Die Finanzierung dieser Arbeit wurde durch einen Garnett Passe und Rodney Williams Memorial Foundation Projektstipendium R. Lim und AJ Camp zur Verfügung gestellt.

1. Tiere <ol><li> Die Mäuse wurden von der australischen Nagetier Centre (ARC; Perth, Australien) gewonnen und gehalten an der Universität von Sydney Bosch Tierlabor auf einem normalen 12-Stunden Licht / Dunkel-Zyklus mit ökologischen Bereicherung. Alle beschriebenen Experimente wurden von der University of Sydney Tier Ethikkommission genehmigt. </li><li> Männliche und weibliche Mäuse (C57/Bl6) wurden für alle Experimente verwendet werden, da dieser Stamm häufig als Hintergrund für genetische Manipulation verwendet werden, und kann als äquivalent zu 8-9 Wildtyp werden. </li></ol> 2. Tissue Vorbereitung <ol><li> Bereiten 300 ml eines Glycerin-Basis künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF), bestehend aus (in mM): 26 NaHCO 3, 11 Glucose, 250 Glycerin, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 1,2 MgCl 2, CaCl 2 und 2,5. Vor der Zugabe von CaCl 2, Gas die Lösung mit Carbogen (95% O 2 und 5% CO 2), um festzustellen, apH von 7,4 und vermeiden Calciumpräzipitation (Bewölkung). Einfrieren der Lösung in einem -80 ° C-Gefrierschrank für 45 min, so daß eine Ice-Slurry gebildet wird. </li><li> Tief betäuben Mäuse mit Ketamin (100 mg / kg) (Parnell, Alexandria, Australien) über eine intraperitoneale Injektion. </li><li> Sobald Hinterbeine Extremität Prise Reflexe fehlen decapitate Mäusen mit scharfen Schere aus rostfreiem Stahl und eine sagittalen Hautschnitt mit einer Rasierklinge (gerundet # 22), um den Schädel freizulegen. An dieser Stelle und in Schritten von 2,3 bis 2,8 die Schädelhöhle, Gehirn, und die zugrunde liegenden Vestibularapparat sollte so kühl wie möglich durch die regelmäßige Anwendung von eiskaltem ACSF über das Gewebe gehalten werden. </li><li> Mit dem spitzen Arm Standard Muster Schere (FST, North Vancouver, Kanada) machen einen kleinen Schnitt in den Schädel bei Lambda und entlang der Sagittalnaht. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn nicht &quot;gezogen&quot; durch die Schermesser bei diesem Schritt. </li><li> Vorsichtig schälen Scheitelbeine weg seitlich und Os occipitale posteriorly mit flachen Kurve Pearson rongeurs (FST). </li><li> Eine kleine Spatel aus rostfreiem Stahl wird dann verwendet, um heben das Gehirn von der Oberfläche des mittleren und hinteren Schädelgrube, und die freigelegte vestibulocochlea Nerven (CNVIII) schneiden in der Mitte zwischen dem Innenohr und Hirnstamm mit einer feinen Schere Iris. Schneiden diesen Nerv minimiert unnötige Spannung auf Axone der Primärafferens und deren Verbindungen mit Haarzellen. </li><li> Nach Durchtrennung des CN VIII wird das Gehirn in toto entfernt. </li><li> Die vestibuläre Labyrinth ist jetzt deutlich sichtbar in der mittleren Schädelgrube, mit dem Cochlea zeigt anteromedial. Rongeur beiden Seiten des vestibulären Labyrinth vor sanft Ausschneiden durch Ergreifen des vorderen Bogengang und Ziehen seitlich. </li><li> Tauchen Sie die ausgeschnitten Labyrinthe (Abbildung 1) in einem Seziertisch Schale mit den eiskalten, kontinuierlich vergast ACSF in Abschnitt 2.1 beschrieben. Unter einem Stereomikroskop, halten das Labyrinth zuder Boden der Schale durch Ergreifen des Cochlea. Verwenden feinen Pinzette entfernt zu kratzen an der Knochen über der vorderen Bogengang Ampulle. Sobald ein kleines Loch in den Knochen erreicht beginnen Fingern an die Knochen von der Ampulle. Vorsicht ist geboten, nicht auf die Zange durch den Knochen drücken, da dies Schäden an der zugrunde liegenden häutigen Labyrinths und Sinnesepithel verursachen kann. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis sowohl die Front-und benachbarten horizontalen halbkreisförmigen häutige Kanäle und Ampullen ausgesetzt sind (Abbildung 2). </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die isolierten Maus vestibulären Labyrinth. A. Links) Schematische Darstellung der isolierten Maus vestibulären Labyrinth. Wichtige Bezugspunkte für den Zugriff auf den vestibulären Sinnesepithel sind die Cochlea, vordere und horizontalen Bogengänge Laboreled. Sternchen zeigen den Bogengang Ampulle mit dem vestibulären Sinnesepithel. B. Rechts) Photomicrograph des isolierten vestibulären Labyrinth aus einem 1-Monate alten Maus. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Exposition der Membranöse vestibulären Labyrinth. Die Knochen über der vorderen und horizontalen Bogengang Ampullen wurden entfernt, um die schwarz / braun gesprenkelte membranöse Ampullen und zugehörige ampullären Nerven (CNVIII) offenbaren zerkratzt. Das Schema in der unteren Platte stellt die Strukturen in den hervorgehobenen Bereich der Mikroaufnahme und zeigt die Beziehung der halbkreisförmigen Kanal Kanäle der Ampullen und CNVIII. <ol start="10"><li> Mit feinen Pinzette vorsichtig heben Sie die Ampullen und zugehörige utricle vom knöchernen Labyrinth, um sicherzustellen, dass der zentrale Bereich der Ampullen (Contaligt ist, das sensorische Epithel) nicht beschädigt wird. In einigen Fällen kann der proximale Teil des halbkreisförmigen membranöse Kanal müssen möglicherweise mit Iris Schere geschnitten werden, um die Ampulle aus dem Knochen zu lösen. </li><li> Übertragen Sie die Triade, die beiden Ampullen und utricle in eine Petrischale mit Leibovitz L-15 Kulturmedium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) gefüllt. Verwenden Sie ein Glasfaserkabel zu &quot;Hintergrundbeleuchtung&quot; das Gewebe. Dies ermöglicht die übersichtliche Visualisierung der Crista, die das sensorische Epithel innerhalb der Ampullen. </li><li> Vorsichtig einen Einschnitt in der gesprenkelten &quot;Dach&quot; der utricle mit den feinen Iris Schere. Setzen Sie diesen Einschnitt durch das Dach des vorderen und dann die horizontale Ampullen. Als den Einschnitt so nahe an der Kante des sensorischen Epithels möglichst ohne sie zu berühren (Fig. 3A). Stellen Sie sicher, dass es keine Stücke von Membran über der Sinnesepithel (3B) </li><li> Übertragen Sie die isolierten halb intakt Vorbereitung zu einem kleinen Glass-Boden Aufnahme Kammer mit L-15 Medien gefüllt. Belasten die Herstellung mit einem Raster aus feinen Nylonfasern, die an einem abgeflachten U-förmigen Platindraht (3B). Idealerweise werden die Fasern des Gitters nicht überlagern Sinnesepithel jedoch in einigen Fällen, in denen mehr Stabilität erforderlich ist, eine einzelne Faser Durchschneiden Sinnesepithel vielleicht bevorzugt. </li></ol><img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die isolierte semi-intakten Vorbereitung des vestibulären Sinnesepithel. A. Schematische Darstellung der semi-intakten Vorbereitung und Elektroden-Konfiguration. Die Ampulle über der Crista wurde &quot;de-Dach&quot;, um die Oberfläche des Sinnesepithel (grün) freizulegen. B. Photomicrograph der semi-intakten &#39;Dreiklang&#39; Vorbereitung zeigt die vordere (ac) und horizontalen (hc) Crista (utricle verdecktHinterbeine ac). Beachten Sie die Nylonfaser verwendet werden, um die Herstellung der Basis der Aufnahme Kammer zu sichern. Maßstab:. 100 um C. Eine Aufnahme Elektrode auf einem einzelnen vestibulären Haarzellen positioniert. Maßstab: 15 um. 3. Elektrophysiologie <ol><li> Perfundieren die semi-intakten Präparat mit kontinuierlich Sauerstoff L-15-Medium. Der Datenträger enthält einen pH-Indikator (Phenolrot) und die Farbe des Mediums sollte in den Aufnahmen überwacht werden. Der pH-Wert mit Sauerstoff sollte 7,3-7,4 sein und entsprechen einer roten Farbe. </li><li> Bereiten Aufnahme Pipetten von 1,5 mm (1,19 mm ID) Borosilikatglas mit einem Zwei-Schritt-Protokoll (Wärme Stufe 1: 72, und Wärme Schritt 2: 50) auf einem Feinpipettenziehvorrichtung (Narishige, Japan, Modell PP-830), um ein zu erreichen endgültige Impedanz von 3-4 MOhm. </li><li> Füllen Sie den Schaft der Pipette mit 3-4 mm Kaliumfluorid-basierte interne Lösung, die (in mm) 110 KF, KCl 12, 27 KOH, 1 NaCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 1,8 MgCl 2,3 D-Glukose und 2 Na-ATP, pH 7,4 mit KOH. </li><li> Wickeln der Schaft der Pipette 2-3 mal und bis zur Spitze wie möglich mit einer dünnen Parafilm, um die Elektrode zu isolieren und zu reduzieren Pipette Kapazität. </li><li> Positionieren Sie die Pipette über die Sinnesepithel unter Low-Power-Vergrößerung (5X) auf einem aufrechten Mikroskop (Olympus BX51). Wechseln Sie zu hohe Leistung (40X) und visualisieren einzelnen vestibulären Haarzellen mit einem angeschlossenen CCD-Kamera. </li><li> Position Pipette an der Membran eines visualisierten Haarzellen (3C) mit einem Mikromanipulator (Sutter Instruments, Kalifornien, USA). Sobald ein Gigaohm Dichtung erreicht, Bruch der Zellmembran mit einer kleinen Menge von Unterdruck durch eine Saugöffnung auf der Pipettenhalter aufgebracht. </li><li> Machen whole-cell voltage clamp Aufnahmen unter Verwendung von Standardverfahren 8-9. </li></ol> 4. Zwei-Photonen-Mikroskopie <ol><li> Vorbereiten einer 0,9% igen Kochsalzlösung, enthaltend 5 mM Oregon Green488 BAPTA-1 (OGB 1-; hexakaliumsalz; Invitrogen, Deutschland). </li><li> Während noch unter Wasser, legen Sie die &quot;de-Dach&quot; semi-intakten Dreiklang Vorbereitung auf ein kleines Stück Filterpapier (4x4 mm, 0,8 um dick, Millipore, Deutschland) sicherzustellen, dass die Sinnesepithel ungehindert von oben ist. </li><li> Das Filterpapier und Vorbereitung auf die Salzlösung bedeckt Basis Platinelektrode (7 ul) eines Elektroporators bestehend aus der Kombination von einem Impulsgeber und einem breitbandigen Verstärker, und die Abdeckung mit weiteren 5 ul 5 mM Lösung des synthetischen Calcium Indikator-Farbstoff Oregon Green 488 BAPTA-1 (Abbildung 4). </li></ol><img alt="Fig. 4" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig4.jpg" /> Abbildung 4. Masse Elektroporation. A. schematische Darstellung Querschnitt Elektroporation Konfiguration. Der semi-intakten Zubereitung (*) auf einem Stück Filterpapier in Calcium dy eingetaucht platzierte (Oregon Green 488 BAPTA-1) und Strom zwischen 2 Platin-Elektroden aufgebracht. Adaptiert von Briggman und Euler, 2011 10. <ol start="4"><li> Bringen Sie die obere Platinelektrode parallel mit der Basis-Elektrode in einem Abstand von etwa 2 mm, darauf achten, daß die Ausrichtung der Vorbereitung stören, wenn sie mit der Oregon Green 488 BAPTA-1-Lösung wird zu kontaktieren. </li><li> Übergeben Sie einen kurzen Stromimpuls in der Zubereitung (Parameter für den aktuellen, +13 V, 10 ms Impulsbreite, Frequenz 1 Hz, 10 Rechteckpulse) 10-11. </li><li> Auf dem Boden einer Glasboden Aufnahme Kammer mit L-15-Medium gefüllt ist, legen Sie einen kleinen Klecks Silikonöl und Position der semi-intakten Vorbereitung auf sie, wieder dafür, dass die Sinnesepithel ungehindert von oben ist. Um Stabilität in Bildgebung zu gewährleisten, ersetzen Sie die Nylon-Gitter über die Zubereitung wie oben beschrieben (siehe Punkt 2.13). </li><li> Mit der Zwei-Photonen-Mikroskop machen optischen Aufnahmen spontanneous Calcium Aktivität im sensorischen Epithel (Abbildung 7) mit Standard Bildgebungsprotokolle 10-11. </li></ol>

<ol>
	<li>Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Otoferlin+is+critical+for+a+highly+sensitive+and+linear+calcium-dependent+exocytosis+at+vestibular+hair+cell+ribbon+synapses.">Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).</li><li>Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+pre-+and+post-synaptic+recording+from+the+peripheral+vestibular+calyx+and+its+included+type+I+hair+cell.">Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell.</a> , (2009).</li><li>Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+dependent+currents+in+type+I+and+II+hair+cell+and+calyx+terminals+of+primary+afferents+in+an+intact+in+vitro+mouse+vestibular+crista+preparation.">Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation.</a> , (2009).</li><li>Chatlani, S., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recordings+from+calyx+endings+in+the+turtle+posterior+crista.">Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista.</a> , (2010).</li><li>Songer, J. E., Eatock, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+in+the+mammalian+saccule.">Transduction in the mammalian saccule.</a> , (2010).</li><li>Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vestibular+primary+afferent+activity+in+an+in+vitro+preparation+of+the+mouse+inner+ear.">Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear.</a> J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).</li><li>Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+accumulation+between+type+I+hair+cells+and+calyx+terminals+in+mouse+crista.">Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista.</a> Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).</li><li>Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+synaptic+transmission+differs+in+mouse+type+A+and+B+medial+vestibular+nucleus+neurons+in+vitro.">Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro.</a> J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).</li><li>Camp, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+glycine+receptor+function+reduces+excitability+of+mouse+medial+vestibular+nucleus+neurons.">Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons.</a> Neuroscience. 170, 348-360 (2010).</li><li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina.">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li><li>Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wiring+specificity+in+the+direction-selectivity+circuit+of+the+retina.">Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina.</a> Nature. 471, 183-188 (2011).</li><li>Rennie, K. J., Streeter, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+currents+in+isolated+vestibular+afferent+calyx+terminals.">Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals.</a> J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).</li><li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog,+Rana+catesbeiana.">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li><li>Rennie, K. J., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+currents+in+isolated+vestibular+hair+cells+from+the+guinea-pig+crista+ampullaris.">Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris.</a> Hear. Res. 51, 279-291 (1991).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die zugrunde liegenden Mechanismen unseren Gleichgewichtssinn haben begrenzte Aufmerksamkeit im Vergleich mit anderen sensorischen Systemen erhalten, z. B. die visuelle und auditive Systeme. Von den Studien, die Veränderungen in der vestibulären oder Balance-Funktion untersucht haben, haben die meisten auf verhaltensorientierten Maßnahmen einschließlich der vestibulookulären Reflex konzentriert, mit unvollständigen Kenntnis der fundamentalen Bausteine ​​der Balance-den vestibulären Haarzellen sich. D...

Trotz der bedeutenden Beitrag des vestibulären Systems zu unserem täglichen Leben, bleiben ein klares Verständnis der Prozesse, die für die beobachtete Abnahme in vestibulären Funktion mit dem Alter schwer zu fassen. Ein Grund für diesen Mangel an Wissen ist, dass Rückgang der vestibulären Funktion hat fast ausschließlich erforscht mit Verhaltensstörungen Assays, einschließlich der vestibulookulären Reflex (VOR), eine genaue Anzeige der extrinsische vestibulären Funktion, sondern bietet nur begrenzten Einblick in die Veränderungen der intrinsischen Komponenten . Dies ist ein wesentliches Hindernis für unser Verständnis der vestibulären Haarzellen Funktion in Gesundheit, Krankheit oder Alterung. Zwar gibt es viele Studien einzelner vestibulären Haarzellen wurde ein entscheidender Nachteil war die Abhängigkeit von akuten Haarzellen Zubereitungen, in denen Haarzellen und sogar Kelch afferenten Terminals aus ihrer normalen Umgebung über mechanische und / oder enzymatische Behandlung entfernt werden. Solche Ansätze zwangsBly stören das empfindliche Mikroarchitektur zwischen Haarzellen und Kelch und Haarzellen und Stützzellen. Mit der Entwicklung von semi-intakten Präparate 1-5 und einem isolierten Maus Labyrinth Zubereitung 6, gibt es jetzt eine Möglichkeit, die verschiedenen Formen der synaptischen Kommunikation unter den Bedingungen, die stärker die in vivo ähneln studieren. Tatsächlich zeigte Lim et al. (2011) deutliche Unterschiede in ganzen Zellen Ströme von akut isoliert Typ I aufgezeichnet vestibulären Haarzellen zu denen, die eingebettet in die Neuroepithel blieb verglichen. Insbesondere wird angenommen, dass Kalium in den interzellulären Raum ansammeln, zwischen den Haarzellen und Kelch afferenten und signifikant verändern Haar-Zell-Antwort 7. Diese Art von Informationen wäre unmöglich, ohne die semi-intakten Vorbereitung des vestibulären Sinnesepithel hier beschriebenen zu erhalten. Wir zeigen die semi-intakten Präparat der Maus crista 3Und zeigen repräsentative Ergebnisse von whole-cell Patch Elektrophysiologie erhalten und Zwei-Photonen-Kalzium-Imaging.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leibovitz medium L-15</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>L4386-10X1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BAPTA-1-oregon green</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>O6806 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereo microscope</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>A60S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Upright microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>BX51WI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two-photon microscope</td>
 <td>Olympus/La Vision</td>
 <td>BX51WI/ TriMScope II</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont #5 SF Forceps</td>
 <td>FST</td>
 <td>11252-00</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Friedman-Pearson Rongeurs</td>
 <td>FST</td>
 <td>16221-14</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Standard Pattern Scissors</td>
 <td>FST</td>
 <td>14001-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>InstraTECH A-D converter</td>
 <td>HEKA</td>
 <td>ITC-18</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sutter Micromanipulator</td>
 <td>Sutter</td>
 <td>MP-225/M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>multiclamp amplifier</td>
 <td>Axon Instruments</td>
 <td>700B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data acquisition software (electrophysiology)</td>
 <td>Axograph</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imspector Data acquisition software (two-photon)</td>
 <td>Max Planck innovation</td>
 <td>N/A</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

an isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy

Verstehen vestibulären Haarzellen funktionieren unter normalen Bedingungen, oder wie Trauma, Krankheit und Altern stören diese Funktion ist ein wichtiger Schritt in der Entwicklung von präventiven Ansätze und / oder neue therapeutische Strategien. Allerdings haben die meisten Studien, die abnormale vestibulären Funktion nicht auf der zellulären Ebene gewesen, aber konzentrierte sich hauptsächlich auf Verhaltens-Assays Vestibularisausfall wie Ganganalysen und vestibulookulären Reflex Leistung. Während diese Arbeit wertvolle Daten über das, was passiert, wenn etwas schief geht ergeben hat, ist nur wenig Informationen über die zugrunde liegenden Ursachen der Funktionsstörung aufgelesen. Von den Studien, dass auf der zellulären und subzellulären Prozessen, die Vestibularfunktion zugrunde zu konzentrieren, haben die meisten auf akut isolierten Haarzellen, ohne ihre synaptischen Verbindungen und Unterstützung Zellumgebung verlassen. Daher ist eine große technische Herausforderung gewesen Zugriff auf die außerordentlich empfindlich vestibulären Haarzellen in einem prepTrennung, die am wenigsten gestört, physiologisch. Hier zeigen wir eine semi-intakten Präparat der Maus vestibulären Sinnesepithel, die die lokale Mikroumgebung behält einschließlich Haarzellen / primären afferenten Komplexe.

Die elektrophysiologischen Eigenschaften des vestibulären Haarzellen sind abhängig von der komplexen microarchitecture 7, in dem sie eingebettet sind. 5 zeigt, dass die semi-intakten Epithel vestibulären Herstellung verwendet werden, um zwischen Typs unterschieden werden können I Haarzellen (5A), Typ II Haarzellen (5B), und der Kelch primären afferenten (5C) auf der Grundlage charakteristische Ganzzell Leitwerte. Diese Merkmale beinhalte...

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An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Analyse der vestibulären Haarzellen Funktion wird durch ihre Lage tief innerhalb der schwierigste Teil des Schädels, der Felsenbein kompliziert. Die meisten funktionalen Haarzellen Studien haben akut isolierten Haarzellen verwendet. Hier beschreiben wir eine semi-intakten Herstellung von Maus vestibulären Epithel für elektrophysiologische und Zwei-Photonen-Mikroskopie Studien.

Eine Isolierte Semi-intakt Vorbereitung der Maus Vestibuläre Sinnesepithel für Elektrophysiologie und hochauflösende Zwei-Photonen-Mikroskopie

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

an-isolated-semi-intact-preparation-mouse-vestibular-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.8K Aufrufe.  University of Sydney. Analyse der vestibulären Haarzellen Funktion wird durch ihre Lage tief innerhalb der schwierigste Teil des Schädels, der Felsenbein kompliziert. Die meisten funktionalen Haarzellen Studien haben akut isolierten Haarzellen verwendet. Hier beschreiben wir eine semi-intakten Herstellung von Maus vestibulären Epithel für elektrophysiologische und Zwei-Photonen-Mikroskopie Studien.

Serie: An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Forschung

Neurowissenschaften

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

Tissue Vorbereitung und Immunfärbung von Maus sensorischen Nervenfasern innervieren Haut und Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Ein<em&gt; In-vitro</em&gt; Vorbereitung von isolierten Neuronen und Glia Enteric vom Plexus myentericus der erwachsenen Maus

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In-vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie einzelner Nervenenden in der Haut

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Die Quantifizierung der zerebrale vaskuläre Architektur unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American bullfrog, has become a mainstay of auditory and vestibular research. Studies of this organ have revealed how sensory cells hair can actively detect signals from the environment. Because of these studies, we now better understand the mechanical gating and localization of a hair cell&#39;s transduction channels, calcium&#39;s role in mechanical adaptation, and the identity of hair cell currents. This highly accessible organ continues to provide insight into the workings of hair cells. Here we describe the preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies on its hair cells. We include the complete dissection procedure and provide specific protocols for the preparation of the sacculus in specific contexts. We additionally include representative results using this preparation, including the calculation of a hair bundle&#39;s instantaneous force-displacement relation and measurement of a bundle&#39;s spontaneous oscillation.

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog Rana catesbeiana

The American bullfrog&#39;s (Rana catesbeiana) sacculus permits direct examination of hair-cell physiology. Here the dissection and preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies is described. We show representative experiments from these hair cells, including the calculation of a bundle&#39;s force-displacement relation and measurement of its unforced motion.

Physiologische Herstellung von Haarzellen aus dem Sacculus der American Bullfrog (<em&gt; Rana catesbeiana</em&gt;)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...