Expression von Stammzellfaktor in der basalen Epidermis, wie es in der menschlichen Haut auftritt, aber nicht in genetisch nicht modifizierten Mäusehaut. Die Rückenhaut von Mäusen genetisch nicht modifizierten fehlt eine ausreichende Zahl von interfollikulären Melanozyten P...

Die Inzidenz von Melanomen, die tödlichste Form von Hautkrebs, hat sich in den letzten Jahrzehnten in den Vereinigten Staaten vor allem bei hellhäutigen Personen gestiegen. Starke molekularen und epidemiologischen Beweise bringen UV-Strahlung als Hauptursache Umweltfaktor 2-5. Erhöhte UV-Strahlung in Form von Sonneneinstrahlung und Solarium Benutzung geeignet ist, für viel der Anstieg der Melanom-Inzidenz 6-7 verantwortlich zu sein. Melanom-Risiko scheint besonders mit Sonnenbrand 8, vor allem in frühen Lebens 9-10 verknüpft. Sonnenbrandgefahr verbunden ist, nicht nur Dosis und Intensität der UV-Belichtung, sondern auch durch Faktoren, die vererbte kutanen Reaktion auf UV-Strahlung beeinflussen. Pigmentierung der Haut ist eine der wichtigsten Determinanten der UV-Empfindlichkeit, Sonnenbrandrisiko und Krebsrisiko. Melanom im Vergleich zu dunkelhäutigen individua tritt etwa zwanzig mal häufiger bei hellhäutigen Personenls 11-13. Melanin, ein Pigment von Melanozyten in der Epidermis produziert wird, ist die wichtigste Determinante der Teint. Melanin wird in zwei Hauptarten: (1) Eumelanin, eine dunkelbraune / schwarze Pigment wirksam beim Absorbieren der Energie der UV-Strahlung, und (2) pheomelanin, eine rötlich / blonde Pigment weniger effektiv bei der Verhinderung des Eindringens der UV-Photonen in die Haut. Hautfarbe, UV-Empfindlichkeit und Melanom-Risiko weitgehend von epidermalen Eumelanin Inhalt 14-15 bestimmt. Je mehr Eumelanin in der Epidermis können die weniger UV-Photonen in die Haut eindringen. Wegen der niedrigen Niveaus der angeborenen Eumelanin sind hellhäutige Menschen viel anfälliger für akute und chronische Wirkungen von UV-Strahlung 16-18. Die Pigmentierung der Haut, Melanom Risiko und die Fähigkeit, &quot;tan&quot; nach UV-Belastung korrelierten mit der Signalisierung Fähigkeit des Melanocortin-1-Rezeptor (Mc1r), einen G S-gekoppelte sieben Trans surface Rezeptor auf Melanozyten 19-22. Wenn Mc1r bindet seinem verwandten hochaffinen Liganden α-Melanozyten-stimulierendes Hormon (α-MSH), gibt es die Aktivierung von Adenylatzyklase und die Produktion des second messenger cAMP-23. Die normale physiologische Reaktion der Haut nach UV-Exposition umfasst epidermalen Herstellung von α-MSH durch Keratinozyten 24-29. Wir und andere vermuten, dass Keratinozyten stamm α-MSH bindet an Mc1r auf epidermalen Melanozyten, die Einleitung nachgelagerten Produktion des second messenger cAMP durch Aktivierung von Adenylatzyklase 30. cAMP-Spiegel kontrollieren viele Bereiche des Melanozyten-Differenzierung, einschließlich Überlebenswege, DNA-Reparatur und Pigmentsynthese. Mc1r Signal-und cAMP-Pigment Eumelanin Enzymwerte und Produktion deutlich zu induzieren. Wenn Mc1r Signalisierung ist intakt und melanozytären cAMP-Spiegel robust sind, wird Eumelanin produziert und die Haut dunkler. Wenn jedoch Mc1r Signalisierungs defekt ist undcytoplasmatische cAMP-Spiegel niedrig bleiben, wird pheomelanin statt 1 hergestellt. Eumelanin-Synthese kann pharmakologisch durch Mittel, die cAMP-Spiegel erhöhen 1,14,31-35 stimuliert werden. Da die Mc1r Protein ist ein wichtiger Regulator der Melanom-Risiko bei Menschen von 36 bis 46, wir sind interessiert an Mechanismen, durch die Melanozyten Mc1r schützt vor UV-induzierten Krebsentstehung. Als Grundlage für unsere Studien erzielten wir eine transgene Mc1r-Variante Mausmodell auf einem reinen C57BL / 6 genetischen Hintergrund ein. In diesem Modell, Stammzellfaktor (SCF) wird konstitutiv in der basalen Epidermis und epidermale interfollikuläre Melanozyten in der Haut im Laufe des Lebens 47 gehalten wird, im Gegensatz zu den nicht-transgenen Mäusen, in denen Melanozyten zu lokalisieren, um die Dermis in den Haarfollikeln. Mit dem K14-SCF-Transgen integriert, wird die Epidermis mit der besonderen Eigenschaft der Melaninpigmente Pigments pigmentiertBelastung des Tieres ein. K14-SCF-Mäuse auf dem C57BL / 6 genetischen Hintergrund mit Wildtyp-Signal Mc1r haben tiefschwarze Haut, die durch sehr hohe Pigment Eumelanin charakterisiert. Nicht überraschend sind diese Tiere sehr UV-beständig. Im Gegensatz dazu genetisch angepasst K14-SCF C57BL / 6 Tiere, die eine mutierte inaktive Mc1r Hafen fast keine Eumelanin in der Epidermis. Stattdessen diese &quot;Erweiterung&quot; Tieren (Mc1r e / e) haben eine helle Haut Teint durch Ablagerung von Pigment Phäomelanin (Abbildung 1A) verursacht und sind viel mehr UV-empfindliche 48-49. Pharmakologische Verbindungen mit chemischen Eigenschaften, die das Eindringen in die Haut ermöglichen, haben nachweislich eine starke induzieren Eumelanin in der Verlängerung (Mc1r e / e) K14-SCF-Tiermodell durch direkte Manipulation cAMP-Spiegel in epidermalen Melanozyten in der Haut. Melanin Hochregulation in diesem Modell ist rvon Adenylylzyklase Aktivierung 1 sowie Phosphodiesterase-4-Hemmung 35 eported. In diesem Artikel zeigen wir die Vorbereitung und die topische Anwendung von Forskolin in Verlängerung (Mc1r e / e) K14-SCF Tiere, welches Modell die hellhäutigen UV-empfindliche Menschen. Wir zeigen, dass zweimal tägliche Anwendung des Medikaments fördert beschleunigte Melanisierung aufgrund epidermale Ablagerung von Melanin, dass die Haut dunkler ist, und dass induzierte epidermale Melanin schützt vor UV-bedingten Sonnenbrand durch Messung der &quot;minimal gerötete Dosis&quot; (MED) 48.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coleus Forskoli extract 20%</td>
			<td>Buckton Scott USA Inc. </td>
			<td>n/a</td>
			<td>Princeton, NJ</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isothesia, Isoflurane , USP</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>NCD 11695-6776-1</td>
			<td>Dublin, OH, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Anased Injection</td>
			<td>LA04612</td>
			<td>Shenandoah, Iowa, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine HCl, USP</td>
			<td>Putney</td>
			<td>NDC 26637-411-01</td>
			<td>St. Joseph, MO, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs.</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propylene glycol</td>
			<td>Adesco</td>
			<td>05751L</td>
			<td>Solon, OH, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Depilatory cream, Nair</td>
			<td>Church &amp; Dwight</td>
			<td>JF-11 4381322</td>
			<td>Priceton, NJ</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Germicidal Hg Lamp UV-B</td>
			<td>Westinghouse</td>
			<td>F15T8UV-B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Radiometer photometer</td>
			<td>International light</td>
			<td>1LT400A</td>
			<td>Peabody, MA,USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chromameter</td>
			<td>Konica Minolta</td>
			<td>CR-400</td>
			<td>Ramsey, NJ, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Data Processor for 	Chromameter CR-400</td>
			<td>Konica Monilta</td>
			<td>DR-400</td>
			<td>Ramsey, NJ, USA</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

pharmacologic induction of epidermal melanin and protection against sunburn in a humanized mouse model

Fairness der Haut, UV-Empfindlichkeit und Hautkrebsrisiko alle korrelieren mit der physiologischen Funktion des Melanocortin-1-Rezeptor, einen G s-gekoppelten Signalprotein auf der Oberfläche der Melanozyten gefunden. Mc1r stimuliert Adenylatzyklase und cAMP-Produktion, die wiederum, up-reguliert melanozytären Produktion von Melanin in der Haut. Um die Mechanismen, durch die Signalisierung Mc1r schützt die Haut vor UV-Schädigung zu untersuchen, diese Studie basiert auf einem Maus-Modell mit &quot;humanisiert Haut&quot;, basierend auf epidermalen Expression von Stammzellfaktor (SCF). K14-SCF-transgenen Mäusen behalten Melanozyten in der Epidermis und haben daher die Fähigkeit, Melanin in der Epidermis abzuscheiden. In diesem Tiermodell, Wildtyp-Status Mc1r Ergebnisse in robuster Ablagerung von schwarzem Eumelanin Pigment und einem UV-geschützt Phänotyp. Im Gegensatz dazu K14-SCF Tiere mit defekt Mc1r Signal Fähigkeit zeigen eine rot / blonde Pigmentierung, sehr wenig Eumelanin in der Haut undein UV-sensitiven Phänotyp. Argumentation, dass Eumelanin Ablagerungen durch topische Mittel, die Mc1r Signalisierung imitieren verbessert werden, fanden wir, dass die direkte Anwendung von Forskolin Extrakt auf die Haut Mc1r mangel hellhäutigen Mäusen führte robust Eumelanin Induktions-und UV-Schutz ein. Hier beschreiben wir die Verfahren zur Herstellung und Anwendung eines Forskolin haltige Naturwurzelextrakt zur K14-SCF hellhäutigen Mäusen und berichten über eine Methode zur Messung der UV-Empfindlichkeit durch die Bestimmung minimale erythematöse Dosis (MED). Mit diesem Tiermodell ist es möglich zu untersuchen, wie cAMP epidermalen Induktion und Melanisierung der Haut beeinflussen physiologische Reaktionen auf UV-Exposition.

C57BL / 6 Mäuse wurden am eumelanotic, pheomelanotic oder amelanotischen Hinter Einbeziehung der K14-SCF Transgen, wie beschrieben (Fig. 1A) erzeugt. Kohorten von hellhäutigen Erweiterung (Mc1r e / e, Tyr + / +) wurden die Mäuse mit topisch zweimal täglich entweder Fahrzeug (70% Ethanol, 30% Propylenglykol) oder 40% Rohprotein Coleus forskohlii Wurzelextrakt (80 uM pro behandelt Dosis) für 5 Tage (Abb. 2B). Wirkungen der topischen Behandlunge...

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Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

Epidermal Melanin wird durch die topische Anwendung von Forskolin in einem murinen Modell der hellhäutigen UV-empfindliche Menschen verursachte. Pharmakologische Manipulation von cAMP-Konzentrationen in der Haut und Epidermis stark verdunkelt Schutz gegen UV-vermittelte Entzündungen (Sonnenbrand), wie durch die minimale erythematöse Dosis (MED)-Assay gemessen.

Pharmakologische Induktion der epidermalen Melanin und Schutz vor Sonnenbrand in einem humanisierten Mausmodell

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

pharmacologic-induction-epidermal-melanin-protection-against-sunburn

Research

JoVE Journal

Medicine

18.0K Aufrufe.  University of Kentucky College of Medicine.  Epidermal Melanin wird durch die topische Anwendung von Forskolin in einem murinen Modell der hellhäutigen UV-empfindliche Menschen verursachte. Pharmakologische Manipulation von cAMP-Konzentrationen in der Haut und Epidermis stark verdunkelt Schutz gegen UV-vermittelte Entzündungen (Sonnenbrand), wie durch die minimale erythematöse Dosis (MED)-Assay gemessen. 

Serie: Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Einem Mausmodell der In Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

Forschung

Medizin

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

Sublinguale Immuntherapie als Alternative zum Schutz vor akuten Atemwegsinfektionen ausgelöst werden

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. Females are disproportionately afflicted by UTI: 50% of all women will have a UTI in their lifetime. Additionally, 20-40% of these women who have an initial UTI will suffer a recurrence with some suffering frequent recurrences with serious deterioration in the quality of life, pain and discomfort, disruption of daily activities, increased healthcare costs, and few treatment options other than long-term antibiotic prophylaxis. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) is the primary causative agent of community acquired UTI. Catheter-associated UTI (CAUTI) is the most common hospital acquired infection accounting for a million occurrences in the US annually and dramatic healthcare costs. While UPEC is also the primary cause of CAUTI, other causative agents are of increased significance including Enterococcus faecalis. Here we utilize two well-established mouse models that recapitulate many of the clinical characteristics of these human diseases. For UTI, a C3H/HeN model recapitulates many of the features of UPEC virulence observed in humans including host responses, IBC formation and filamentation. For CAUTI, a model using C57BL/6 mice, which retain catheter bladder implants, has been shown to be susceptible to E. faecalis bladder infection. These representative models are being used to gain striking new insights into the pathogenesis of UTI disease, which is leading to the development of novel therapeutics and management or prevention strategies.

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work&#8217;s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Aufbau und Charakterisierung von UTI und CAUTI in einem Mausmodell

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic differentiation and immune function of the genetically modified cells. The humanized Bone-marrow/Liver/Thymus (BLT) mouse model allows for full reconstitution of a human immune system in the periphery, which includes T cells, B cells, NK cells and monocytes. The human thymic implant also allows for thymic selection of T cells in autologous thymic tissue. In addition to the study of HIV infection, the model stands as a powerful tool to study differentiation, development and functionality of cells derived from hematopoietic stem cells (HSCs). Here we outline the construction of humanized non-obese diabetic (NOD)-severe combined immunodeficient (SCID)-common gamma chain knockout (c&#947;-/-)-Bone-marrow/Liver/Thymus (NSG-BLT) mice with HSCs transduced with CD4 chimeric antigen receptor (CD4CAR) lentivirus vector. We show that the CD4CAR HSCs can successfully differentiate into multiple lineages and have anti-HIV activity. The goal of the study is to demonstrate the use of NSG-BLT mouse model as an in vivo model for engineered immunity against HIV. It is worth noting that, because lentivirus and human tissue is used, experiments and surgeries should be performed in a Class II biosafety cabinet in a Biosafety Level 2 (BSL2) with special precautions (BSL2+) facility.

This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.

Stammzellen Basierend Engineered Immunität gegen HIV-Infektion in der humanisierten Maus-Modell

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

Erzeugung eines humanisierten Maus-Leber unter Einsatz von menschlichem Leberstammzellen

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Induktion von beschleunigter Atherosklerose bei Mäusen: Das "Wire-Injury"-Modell

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions between cellular and non-cellular blood components during thrombus formation, reliable studies of the physiology and pathophysiology of thrombosis can only be performed in vivo. Therefore, this article presents an ear model in hairless mice and focuses on the in vivo analysis of microcirculation, thrombus formation, and thrombus evolution. By using intravital fluorescence microscopy and the intravenous (iv) application of the respective fluorescent dyes, a repetitive analysis of microcirculation in the auricle can easily be performed, without the need for surgical preparation. Furthermore, this model can be adapted for in vivo studies of different issues, including wound healing, reperfusion injury, or angiogenesis. In summary, the ear of hairless mice is an ideal model for the in vivo study of skin microcirculation in physiological or pathophysiological conditions and for the evaluation of its reaction to different systemic or topical treatments.

The ear model of the hairless SKH1-Hrhr mouse enables intravital fluorescence microscopy of microcirculation and phototoxic thrombus induction without prior surgical preparation in the examined microvascular bed. Therefore, the ear of the hairless mouse is an excellent in vivo model to study the complex interactions during microvascular thrombus formation, thrombus evolution, and thrombolysis.

Intravitalmikroskopie und Thrombusinduktion im Ohrläppchen eines Hairless Maus

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have been established by tamoxifen induced deletion of Ccm genes in postnatal animals. These mouse models provide invaluable tools to investigate molecular mechanism and therapeutic approaches for CCM disease. An accurate and quantitative method to assess lesion burden and progression is essential to harness the full value of these animal models. Here, we demonstrate the induction of CCM disease in a mouse model and the use of the contrast enhanced X-ray micro computed tomography (micro-CT) method to measure CCM lesion burden in mouse brains. At postnatal day 1 (P1), we used 4-hydroxytamoxifen (4HT) to activate Cre recombinase activity from the Cdh5-CreErt2 transgene to cleave the floxed allele of Ccm2. CCM lesions in mouse brains were analyzed at P8. For micro-CT, iodine based Lugol&#39;s solution was used to enhance contrast in brain tissue. We have optimized the scan parameters and utilized a voxel dimension of 9.5 &#181;m, which lead to a minimum feature size of approximately 25 &#181;m. This resolution is sufficient to measure CCM lesion volume and number globally and accurately, and provide high-quality 3-D mapping of CCM lesions in mouse brains. This method enhances the value of the established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for CCM and other cerebrovascular diseases.

This protocol demonstrates the induction of cerebral cavernous malformation disease in a mouse model and uses contrast enhanced micro computed tomography to measure lesion burden. This method enhances the value of established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for cerebral cavernous malformation and other cerebrovascular diseases.

Induktion und Mikro-CT-Bildgebung des zerebralen höhlenartigen Fehlbildungen im Mausmodell

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit Draht Myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...