Stimulation von Stammzellnischen und Geweberegeneration in der Haut von Mäusen durch schaltbare Protoporphyrin IX-abhängige Photogeneration reaktiver Sauerstoffspezies in situ

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die vorübergehende In-vivo-Produktion von nicht-letalen Mengen an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Haut von Mäusen zu induzieren und so die physiologischen Reaktionen im Gewebe weiter zu fördern.

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur induzierbaren in vivo Photogenerierung von endogenen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Haut von Mäusen. Diese transiente Produktion von ROS in situ aktiviert effizient die Zellproliferation in Stammzellnischen und stimuliert die Geweberegeneration, was sich stark in der Beschleunigung von Verbrennungsheilungs- und Haarfollikelwachstumsprozessen manifestiert. Das Protokoll basiert auf einer regulierbaren photodynamischen Behandlung, bei der das Gewebe mit Vorstufen des endogenen Photosensibilisators Protoporphyrin IX behandelt und das Gewebe unter streng kontrollierten physikalisch-chemischen Parametern weiter mit rotem Licht bestrahlt wird. Insgesamt stellt dieses Protokoll ein interessantes experimentelles Werkzeug zur Analyse der ROS-Biologie dar.

Einleitung

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind das Ergebnis der chemischen Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasser und umfassen Singulett-Sauerstoff, Superoxid-Anion, Wasserstoffperoxid und das Hydroxylradikal ^1,2,3. ROS haben aufgrund ihrer extrem chemisch reaktiven Natur eine sehr kurze Lebensdauer. In aeroben Organismen werden ROS zufällig in den Zellen als großes undichtes Nebenprodukt der aeroben Atmung (Elektronentransportkette) in den Mitochondrien gebildet. Die vorübergehende Anhäufung hoher ROS-Konzentrationen in der Zelle führt zu einem oxidativen Stresszustand, der die irreversible Inaktivierung von Proteinen, Lipiden und Zuckern und die Einführung von Mutationen im DNA-Molekül 2,3,4,5 provozieren kann. Die allmähliche Anhäufung oxidativer Schäden in Zellen, Geweben und ganzen Organismen nimmt mit der Zeit stetig zu und wurde mit der Induktion von Zelltodprogrammen, verschiedenen Pathologien und dem Alterungsprozess in Verbindung gebracht 2,3,4,6.

Aerobe Organismen haben stetig effiziente molekulare Mechanismen entwickelt, um die übermäßige ROS-Akkumulation in Zellen und Geweben zu bekämpfen. Zu diesen Mechanismen gehören Mitglieder der Superoxiddismutase (SOD)-Proteinfamilie, die die Superoxidradikal-Dismutation in molekularen Sauerstoff und Wasserstoffperoxid katalysieren, sowie verschiedene Katalasen und Peroxidasen, die den antioxidativen Pool (Glutathion, NADPH, Peroxiredoxin, Thioredoxin^7,8) nutzen^, um die anschließende Umwandlung von Wasserstoffperoxid in Wasser und molekularen Sauerstoff zu katalysieren.

Mehrere Berichte unterstützen jedoch die Rolle von ROS als Schlüsselkomponenten molekularer Schaltkreise, die kritische Zellfunktionen regulieren, einschließlich Proliferation, Differenzierung und Mobilität ^2,3,4. Dieses Konzept wird durch die anfängliche Identifizierung und Charakterisierung von ROS-produzierenden Mechanismen in aeroben Organismen, einschließlich Lipoxygenasen, Cyclooxygenasen und NADPH-Oxidasen, weiter unterstützt ^9,10. In diesem Sinne spielen ROS eine aktive Rolle während der Embryonalentwicklung von Wirbeltieren 11,12,13 und Schlüsselrollen für diese Moleküle bei der Regulation spezifischer physiologischer In-vivo-Funktionen wurden in verschiedenen experimentellen Systemen beschrieben, einschließlich des Differenzierungsprogramms von hämatopoetischen Vorläuferzellen in Drosophila^14, der heilenden Induktion bei Zebrafischen oder der Schwanzregeneration bei Xenopus-Kaulquappen ¹⁵. Bei Säugetieren waren ROS am Selbsterneuerungs-/Differenzierungspotenzial von neuralen Stammzellen in einem Neurosphärenmodell^{beteiligt 16} und an der Deregulierung der intestinalen Stammzellfunktion während der Darmkrebsentstehung¹⁷. In der Haut wurde die ROS-Signalgebung mit der epidermalen Differenzierung und der Regulierung der Hautstammzellnische und des Wachstumszyklus der Haarfollikel in Verbindung gebracht^18,19.

In dieser Perspektive ist eine wesentliche experimentelle Einschränkung zur Bestimmung der physiologischen Rolle von ROS in biologischen Systemen, sowohl unter normalen als auch unter pathologischen Bedingungen, das Fehlen geeigneter experimenteller Werkzeuge, um eine kontrollierte Produktion dieser Moleküle in Zellen und Geweben zu induzieren, die ihrer physiologischen Produktion als sekundäre Signalboten genau ähneln. Derzeit beinhalten die meisten experimentellen Ansätze die Verabreichung von exogenen ROS, meist in Form von Wasserstoffperoxid. Wir haben kürzlich einen experimentellen Ansatz implementiert, um eine transiente, nicht-letale In-vivo-Produktion von endogenen ROS in der Maushaut einzuschalten, basierend auf der Verabreichung von Vorläufern des endogenen Photosensibilisators Protoporphyrin IX (PpIX; z.B. Aminolaevulinsäure oder ihr Methylderivat Methylaminolevulinat) und einer weiteren Bestrahlung der Probe mit rotem Licht, um die in situ Bildung von ROS aus intrazellulärem molekularem Sauerstoff zu induzieren (Abbildung 1). Dieses photodynamische Verfahren kann effizient genutzt werden, um residente Stammzellnischen zu stimulieren, wodurch die Regenerationsprogramme des Gewebes aktiviert^{werden 19,20} und der Weg für neue therapeutische Modalitäten in der regenerativen Hautmedizin eröffnet wird. Hier präsentieren wir eine detaillierte Beschreibung des Protokolls und zeigen repräsentative Beispiele für die Stimulation von Stammzellnischen, gemessen als Erhöhung der Anzahl von Langzeit-5-Brom-2'-Desoxyuridin (BrdU)-Markierungsretentionszellen (LRCs) in der Wölbungsregion des Haarfollikels^19,21 und die anschließende Aktivierung von Regenerationsprogrammen (Beschleunigung des Haarwachstums und der Heilung von Verbrennungen), die durch transiente^, nicht-letale ROS-Produktion in der Haut des C57Bl6-Mausstamms.