Cochlea-Oberflächenpräparate ermöglichen die Visualisierung der gesamten Linse des Corti-Organs mittels Immunhistochemie und konfokaler Bildgebung. Es wurde im Großen und Ganzen für die Untersuchung spezifischer Cochlea-Pathologien von Interesse verwendet. Wir werden die Cochlea-Mikrodissektionsmethode modifizieren.
Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Einhaltung eines Stücks Cochlea-Epithel auf 10 Millimeter runde Abdeckungen für das Immunlabeling-Verfahren bei gleichzeitiger Vermeidung von Gewebeverlust während der mehrfachen Waschschritte. Zusätzlich zu Cochlea-Pathologien kann die Cochlea-Oberflächenpräparation auch für die Beurteilungsexpression und Haarzellregeneration genutzt werden. Für diese Technik sind grundlegende Mikroskopkenntnisse erforderlich, und die visuelle Demonstration der Methode kann dazu beitragen, dass jeder Schritt korrekt ausgeführt wird.
Demonstriert wird das Verfahren von Qiaojun Fang, einem Doktoranden aus meinem Labor. Für die zeitliche Knochenextraktion ziehen Sie die Haut sofort nach dem Tod nach vorne, um den Schädelknochen freizulegen, und verwenden Sie eine Schere, um den Knochen vom hinteren Aspekt nach vorne entlang der Mittellinie des Schädels zu schneiden. Verwenden Sie Zangen, um das Gehirngewebe zu entfernen, bevor Sie Daumen und Zeigefinger verwenden, um die zeitlichen Knochen von Mäusen ab drei Monaten manuell zu entfernen.
Legen Sie die Knochen in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 30 Millimetern mit frischen eiskalten 4%PFA und PBS unter einem Seziermikroskop und entfernen Sie die Bänder aus dem ovalen Fenster. Punktieren Sie die runde Fenstermembran mit der Nummer fünf Zangen und verwenden Sie eine 27-Spur-Nadel, die an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, die frische 4%PFA enthält, um ein kleines Loch in die Spitze der Cochlea zu bilden. Sanft und langsam durchdringen Sie die Cochlea mit einer fixativen Lösung über die runden und ovalen Fenster, bis die Lösung aus dem kleinen Loch an der Spitze wäscht.
Dann bis zu zwei durchlässige Cochleae in einzelne 20 Milliliter-Szintillationsfläschchen mit 10 Millilitern 4%PFA pro Durchstechflasche übertragen und die Proben bei Raumtemperatur zwei Stunden lang sanft aufrichten, gefolgt von einer Nachtlagerung bei vier Grad Celsius auf einem Rotator. Am nächsten Morgen die Cochleae mit drei fünfminütigen Wäschen mit frischem PBS pro Wäsche waschen. Nach der letzten Wäsche 20 Milliliter 4%EDTA in jede Durchstechflasche geben und die Proben 48 Stunden bei vier Grad Celsius mit sanfter Rührung drehen.
Berühren Sie am Ende der Inkubation den knöchernen vestibulären Teil jeder Cochlea mit Zangen, um die Elastizität der Proben zu beurteilen. Wenn die Knochen elastisch und nicht fest sind, wurde die Cochlea entkalkt. Ersetzen Sie die EDTA für jede Probe durch frische PBS.
Für die Mikrodissektion des Cochlea-Epithels greifen Sie den vestibulären Teil des temporalen Knochens mit Zangen und verwenden Sie ein Skalpell, um die apikale Drehung in einem 45-Grad-Winkel zu schneiden. Schneiden Sie vertikal entlang der schwachen Linie zwischen dem runden Fenster und dem ovalen Fenster, um die Cochlea vom vestibulären Teil zu trennen und den Cochlea-Teil mit der Basaldrehung nach unten und in die Mitte zu richten, um sich an der Spitze der Petrischale zu drehen. Aus dieser Position die knöcherne Kapsel und die Seitenwand der mittleren Drehung zum Ende schneiden, von dem der apikale Abschnitt entfernt wurde, und weiter schneiden, um den mittleren Teil vollständig von den Basal- und Hakenbereichen zu trennen.
Platzieren Sie den Basal- und Hakenteil mit der Basilarmembran-Stelle, die an der Unterseite der Schale orientiert ist, schneiden Sie die Medialis vertikal aus dem Hakenbereich ab, um die Medialis zu entfernen und schneiden Sie die Basal- und Hakenbereiche, um den Hakenteil zu trennen. Um eine Verzerrung des Gewebes zu vermeiden, schneiden Sie die Medialis aus dem Hakenbereich, bevor Sie den Basal- und Hakenbereich trennen. Schneiden Sie die relativ großen Teile der knöchernen Kapsel und seitlichen Wandgewebe der mittleren Drehung und halten Sie die seitliche Wand mit Zangen, um die knöcherne Kapsel und die seitliche Wand mit dem Boden der Petrischale auszurichten, schneiden Sie diese Gewebe von der Basilarmembranseite.
Als nächstes glätten Sie die Probe, um die sensorische Haarzellenoberfläche seitlich nach oben zu richten und den Rest der knöchernen Kapsel und der Seitenwand wegzuschneiden. Dann verwenden Sie Zangen, um die tektoriale Membran vollständig zu entfernen, um den mittleren Bereich vollständig zu trennen und entfernen Sie die knöcherne Kapsel, seitliches Wandgewebe und tektoriale Bereiche der verbleibenden Drehungen, wie gerade gezeigt. Wenn alle Cochlea-Drehungen seziert sind, verteilen Sie 0,5 Mikroliter Zell- und Gewebekleber auf die Mitte eines runden 10-Millimeter-Deckels und lassen Sie den Klebstoff drei bis fünf Minuten bei Raumtemperatur trocknen.
Die getrockneten Deckel in die Petrischale geben und alle vier Stücke jeder sensorischen Epithelprobe auf einen Deckelschlupf kleben. Dann verwenden Sie Zangen, um eine Kante jedes Coverslips zu erfassen, um die Proben in einzelne Brunnen einer Vier-Well-Zell-Kulturschale für die Immunetikettierung zu übertragen. Zur Immunolabelierung von Oberflächen-Cochlea-Synapsepräparaten jedes sensorische Epithel dreimal für fünf Minuten in frischem PBS pro Waschgang waschen, gefolgt von der Behandlung jeder Probe mit zwei Millilitern 2%nichtionisches Tensid für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator.
Am Ende der Inkubation die Tensidlösung aus jedem Brunnen absaugen und jede unspezifische Bindung mit 100 Mikroliter Blockierlösung pro Brunnen pro Brunnen für eine Stunde auf den Rotator mit sanfter Rührung bei Raumtemperatur blockieren. Waschen Sie die Proben am Ende der blockierenden Inkubation dreimal mit PBS, wie unter sanfter Erregung demonstriert, bevor Sie jedes Epithel mit 100 Mikrolitern der primären, vor Licht geschützten primären Antikörper 24 Stunden bei 37 Grad Celsius beschriften. Am nächsten Tag die Proben dreimal mit frischem PBS und sanfter Rührung pro Waschgang waschen und die Proben mit 100 Mikrolitern der entsprechenden Sekundärantikörper von Interesse für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius vor Licht geschützt kennzeichnen.
Waschen Sie die Proben am Ende der Inkubation mit drei fünfminütigen Waschungen in frischem PBS pro Waschgang, bevor Sie jeden Deckelrutsch auf einzelne Glasmikroskopschlitten mit nach oben zeigenden Proben legen. Als nächstes fügen Sie vorsichtig acht Mikroliter eines geeigneten Montagemediums in die Mitte jedes Coverslips und verwenden Sie Zangen, um weitere 10 Millimeter Abdeckungsrutsch e.B. auf jede Probe zu montieren. Dann versiegeln Sie die Seiten jedes Coverslip-Sandwiches mit klarem Nagellack, legen Sie die Proben in einen Papp-Diaordner und lagern Sie die Dias bei vier Grad Celsius.
Obwohl die Zerlegung der erwachsenen Maus cochleae für Oberflächenpräparate nicht einfach ist, sollten Forscher, die neu in der Technik sind, in der Lage sein, die Methode nach dem Üben mit 10 bis 15 Ohren zu erlernen. Die Immunolabelierung von Oberflächenpräparaten unbehandelter 10 bis 12 Wochen alter CBAJ-Mäuse mit CTBP2 und GluA2 zeigt, dass sich sowohl präsynaptische Bänder als auch postsynaptische Klemmen unterhalb der inneren Haarzellkerne befinden und auf funktionelle Synapsen hinweisend gegenübergestellt werden. Die Immunolabelierung für Myosin 7A und die Gegenfärbung mit Phalloidin und DAPI zeigt das Vorhandensein von sensorischen Haarzellen, einschließlich der äußeren Haarzellen und inneren Haarzellen und ihrer Kerne.
Die Immunolabelierung für Myosin 7A und die Gegenfärbung mit Phalloidin zeigt keine Unterschiede in der Immunreaktivität oder Homogenität mit oder ohne Verwendung von Zell- und Gewebeklebstoff. Darüber hinaus zeigt die Rasterelektronenmikroskopie von Oberflächenpräparaten von unbehandelten sechs bis acht Wochen alten C57 black 6 Mäusen eine gut organisierte V-förmige Stereocilia äußerer Haarzellen in drei Reihen der Probe. Denken Sie daran, den Cochlea mit fixativer Lösung sanft und langsam durch die runden und ovalen Fenster zu füllen, bis die Lösung aus dem kleinen Loch an der Spitze wärtig.
Bevor Sie den Hakenbereich von der Basaldrehung trennen, achten Sie darauf, die Medialis aus dem Hakenbereich zu schneiden, um die Entfernung der Medialis zu erleichtern.
