National Institute of Health Grant DA024009, DK046367 &#38; T32DA007027.

Alle Tierpflege und experimentellen Verfahren waren in Übereinstimmung mit und Zustimmung durch die Institutional Animal Care und Use Committee an der Virginia Commonwealth University. 1. Herstellung von sterilen Poly-D-Lysin und Laminin beschichteten Deckgläschen in 24-Well-Platten <ol><li> Alle Verfahren für Schritt 1 werden in sterilen Bedingungen durchgeführt; unter einer Haube und mit sterilem Reagenzien. Deckgläschen und doppelt deionisiertem Wasser (ddH2O) sollten im Voraus sterilisiert werden. Vorbereitung der Platten kann bis zu zwei Wochen durchgeführt werden, bevor Neuron Isolation. </li><li> Unter der Haube sterile Pinzette autoklavierten Deckgläschen in 12 Vertiefungen einer 24-Well-Platte zu platzieren. </li><li> Bereiten Poly-D-Lysin Lager vor der Zeit. 50 ml der sterilen ddH2O bis 5 mg Poly-D-Lysin. Vortex und Speicher in 3 ml Aliquots bei -20 ° C. Aliquots vor Gebrauch auftauen. </li><li> Für eine endgültige Konzentration von 1 ml Poly-D-Lysin Lager pro 25 cm 2: Pipette 80 ulvon Poly-D-Lysin stock übereinander Deckglas (2 cm 2). Lassen Lösung für 10 Minuten absetzen. </li><li> Entfernen Poly-D-Lysin unter Verwendung von Vakuum und spülen Deckgläschen 3x mit sterilem ddH 2 O. </li><li> Erlauben Platten für mindestens 2 Stunden unter der Haube trocknen. </li><li> Die Platten können bei 4 ° C gelagert werden oder - 20 ° C bevor mit Laminin beschichtet. </li><li> Bereiten Laminin Lager vor der Zeit. Auftauen Laminin auf Eis und halten auf dem Eis während des Einsatzes. Verdünnen auf eine Konzentration von 50 ug / ml; achten Sie auf viel Konzentration; jedes Los wird anders sein. Je nach Menge Konzentration, werden etwa 20 ml ddH2O auf jeder Flasche des Laminin hinzugefügt werden. Aliquot (5 ml) und bei -80 ° C Auftauen Aliquots auf Eis vor dem Gebrauch. </li><li> Coat Deckgläser mit 5 pg / cm 2 Laminin; Pipette 200 ul Laminin Lager auf jeder Deckglas. </li><li> Inkubieren Laminin-Lösung auf Deckgläsern für 1 Stunde. </li><li> Saugen restlichen Laminin-Lösung und spülen Deckgläschen einmal mitddH 2 O. Vermeiden Schabfläche von Deckgläsern. </li><li> Shop Platten bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen. </li></ol> 2. Rechtzeitige Vorbereitung von Neuron Isolation Solutions <ol><li> Bereiten Krebs-Lösung (in mM: 118 NaCl, 4,6 KCl, 1,3 NaH 2 PO 4, 1,2 MgSO 4, 25 NaHCO 3, 11 Glucose und 2,5 CaCl 2). Platz 13,79 g NaCl (FW 58.44), 0,686 g KCl (FW 74.55), 0,312 g NaH 2 PO 4 (FW 120) .289 g MgSO 4 (FW 120,4), 4,20 g NaHCO 3 (FW 84.01), 3,96 g Glucose (FW 180,2) und 0,555 g CaCl 2 (FW 111) in 2 L ddH 2 0. Kühlen auf 4 ° C </li><li> Bereiten spülen Medien (F12-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika / Antimykotika): In einen 500-ml-Flasche von F12-Medium, 50 ml FBS und 5 ml Antibiotikum / Antimykotikum 100x Liquid (Gibco). </li><li> Bereiten enterischen Neuron Medien (Neurobasal Ein Medium mit B-27, 2 mM L-Glutamin, 1% FBS, 10 ng / ml, glialem Neurotrophic Factor (GDNF), und Antibiotika / Antimykotika 100x Flüssigkeit). Um GDNF Lager machen, fügen Sie 1 ml ddH2O bis 10 ug GDNF und frieren wieder in 50 ul Aliquots bei -80 ° C. Für ein 50 ml Fläschchen komplette Neuron Medien kombinieren 47,5 ml Neurobasal A Medien, 1 ml B-27 (50x), 500 ul FBS, 500 ul 200 mM L-Glutamin (Gibco) 50 ul GDNF Lager, und 500 ul Antibiotika / Antimykotische 100x Flüssigkeit. Die Medien werden in kleinen Chargen 50 ml hergestellt, um die Frische von GDNF zu gewährleisten und um eine Kontamination von großen Mengen dieser teuren Zellkulturmedien Mischung zu vermeiden. </li></ol> 3. Ernte Längsmuskel / myenterischen Plexus (LMMP) Herstellung von Mice <ol><li> Entsprechende nationale und institutionelle Ethik sollten vorhanden sein, bevor Tierversuch. Adult Swiss Webster-Mäuse mit einem Gewicht von über 25 g (in der Regel mehr als 8 Wochen alt) in Gruppen von 6 vor Experimente untergebracht. Gewebe von zwei Mäuse werden zur Isolierung von Ileum enterischen Neuronen und Glia verwendet und drei Mäuse verwendetIsolierung von Kolon-Zellen. </li><li> Bereiten OP-Bereich. Sammeln Sie kleine chirurgische Schere, Pinzette abgewinkelt, Wattestäbchen, drei 200 ml Bechergläser, und ein Glas / Kunststoff-Stab (Pinsel). Sicherstellen, dass alle Lieferungen gründlich gewaschen und gespült, bevor verwenden, um eine Kontamination zu minimieren. Dieser Schritt kann durchgeführt am Tag vor dem Experiment werden. </li><li> Zeigen Krebs-Lösung auf Eis und Blase mit Carbogen (95% Sauerstoff, 5% CO 2) für mindestens 30 min auf pH stabilisieren. </li><li> Schalten Sie auf verschiedenen Geräten und warmen Chemikalien am gewünschten Temperaturen zu stabilisieren; Hitze Wasserbad (s) auf 37 ° C, cool Zentrifuge auf 4 ° C, Platz ausgewogene Hank-Salzlösung (HBSS) und 0,5% Trypsin im Wasserbad (37 ° C ). Komplette Neuron Medien und spülen Medien bleiben sollte gekühlt werden. </li><li> Platz 150 ml eiskaltem sprudelte Krebs in drei 200 ml Bechergläser als &#39;schmutzig&#39;, &#39;sauber&#39; und &#39;LMMP&#39;. Blase Becherglas als &#39;LMMP&#39; mit Carbogen. </li><li> Nach der Genehmigung von Ethik-Kommission, euthanize mouse durch Genickbruch oder CO 2 Ersticken. </li><li> Bewegen Sie die Maus in Rückenlage recumbence auf chirurgische Oberfläche, saubere Haut mit 70% EtOH und heben Bauchhaut mit einer Pinzette. Mit einer Schere, offene Bauchhöhle und zeigen interne Verdauungsorgane. </li><li> Entfernen Sie die Länge des Magen-Darm-Trakt durch Anheben eines Abschnitts Ileum und enthüllt seine Mesenterium. Snip durch Mesenterium mit einer Schere vorsichtig zu entfernen und zu entwirren Ileum und Colon, man aufpassen, nicht aus dem Ileum Mesenterium / Doppelpunkt zu ziehen. </li><li> Nachdem die gesamte Länge des Darms entwirrt entfernen Ileum durch Schneiden durch den Darm distal des Magens und proximal zu dem Blinddarm. Hinweis: Dieses Verfahren kann auch mit Kolon durch Entfernen des Dickdarms von distal nach den Blinddarm zu proximal durchgeführt der Anus. </li><li> Gewebe kann ferner zwischen dem proximalen und distalen Kolon und jejenum und Ileum unterteilt werden. Der Rest dieses Verfahrens wird die Isolation des Ileums beziehen; ter ist das gleiche für die Isolierung von Doppelpunkt LMMP. Setzen Sie den gesamten Ileum in einem Glasbehälter mit eiskaltem Krebs markiert &#39;dirty&#39;. </li><li> Erstellen Sie ein Werkzeug, um die Ileum reinigen; stumpfen eine große 20 G-Nadel mit einer Ablage Stein und verbinden Sie es mit einer großen Spritze (10 ml) mit eiskaltem Krebs. </li><li> Reinigen Fäkalien aus dem Ileum von Schneiden des Ileums in drei oder mehr große Stücke. Entfernen eines ileal Abschnitt aus dem Becherglas und platzieren Sie den stumpfen Nadel in das Ende eines ileal Stück. </li><li> Sanft laufen Krebs durch den Darm Abschnitt bis alle Fäkalien in einen separaten Abfallbehälter entfernt wird. Setzen Sie den gereinigten Abschnitt in den Behälter von Krebs gezeichnet &#39;clean&#39;. Wiederholen, bis ganze Ileum gereinigt wird. </li><li> Um die LMMP entfernen, schneiden Sie das Ileum in kleine Segmente, etwa 2-4 cm. Legen Sie ein Segment des Ileum auf einem Kunststoff-oder Glas-Stab; Ileum sollte eng anliegend, aber nicht lose oder straff (~ 2 mm). Beginnen Entfernung des LMMP durch sanftes Entfernen von Bits von Mesenterium noch anhängened der gastrointestinalen (GI)-Trakt mit einer Pinzette. Verhindern, dass der GI-Trakt zu drehen um die Stange durch leichtes Pinning des Rohres auf die Stange mit dem Daumen. </li><li> Trennen Sie die LMMP aus dem zugrunde liegenden kreisförmigen Muskel; zuerst sanft an den Kanten der Zange auf der ganzen Linie, wo das Mesenterium befestigt war, von oben nach unten von dem Segment, sanft eine Lücke in der Längs-Muskel. Dann vorsichtig entfernt necken die Längsmuskel mit einem Wattestäbchen mit Krebs benetzt. </li><li> Beginnen an der Oberseite des Spaltes in Längsrichtung Muskel und reizen weg mit der leichtesten horizontaler Strich beim Anwenden sehr leichtem Druck, bis die Längsmuskel gerade beginnt, sich von der kreisförmigen Muskels zu trennen, tun dies entlang der gesamten Streifen entlang der Mesenterium Befestigungspunkt. </li><li> Dann vorsichtig im Umfeld des GI Rohr einzuführen, bewegt von oben nach unten und zurück als die longitudinale Muskel wird langsam aus dem Ringmuskel ganzen Weg rund um das Rohr abgetrennt. Wenn Sie fertig sind, dieLMMP wird natürlich kommen aus dem Rest des GI Rohr. </li><li> Legen Sie die resultierende dünne Streifen Längsmuskel in das Becherglas mit der Aufschrift &quot;LMMP &#39;. Wiederholen für alle Segmente. </li><li> Nachdem alle Streifen LMMP von einer Maus gesammelt worden sind, wiederholen Sie den Vorgang für alle anderen Mäuse verwendet. Spülen Sie die &#39;schmutzige&#39; und &#39;clean&#39; Becher vor Wiederverwendung. </li><li> Spülen Sie die LMMP 3x auf biologische Verunreinigungen zu entfernen. Füllen Sie drei 2 ml Eppendorf-Röhrchen mit eiskaltem Krebs. Platzieren Sie die LMMP Streifen in der ersten Röhre und Spin für 30 sec bei 356 × g in einer Zentrifuge gekühlt auf 4 ° C Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und bewegen Sie die LMMP Streifen zum nächsten sauberen Krebs gefüllten Röhre. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede verbleibende Rohr. </li></ol> 4. Digest LMMP <ol><li> Bereiten Verdauung Lösung, indem 13 mg Collagenase Typ 2 und 3 mg BSA in 10 ml warmer, sprudelte Krebs-Lösung. </li><li> Platz Segmente gespült LMMP in Aufschlußlösung und Nutzung scissoren zu LMMP in kleine Stücke schnippeln. </li><li> Digest LMMP für 60 min bei 37 ° C im Wasserbad mit Schüttler unter leichtem mit Carbogen eingeleitet. </li><li> Nach der Verdauung abgeschlossen ist, sammeln die Zellen durch Zentrifugation für 8 min bei 356 xg in Zentrifuge gekühlt auf 4 ° C </li><li> Von diesem Punkt an sollten alle Verfahren unter sterilen Bedingungen in einer Zellkultur Haube getan werden! Alle Reagenzien und Behälter sollte vor Gebrauch sterilisiert werden. </li><li> Während der Zentrifugation vorbereiten 0,05% Trypsin-Lösung, indem 1 ml 0,25% Trypsin erwärmt und 4 ml HBSS erwärmt in ein steriles 50 ml Zellkultur Rohr. </li><li> Nach Zentrifugation Überstand entfernen und entsorgen. Verwenden Sie nicht ein Vakuum, das wird wahrscheinlich saugen das Zellpellet aufgrund der niedrigen Geschwindigkeiten zentrifugiert. Entfernen Sie vorsichtig das Zellpellet aufnehmen und in sauberes Röhrchen mit 5 ml 0,05% Trypsin-Lösung. </li><li> Digest Zellen in 0,05% Trypsin-Lösung in 37 ° C warmes Wasserbad unter Schütteln für 7 min. Nicht mehr als 7 kmn der gesamten Trypsinbehandlung oder Neuronen zugrunde gehen. </li><li> Neutralisieren Trypsin mit 10 ml kaltem spülen Medien nach 7 min von Trypsin-Behandlung. </li><li> Zentrifuge Zellen für 8 min bei 356 x g. Entfernen und entsorgen Medien. </li><li> Während des Laufs, balancieren einen Abschnitt sterilisiert Nitex Mesh auf einem sterilen 15 ml Zellkultur Rohr. </li><li> Nach Zentrifugation Überstand entfernen und entsorgen. Vorsichtig resuspendieren Zellgemisch durch Verreiben in 3 ml komplette Neuron Medien. Vermeiden Erzeugung von Luftblasen während dieses Schrittes und alle künftigen Schritte in der Zelle Gemisch verrieben. Alle Triturationen sollte sehr vorsichtig erfolgen. Filter Zelllösung durch Nitex Mesh in saubere 15 ml Zellkultur Rohr. </li><li> Optional: Cap Zellkultur Rohr und in gekühlten Hula Mixer (oder Mixer, der Rotation bietet) mit sanften und Kippen für 30 min. Dieser Schritt ist optional, aber empfohlen. </li><li> Optional: Nach Hula-Mischer, 2 ml Kaltspülung Medien Zellen zu waschen. </li><li> Sammeln Zellen durch Zentrifugation (8 min, 356 xg). Überstand entfernen und entsorgen. </li><li> Die Zellen in 1.200 ul komplette Neuron Medien. Man reibt Zellen vorsichtig mit 1 ml Kunststoff Pipettenspitze. Nicht generieren Luftblasen. Pipette langsam und vorsichtig, bis die meisten Stücke gebrochen und werden die Zellen in Flüssigkeit suspendiert. </li><li> In 750 ul komplette Medien auf jede der 12 Vertiefungen, die eine Pre-beschichteten Deckglas und 100 ul der triturated Zelllösung. </li><li> Inkubieren Neuronen in Zellkultur-Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Ändern Sie die Hälfte der Zellmedien alle 2 Tage. </li><li> Neuronen sind bereit für elektrophysiologische Ableitungen nach 1 - 2 Tagen in Kultur. </li></ol>

<ol>
	<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology.">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (5), 286-294 (2012).</li><li>Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system:+A+second+brain.">The enteric nervous system: A second brain.</a> Hosp. Pract. (Minneap). 34 (7), 31-32 (1999).</li><li>Gershon, A. A., Chen, J., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+lytic,+latent,+and+reactivating+varicella-zoster+virus+infections+in+isolated+enteric+neurons.">A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons.</a> J. Infect. Dis. 197, 61-65 (2008).</li><li>Wakabayashi, K., Mori, F., Tanji, K., Orimo, S., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies,+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain.">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta. Neuropathol. 120 (1), 1-12 (2010).</li><li>Hirst, G. D., Holman, M. E., Spence, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+neurones+in+the+myenteric+plexus+of+duodenum+in+the+guinea-pig.">Two types of neurones in the myenteric plexus of duodenum in the guinea-pig.</a> J. Physiol. 236 (2), 303-326 (1974).</li><li>Clerc, N., Furness, J. B., Bornstein, J. C., Kunze, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+electrophysiological+and+morphological+characteristics+of+myenteric+neurons+of+the+duodenum+in+the+guinea-pig.">Correlation of electrophysiological and morphological characteristics of myenteric neurons of the duodenum in the guinea-pig.</a> Neuroscience. 82 (3), 899-914 (1998).</li><li>Rugiero, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+whole-cell+currents+by+patch+clamp+of+guinea-pig+myenteric+neurones+in+intact+ganglia.">Analysis of whole-cell currents by patch clamp of guinea-pig myenteric neurones in intact ganglia.</a> J. Physiol. 538 (Pt. 2), 447-463 (2002).</li><li>Jessen, K. R., Saffrey, M. J., Baluk, P., Hanani, M., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system+in+tissue+culture.+III.+studies+on+neuronal+survival+and+the+retention+of+biochemical+and+morphological+differentiation.">The enteric nervous system in tissue culture. III. studies on neuronal survival and the retention of biochemical and morphological differentiation.</a> Brain Res. 262 (1), 49-62 (1983).</li><li>Smith, T. H., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphine+decreases+enteric+neuron+excitability+via+inhibition+of+sodium+channels.">Morphine decreases enteric neuron excitability via inhibition of sodium channels.</a> PLoS One. 7 (9), e45251 (2012).</li><li>Abdo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glial+cells+protect+neurons+from+oxidative+stress+in+part+via+reduced+glutathione.">Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione.</a> FASEB J. 24 (4), 1082-1094 (2010).</li><li>Aube, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+enteric+neurone+phenotype+and+intestinal+functions+in+a+transgenic+mouse+model+of+enteric+glia+disruption.">Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption.</a> Gut. 55 (5), 630-637 (2006).</li><li>Bassotti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glial+cells+and+their+role+in+gastrointestinal+motor+abnormalities:+Introducing+the+neuro-gliopathies.">Enteric glial cells and their role in gastrointestinal motor abnormalities: Introducing the neuro-gliopathies.</a> World J. Gastroenterol. 13 (30), 4035-4041 (2007).</li><li>Neal, K. B., Parry, L. J., Bornstein, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-specific+genetics,+anatomy+and+function+of+enteric+neural+serotonergic+pathways+in+inbred+mice.">Strain-specific genetics, anatomy and function of enteric neural serotonergic pathways in inbred mice.</a> J. Physiol. 587 (Pt. 3), 567-586 (2009).</li><li>Phillips, R. J., Walter, G. C., Powley, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+vagal+afferents+innervating+the+gastrointestinal+tract.">Age-related changes in vagal afferents innervating the gastrointestinal tract.</a> Auton. Neurosci. 153 (1-2), 90-98 (2010).</li><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+of+neurons+in+the+enteric+nervous+system.">Types of neurons in the enteric nervous system.</a> J. Auton. Nerv. Syst. 81 (1-3), 87-96 (2000).</li><li>Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+functional+roles+for+enteric+glia+in+the+gastrointestinal+tract.">Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9 (11), 625-632 (2012).</li><li>Pomeranz, H. D., Rothman, T. P., Chalazonitis, A., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest-derived+cells+isolated+from+the+gut+by+immunoselection+develop+neuronal+and+glial+phenotypes+when+cultured+on+laminin.">Neural crest-derived cells isolated from the gut by immunoselection develop neuronal and glial phenotypes when cultured on laminin.</a> Dev. Biol. 156 (2), 341-361 (1993).</li></ol>

The authors declare that no major competing interests exist.

Animals Used
This protocol has been optimized for Swiss Webster mice. However, this method is easily adaptable to other small-sized mammals such as rats and to other strains of mice. We have successfully performed preliminary isolations with C57 mice and &mu;-opioid receptor knock-outs. However, it is also possible that other strains of mice may be problematic due to morphological variations in the GI tract. Furthermore, there are known differences between mouse strains (C57Bl/6 vs. Balb/c) in th...

Das enterische Nervensystem (ENS) ist groß Netzwerk von Nerven und Gliazellen, die die gesamte Länge des Magen-Darm-Trakt (GI) verläuft. Die ENS funktionell steuert alle Aspekte der Verdauung, darunter Peristaltik, Flüssigkeitsaufnahme / Sekretion, Gefühl von Stimuli, etc (für eine Übersicht siehe 1). Es enthält über 500 Millionen Nervenzellen, mehr als im Rückenmark gefunden, und enthält jede Klasse Neurotransmitter im Gehirn gefunden. Darüber hinaus ist die ENS einzigartig, dass es reflexiv funktionieren, ohne Eingabe von dem zentralen Nervensystem 2. Verständnis der ENS ist von entscheidender Bedeutung, nicht nur, um seine normale physiologische Rolle zu verstehen, aber ihr Engagement in einer Vielzahl von Neuropathien, die angeboren (Morbus Hirschsprung), erworben (Chagas), sekundäre Krankheitszuständen (diabetischer Gastroparese), Drogen verstehen können induzierte (Opioid Darm-Syndrom), oder wegen der Verletzung (postoperative Ileus) 1. Darüber hinaus können enterischen Neuronen eine erneute seinservoir für virale Infektion (Varizella-Zoster) 3. Wegen seiner Ähnlichkeit mit dem Gehirn und der hohen Konzentration von Serotonin im Darm, Medikamente bei der Behandlung des zentralen Nervensystems Mängel gerichtet haben oft unerwünschte Nebenwirkungen auf das ENS 2. Bemerkenswert ist auch, dass viele Neuropathien wie Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit ähnliche zelluläre Veränderungen in den Neuronen magensaftresistente lange vor ihrem Auftritt in zentralen Neuronen zeigen, was die ENS ein zugängliches Modell, um die Pathogenese dieser Erkrankungen 4 studieren. Daher ist ein umfassendes Verständnis der ENS eine Notwendigkeit für das Verständnis Krankheitszuständen und Verhinderung / Vorhersage pharmakologischen Nebenwirkungen. Die Neuronen des ENS wurden traditionell in der Meerschweinchen mit wholemount Vorbereitungen 5-7 oder 8 kultivierten Neuronen untersucht. Trotz der Leichtigkeit, mit der Nervenzellen in diesem großen Tier untersucht werden können, hat dieses Modell viele Einschränkungen einschließlichMangel an genetisch veränderten Stämme, Mangel an spezifischen Reagenzien zu dieser Spezies, und der hohen Kosten, die mit der Bestellung und beherbergt diese Themen verbunden. Die Entwicklung eines murinen enterale Nervensystem Modell hat den einzigartigen Vorteil der verschiedenen Knock-out-Systeme, eine breite Palette von anderen etablierten Methoden, die in Verbindung mit der Zellkultur-Technik verwendet werden können, und die Fähigkeit, eine Validierung für die Meerschweinchen-Modell bieten . Die äußere Plexus myentericus (zwischen der Längs-und Ringmuskulatur), die hauptsächlich verantwortlich für die Peristaltik des Darms Aktionen ist, sowie die submuköse und Schleimhaut-Plexi, (: Das ENS besteht aus drei Plexi, die die Länge des Magen-Darm-Trakt führen umfasste gefunden unter und innerhalb der Schleimhaut, jeweils), die im Wesentlichen steuert Flüssigkeitsaufnahme / Sekretion und Nachweis von Stimuli 1. Dieses Verfahren beginnt mit der Isolierung des Längsmuskel / myenteric Plexus (LMMP) Herstellung durch AbziehenAus der äußeren Muskulatur des Magen-Darm-Trakt. Diese dramatisch verkürzt sich auf Kontamination Probleme, die bei der Schleimschicht in der Isolierung beteiligt ist auftreten. Dadurch ist dieses Verfahren ideal für die Untersuchung der neuronalen Steuerung der Motilität anstatt sekretorischen Aktionen des ENS. Die hier vorgestellte Methode Ergebnisse in einer Mischkultur von enterischen Neuronen und Gliazellen. Mindestens zwei verschiedene Arten von Neuronen sind auf vorherige elektrophysiologischen und immunozytochemische Beobachtungen 9 basiert. Die Anwesenheit von Glia ist sehr vorteilhaft, da sie nicht nur ein wichtiger Zelltyp in ihrem eigenen Recht zu studieren, aber sie tragen zum Überleben der Neuronen 10 magensaftresistente und pflegen nativen Rezeptor-Expression auf der neuronalen Zelloberfläche 11. Darüber hinaus kann Mängel magensaftresistente Glia zu abnormen gastrointestinale Motilität Krankheitszuständen, geprägt &#39;Neuro-gliopathies &quot;12 führen. Daher legte die ENS Kultur hier rrgebnisse in mehreren Zelltypen, die reif für die Untersuchung sind. Die Vorteile dieser Methode sind einfache Isolation, preiswertes Tool Anforderungen, und eine kurze Zeit, um die Technik von erfahrenen Labor-Mitarbeiter zu meistern. Einschränkungen der Methode sind insgesamt gering Zellausbeute von hoher Gewebe Volumen und den Ausschluss von ENS Neuronen aus Schleimhaut und Submukosa Plexi. Dieses Verfahren wird als sehr vorteilhaft für Wissenschaftler, spezialisiert auf Elektrophysiologie, Immunhistochemie, single-cell PCR und andere Methoden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:79px;">Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter)</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">12-545-82</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">P6407- 5 mg</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">24-well cell culture plate</td>
			<td style="width:171px;">CELLTREAT</td>
			<td style="width:137px;">229124</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Laminin</td>
			<td style="width:171px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:137px;">354 232</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:291px;">ddH2O</td>
			<td style="width:171px;"> </td>
			<td style="width:137px;"> </td>
			<td style="width:79px;">Can prepare in lab </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">15 ml Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:171px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:137px;">188261</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">50 ml Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:171px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:137px;">227261</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">NaCl</td>
			<td style="width:171px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:137px;">BP358-212</td>
			<td style="width:79px;">MW 58.44</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">KCl</td>
			<td style="width:171px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:137px;">BP366-500</td>
			<td style="width:79px;">MW 74.55</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">NaH2PO4 .2H2O</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:137px;">S369-3</td>
			<td style="width:79px;">MW137.99</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">MgSO4</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">M7506-500G</td>
			<td style="width:79px;">MW 120.4</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S6014-5KG</td>
			<td style="width:79px;">MW 84.01</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">glucose</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Chemicals</td>
			<td style="width:137px;">D16-1</td>
			<td style="width:79px;">MW 180.16</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">CaCl22H2O</td>
			<td style="width:171px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">C5080-500G</td>
			<td style="width:79px;">MW 147.02</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">F12 media</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">11330</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:171px;">Quality Biological Inc.</td>
			<td style="width:137px;">110-001-101HI</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Antibiotic/antimycotic 100x liquid</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">15240-062</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Neurobasal A media</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">10888</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">200 mM L-glutamine</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">25030164</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF)</td>
			<td style="width:171px;">Neuromics</td>
			<td style="width:137px;">PR27022</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">8940</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Dissecting Tissue Forceps</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">13-812-41</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Cotton-Tipped Applicators</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">23-400-101</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">250 ml Graduated Glass Beaker</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">FB-100-250</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">2 L Glass Erlenmyer flask</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">FB-500-2000</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Plastic rod (child&#39;s paint brush)</td>
			<td style="width:171px;">Crayola</td>
			<td style="width:137px;">05 3516</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:291px;">Carbogen</td>
			<td style="width:171px;">Airgas</td>
			<td style="width:137px;">UN 3156</td>
			<td style="width:79px;">5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">10 ml Leur-lock Syringe</td>
			<td style="width:171px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">309604</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle</td>
			<td style="width:171px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:137px;">305167</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:291px;">Collagenase type 2</td>
			<td style="width:171px;">Worthington</td>
			<td style="width:137px;">LS004174</td>
			<td style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="84" rowspan="2" style="height:84px;width:291px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td rowspan="2" style="width:171px;">American Bioanalytical</td>
			<td rowspan="2" style="width:137px;">AB00440</td>
			<td rowspan="2" style="width:79px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">13-864-252</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Nitrex Mesh 500 &#181;M</td>
			<td style="width:171px;">Elko Filtering Co</td>
			<td style="width:137px;">100560</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Pipette Set</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">21-377-328</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:291px;">Sharpeining Stone</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">NC9681212</td>
			<td style="width:79px;">May use any brand</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:195px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:283px;">LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood)</td>
			<td style="width:108px;">Nuaire</td>
			<td style="width:137px;">NU-425-400</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">10 L Shaking Waterbath</td>
			<td style="width:108px;">Edvotek</td>
			<td style="width:137px;">5027</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:283px;">Microcentrifuge 5417R</td>
			<td style="width:108px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:137px;">5417R</td>
			<td style="width:195px;">May use a single larger centrifuge with size adapters</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:283px;">Allegra 6 Series Centrifuge</td>
			<td style="width:108px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:137px;">366816</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">HuluMixer Sample Mixer</td>
			<td style="width:108px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">15920D</td>
			<td style="width:195px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator</td>
			<td style="width:108px;">Nuiare</td>
			<td style="width:137px;">NU-4750</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:283px;">Analytical Balance Scale</td>
			<td style="width:108px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:137px;">XS104</td>
			<td style="width:195px;">May use any brand</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse

Die enterale Nervensystem ist ein riesiges Netz von Neuronen und Gliazellen, die die Länge des Magen-Darm-Trakt, die funktionell steuert gastrointestinalen Motilität. Ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von einer gemischten Population von Neuronen und Gliazellen aus dem Plexus myentericus beschrieben. Die primären Kulturen kann für mehr als 7 Tage gehalten werden, mit Verbindungen zwischen den Neuronen entwickeln und Gliazellen. Die Längsmuskel Streifen mit dem beigefügten myentericus Plexus aus dem zugrunde liegenden kreisförmigen Muskel der Maus Ileum oder Kolon abgestreift und einer enzymatischen Verdauung. In sterilen Bedingungen werden die isolierten neuronalen und Gliazellen Bevölkerung im Pellet nach Zentrifugation erhalten und plattiert auf Deckgläsern. Innerhalb von 24-48 Stunden, tritt Neuritenwachstum und Neuronen kann durch pan-neuronalen Marker identifiziert werden. Nach zwei Tagen in Kultur isolierten Neuronen feuern Aktionspotentiale durch Patch-Clamp-Studien beobachtet. Darüber hinaus können auch magensaftresistente Glia identif seinied von GFAP-Färbung. Ein Netzwerk von Neuronen und Gliazellen in enger Apposition bildet innerhalb von 5 - 7 Tage die. Enteric Neuronen können individuell und direkt untersucht mit Methoden wie Immunhistochemie, Elektrophysiologie, Kalzium-Imaging und Single-Cell-PCR. Darüber hinaus kann dieses Verfahren in genetisch veränderte Tiere durchgeführt werden. Diese Methode ist einfach durchzuführen und kostengünstig. Insgesamt macht dieses Protokoll die Komponenten des enteralen Nervensystems in einem leicht manipuliert Weise, so dass wir Ihnen besser entdecken Sie die Funktionalität der ENS in normalen und Krankheitszuständen.

Immediately following isolation of LMMP-derived cells, neurons and other cell types will not be readily evident. Living, round cells of indistinct phenotype can be seen as well as tissue detritus from incompletely digested tissue fragments and connective tissue. This flotsam is of no concern and will be largely removed with the first media change in two days. Do not attempt to clean the slides before this as the healthy, viable cells will be removed as well.
After one day in culture, neurons w...

Watch this Scientific Journal Video about An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse at JoVE.com

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Ein<em&gt; In-vitro</em&gt; Vorbereitung von isolierten Neuronen und Glia Enteric vom Plexus myentericus der erwachsenen Maus

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

an-vitro-preparation-isolated-enteric-neurons-glia-from-myenteric

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

26.4K Aufrufe.  Virginia Commonwealth University. We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.