Diese Methode kann bei der Entwicklung von funktionellen Kosmetika und Hautwirkstoffen mit antimelanogenen Aktivitäten hilfreich sein. Es ist da zu performen und das Ergebnis kann schnell erhalten werden. Darüber hinaus kann diese Methode für Forscher nützlich sein, die die Wirkungen oder die Verbindungen identifizieren oder untersuchen oder die antimelanogene oder promelanogene Aktivitäten untersuchen möchten.
Zur Messung der Tyrosinase-Aktivität beginnen mit der Aussaat von B16-F10 Melaniziden bei einer fünfmal 10 bis vierten Zelle pro Bohrkörper einer 24-Well-Platten-Konzentration in komplettem Medium für 24 Stunden in einem Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie am nächsten Tag den Überstand in jedem Brunnen durch DMEM, ergänzt durch frisch zubereitete Testverbindung und Inhibitorkontrolle oder eine Negativkontrolle, und geben Sie die Platte für weitere 72 Stunden an den Inkubator zurück. Am Ende der Behandlung spülen Sie die Brunnen zweimal mit 300 Mikroliterkalten pbs pro Brunnen ab und legen Sie die Platte auf Eis.
Als nächstes fügen Sie 300 Mikroliter Lysepuffer zu jedem Brunnen mit einem Zellschaber hinzu, um die Zelllysate nach fünf Minuten zu sammeln. Übertragen Sie die resultierenden Zellpartikelsuspensionen auf einzelne 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren. Und homogenisieren Sie die Lysate dreimal für zwei Sekunden bei 14 500 Rpm auf Eis, um die interzelluläre Tyrosinase freizusetzen.
Pellet die Zellablagerungen durch Zentrifugation und übertragen Sie die Überschärzeichen auf einzelne 1,5 Milliliter Zentrifugenrohre auf Eis. Weisen Sie 70 Mikroliter jedes Überstandes einzelnen Brunnen einer klaren 96 Well Polystyrol-Mikroplatte zu und fügen Sie 140 Mikroliter Tyrosinase Substratlösung zu jedem Brunnen des Überstandes. Schütteln Sie die Platte sanft, um den Brunneninhalt zu mischen.
Dann bebrüten die Platte bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Und messen Sie die Tyrosinase-Aktivität bei 475 Nanometern auf einem Mikroplattenleser. Um den Melaningehalt der Zellen nach dem Sammeln des Lysats der behandelten Zellen wie nachgewiesen zu messen.
Sammeln Sie die Lysate durch Zentrifugation und übertragen Sie die Überstande in neue Schläuche. Fügen Sie 300 Mikroliter eines normalen Natriumhydroxids zu jedem Pellet für eine eine Stunde Inkubation bei 60 Grad Celsius hinzu. Gefolgt von der Zentrifugation der gelösten Zellsuspensionen.
Dann 200 Mikroliter der Überräube auf jeden Brunnen einer 96-Well-Platte übertragen. Und messen Sie den Melaningehalt auf einem Mikroplattenleser bei einer Wellenlänge von 400 Nanometern. Für Fontana-Masson Staining, waschen Sie die behandelten Zellen zweimal mit 300 Mikroliter kalten pbs und fixieren Sie die Zellen mit 200 Mikroliter von 10%formalin für eine Stunde bei vier Grad Celsius.
Spülen Sie die dicken Zellen mit destilliertem Wasser und fügen Sie 200 Mikroliter von 58 bis 68 Grad Celsius Ammoniak silber Arbeitslösung zu jedem Brunnen. Für eine Stunde Inkubation bei 37 Grad Celsius oder bis die Zellen gelbbraun werden. Spülen Sie die gebeizten Zellen mit destilliertem Wasser, gefolgt von einer zweiminütigen Inkubation in 0,1% Goldchlorid bei Raumtemperatur.
Spülen Sie die mit Goldchlorid behandelten Zellen mit destilliertem Wasser und fügen Sie den Zellen 200 Mikroliter Natriumthiosulfatlösung hinzu. Nach zwei Minuten spülen Sie die Zellen wieder ab. Und beschriften Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern Kernschnellrot pro Brunnen für fünf Minuten.
Dann waschen Sie die gefärbten Zellen mit Leitungswasser, bevor Sie unter einem Lichtmikroskop bildgeben. Öffnen Sie für die Schwellenwertanalyse die Bilder in Bild J, und wählen Sie Bild, Anpassen und Farbschwellenwert aus. Um den mit Fontana Masson befleckten Bereich zu messen, stellen Sie die Helligkeitsparameterleiste auf Null ein und passen Sie die Helligkeit an den Punkt an, an dem alle schwarzen oder braun enrbierten Zellen enthalten sind.
Wählen Sie Partikel analysieren und analysieren aus, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Im Fenster Partikel analysieren, und klicken Sie dann auf "OKAY", um eine Zusammenfassung der Ergebnisse zu erhalten und die Daten in eine Kalkulationstabelle zu kopieren und einzufügen. Die Arbutin-Behandlung unterdrückt die zelluläre Tyrosinase-Aktivität signifikant im Vergleich zu kontrollfahrzeugbehandelten Zellen. In ähnlicher Weise ist der Melaningehalt von Zellen, die mit Arbutin stimuliert werden, im Vergleich zu den Kontrollen signifikant reduziert.
Obwohl die Zellen zwischen den Behandlungsgruppen morphologisch ähnlich sind, verringert Arbutin den Bereich des schwarzen Pigments im Vergleich zu den kontrollbehandelten Zellen. Diese Methode ist nützlich für Aktivitäten Screening mit unserer zusammengesetzten Bibliothek. Es gibt über Hunderte von Proben, die schnell getestet werden müssen.
Darüber hinaus kann diese Methode auch verwendet werden, um den Mechanismus mit Melanogenese zu untersuchen. Nachdem die bioaktiven Kandidaten Verbindungen identifiziert wurden, für ihr Zeugnis für die Untersuchung der biologischen Mechanismen oder kommerzielle Anwendungen.
