The present work was supported by the German research foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; the research school of the Ruhr University Bochum (GSC98/1) and the priority program SSP 1172 "Glia and Synapse", Fa 159/11-1,2,3).

Die Versuche mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem deutschen Recht und der Deutschen Gesellschaft für Neurologie Leitlinien der Tierhaltung. Die Tierpflege und -nutzung Gremien der Ruhr-Universität Bochum haben die entsprechenden Genehmigungen erteilt. 1. Vorbereitung und Bearbeitung von kortikalen Astrozyten Hinweis: Führen Sie diese Schritte des Protokolls mindestens 7 d, bevor zu den nächsten Schritten fortfahren, da die Astrozytenkulturen in konfluente Monolayer entwickeln sollten, bevor die Neuronen vorbereitet sind. Primäre Astrozyten aus gemischten Gliazellen Kulturen abgeleitet von Maus Welpen um postnatalen Tag erhalten (P) 0-3. Drei Gehirne (6 Rinden) pro T75-Flasche verwendet werden sollen. <ol><li> Bereiten Sie die Astrozyten Medium durch Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% v / v Pferdeserum und 0,1% v / v Gentamycin unter sterilen Bedingungen zu ergänzen. Speichern das Medium bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen. </li><li> Mantel 3x T75-Flaschen with 10 ug / ml Poly-D-Lysine (PDL; in Zellkultur-grade Wasser) für 2 mindestens 1 h bei 37 ° C in Gegenwart von 6% v / v CO. Nach dem Auftragen waschen die Kolben zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ungebundene Kationen zu entfernen, und fügen Sie 9 ml Astrozyten Medium. </li><li> Für die Herstellung der Gehirne, mit 10 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 10 cm Petrischale und 1 ml HBSS auf 1x 15 ml-Röhrchen auf 1x (unabhängig von der Anzahl der Köpfe, die verwendet wird). Halten Sie eine chirurgische Schere, 2 feinen Pinzette und ein Fernglas griffbereit für das Verfahren. </li><li> Enthaupten 3 Welpen schnell mit den chirurgischen Schere und sammeln Sie die Köpfe in einem leeren 10-cm-Schale. <ol><li> Führen Sie die Vorbereitung der Rinden unter dem Binokular. Mit zwei feinen Pinzette, entfernen Sie die Rückenhaut vom Schädel an der Mittellinie von der Halsbereich ausgehend bis in Richtung der Höhe der Augen. Danach wird das Gehirn mit seinen Blutgefäße unter der Schädel sichtbar. </li><li>Befestigen Sie den Kopf am rostralen Ende mit einem Paar Zangen und einschneiden die Mittellinie des Schädels, der am hinteren Ende beginnen. Anschließend befestigen Sie den rechten und linken Hälften des Schädels, das Gehirn zu belichten. </li><li> Schließen Sie die Spitze der Zange und positionieren es ventral unter dem Gehirn. Heben Sie das Gehirn aus dem Schädel und übertragen sie in die HBSS gefüllte 10 cm Petrischale. Gehen Sie auf die gleiche Weise mit den restlichen Probe, bis alle Gehirne in der Schale gesammelt werden. </li></ol></li><li> Nachdem die Gehirne zu sammeln, mit der Trennung der Rinden starten, indem Sie die Rautenhirns mit einer Zange wie eine Schere Abschnüren. Führen Sie einen Mittelschnitt zwischen den beiden Hemisphären mit einer Pinzette. Fix vorsichtig das Gehirn mit einer Pinzette und schneiden Sie die Mittelhirns und die Riechkolben eine zweite Pinzette, um am Ende mit den kortikalen Hälften aus. </li><li> Fix eine kortikale Hälfte mit einer Zange und ziehen die Meningen von den Hemisphären durch Lösen sie fROM mit der Seitenkante und sie anschließend von der kortikalen Oberfläche ziehen eine zweite Pinzette. </li><li> Drehen Sie die kortikale Hälfte mit seiner Oberfläche in Richtung der Schale orientiert nach unten; sorgfältig sezieren und die sichelförmigen Hippocampus mit einer Pinzette entfernen. Übertragen Sie die einzelnen Rinden in den konischen 15 ml-Röhrchen eine geschlossene Zange mit einem individuellen Kortex zu tragen. </li><li> Nachdem alle Rinden, Transit in den sterilen Laminarströmungsabzug zu sammeln und mit den Vorbereitungen für die Dissoziation des Rindengewebe beginnen. </li><li> 1 ml DMEM in ein 2 ml Reaktionsgefäß und Zugabe von 0,1% w / v Papain (30 Einheiten). Inkubieren der Suspension in einem Wasserbad bei 37 ° C, bis eine geklärte Lösung (ca. 3 min) entwickelt. In 0,24 mg / ml L-Cystein und 20 ug / ml DNAse und leicht schütteln. HINWEIS: Für die Verdauung, ca. 1 ml Enzymlösung benötigt. </li><li> Filter (0,22 um Porengröße) zu erhalten 1 ml sterilen Lösung vor der Zugabees dem kortikalen Gewebe. Inkubieren der Röhrchen für 30 min - 1 h bei 37 ° C (dh in einem Wasserbad). Hinweis: Die Schritte 1,11-1,14 sind kritisch und sollten innerhalb von 15 Minuten abgeschlossen sein. </li><li> Um die Verdauung Reaktion zu beenden, 1 mL Astrozyten Medium und sorgfältig das verdaute Gewebe unter Verwendung einer 1 ml Pipette verreiben. Für Verreiben, sanft die Pipette Kolben bewegen, wodurch Ansaugen und die kortikale Gewebesuspension Extrudieren. </li><li> Sobald das Gewebe in eine Einzelzellsuspension dissoziiert worden, 5 ml Astrozyten Medium und Zentrifuge für 5 Minuten bei 216 x g. </li><li> Aspirieren der Überstand vorsichtig von der resultierenden Pellets und Resuspendieren der Zellen in 1 ml Medium Astrozyten. </li><li> Fügen Sie die Zellsuspensionen zu T75-Flaschen aufgefüllt mit 9 ml Astrozyten-Medium (siehe 1.2). </li><li> Inkubieren der Zellen bei 37 ° C im Inkubator in Gegenwart von 6% v / v CO 2. Nach 4 d, führen Sie das erste komplette Mediumwechsel (10 ml). d 3 - Danach wird das Kulturmedium alle 2 ändern. </li><li> Nach 7 d, prüfen Sie, ob die Zellen eine konfluente Monoschicht gebildet haben. Wenn nicht, warten weitere 2 - 3 Tage bis zur vollständigen Einmündung der Kultur erreicht wird. HINWEIS: Astrozyten große abgeflachte Zellkörper anzuzeigen, am Boden des Kolbens lokalisieren und keine nennenswerten zelluläre Prozesse zu entwickeln. Sie unterscheiden sich von den kleinen Phasenkontrast hellen Vorläuferzellen und Mikroglia die sich auf der Oberseite des Monolayer 17. </li><li> Um die Beseitigung der Vorläuferzellen zu erhalten und eine reine Astrozyten Kultur, legen Sie die T75-Flaschen auf einem Orbitalschüttler erhalten und die Kulturen O / N bei 250 Umdrehungen pro Minute schütteln. Sicherzustellen , dass die Temperatur auf 37 ° C eingestellt wird und dass der Filter des Kolbens mit Laborfilm versiegelt 2 Verdampfen des CO zu verhindern. </li><li> Am nächsten Tag absaugen Medium und fügen Sie 10 ml frisches Kulturmedium ergänzt mit 20 &amp; mgr; M Cytosin-1-β-D-arabinofuranoside (AraC) zu Eliminate Restteilender Zellen. HINWEIS: Inkubation mit AraC für 2 - 3 d in den Inkubator bei 37 ° C, 6% CO 2 wird in einer reinen Kultur von Astrozyten führen. </li><li> Überwachen Sie die Reinheit der Astrozytenkulturen durch visuelle Inspektion unter dem Lichtmikroskop. Wenn Restphasenkontrast heller Vorläuferzellen und Mikroglia noch 17 auf der Oberseite der astrozytären einschichtigen befinden (siehe Schritt 1.16), wiederholen Sie die Schritte 1.18 und 1.19. HINWEIS: Die konfluenten Monolayern und reine astrocyte kann für bis zu 14 d in den Inkubator (37 ° C, 6% v / v CO 2) vor dem Fortfahren mit dem nächsten Schritt beibehalten werden. Ändern Sie die Hälfte des Mediums alle 3 d. Sammeln Sie nicht, einfrieren und die Astrozyten auftauen, da diese Zellen ihre neuronalen unterstützende Eigenschaften durch den Speichervorgang zu verlieren. </li></ol> 2. Vorbereitung Astrozyten für die indirekte Cokultur Hinweis: 48 - 72 h, bevor die Neuronen, die Übertragung Astrozyten auf die cel Vorbereitungl-Kultureinsätzen. Im Allgemeinen liefert eine einzelne T75-Kolben eine ausreichende Anzahl von Zellen, die die neuronalen Kulturen mit einer Zubereitung erhalten zu unterstützen. <ol><li> So viele Einsätze nach Bedarf in 24-Well-Platten. Mantel jeder Einsatz mit 10 ug / ml PDL (gelöst in Zellkultur-grade Wasser) für etwa 1 h bei 37 ° C, 6% v / v CO 2. Nach der Inkubation waschen die Einsätze zweimal mit PBS. In der Zwischenzeit gehen mit der Herstellung von Astrozyten. HINWEIS: Die mit PBS gefüllt Einsätzen gehalten werden kann, bis die Astrozyten Zellsuspension zur Verwendung bereit ist. </li><li> Saugen Sie das Astrozyten Medium (mit AraC) und waschen Sie die Kultur einmal mit 10 ml PBS jegliche restliche Serum entfernt wird, um sicherzustellen. </li><li> 3 ml 0,05% Trypsin-EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) in den Kolben und Inkubieren der Zellen für Trypsinisierung bei 37 ° C, 6% v / v CO 2 für ca. 10 min. </li><li> Kontrolle der Zellablösung durch visuelle Inspektion mit Hilfe eines Mikroskops und facilitate die Ablösung der Zellen durch die Seite der Kolben gegen den Desktop tippen. Hinweis: Die Schritte 2,5-2,8 sind kritisch und sollten innerhalb von 15 fertig sein - 20 min. </li><li> Nach der Trypsinisierung aussetzen erneut die Zellen vorsichtig in 7 ml Astrozyten Medium und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml-Röhrchen. Zentrifuge für 5 min bei 216 x g. </li><li> aspirieren vorsichtig den Überstand und Zellpellet in 1 ml Astrozyten Medium. </li><li> Zählen Sie die Zellen unter Verwendung einer Zählkammer. </li><li> Füllen Sie den Boden der Wells der 24-Well-Platte mit 500 &amp; mgr; l Astrozyten Medium und übertragen 25.000 Zellen in 500 &amp; mgr; l Astrozyten Medium in jedem einzelnen Einsatz. Inkubieren der Kultur bei 37 ° C, 6% v / v CO 2. HINWEIS: Nach 42 bis 72 h die Kulturen ungefähr 100% Konfluenz erreichen. In diesem Stadium ist die Reinheit der Kultur kann durch Immunzytochemie 11 überprüft werden. Die konfluenten Kulturen können die bis fortfahren bis zu 7 d beibehalten werdennächster Schritt. Ändern Sie die Hälfte des Mediums alle 3 d. </li></ol> 3. Herstellung von primären Neuronen im Hippocampus Hinweis: Primäre Maus Hippocampus-Neuronen sollte von E15.5 abgeleitet werden - E16 Embryonen von timed schwangeren Mäusen. <ol><li> Bereiten neuron Medium (MEM mit 10 mM Natriumpyruvat, 0,1% w / v Ovalbumin, 2% v / v B27 Medium zu ergänzen, und 0,1% v / v Gentamicin (steril filtriert)), und Vorbereitungsmedium (HBSS mit 0,6% w / v Glucose und 10 mM HEPES (4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazin-ethansulfonsäure)). Vorwärmen und pre-äquilibriert das Neuron Medium in Saugflaschen bei 37 ° C, 6% v / v CO 2. </li><li> Das Glas-Deckgläschen (12 mm Durchmesser) in die Vertiefungen von 24-Well-Platten (verwenden, um die speziellen Deckgläsern, die für die Verwendung mit Zellkultureinsätze eingekerbt sind). <ol><li> Mantel für mindestens 1 h mit 15 &amp; mgr; g / ml Poly-DL-Ornithin in Wasser (Zellkultur-grade) bei 37 ° C. Verwenden Sie mindestens 500 &amp; mgr; l pro Vertiefung, um sicherzustellen,die Deckgläser vollständig bedeckt. Waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit PBS. Lassen Sie die PBS in den Vertiefungen, bis die Zellen Plattierung. Stellen Sie sicher, dass die Vertiefungen nicht austrocknen. </li></ol></li><li> Um die hippocampi sezieren, bereiten 3x 10 cm Teller mit Präparationsmedium gefüllt und 1x 2 ml-Röhrchen mit 1 ml Herstellungsmedium. Bereiten Sie Schere und zwei feinen Pinzette. </li><li> Opfere die schwangere Maus durch Genickbruch, sterilisieren den Bauch durch Waschen mit 70% v / v Ethanol, und öffnen Sie den Bauch mit einer scharfen Schere. Excise die wulstigen Gebärmutter vorsichtig mit einer Schere und übertragen Sie die Orgel in 1x 10 cm Teller mit Präparationsmedium gefüllt. </li><li> Dann entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter. Vorsichtig die Gebärmutter einzuschneiden und die Eihaut entfernen, ohne dass durch Verwendung von 2 Zange um die Embryonen zu schädigen. Danach enthaupten jeden Embryo mit einer Schere und übertragen Sie die Köpfe in eine zweite 10-cm-Schale mit Präparationsmedium versorgt. </li><li> Fahren Sie mit der Vorbereitung der Köpfe (ähnlich dem preparation beschrieben in 1,4 bis 1,7). <ol><li> den Schädel und die Haut im Halsbereich der Nähe des Rautenhirns, die senkrecht zur neuraxis immobilisieren den Kopf mit einer Pinzette und einzuschneiden. Verwenden Sie ein zweites Paar von Zange sowohl Schädel und Deckhaut zu heben, und biegen Sie die weichen Schädelkappe in Richtung des rostralen Ende des Kopfes, wodurch das Gehirn ausgesetzt wird. </li><li> Mit Hilfe von 2 Pinzetten, um das Gehirn von der Schädelhöhle lösen. Dazu an den Riechkolben dies, schließen 1 Pinzette und trennen das Gehirn aus dem Schädel beginnt und in Richtung des Rautenhirns zu bewegen. Sammeln Sie die Gehirne in einem anderen 10-cm-Schale mit Präparationsmedium gefüllt. </li></ol></li><li> Präparieren Sie die hippocampi aus den Cortex-Einheiten wie oben für die Astrozyten Zubereitung beschrieben (Schritt 1.6). Entfernen Sie den Hippocampus von jeder Hemisphäre und sammeln sie in der 2-ml-Röhrchen mit Präparationsmedium gefüllt. </li><li> Nach der Präparation abgeschlossen, übertragen Sie den Schlauch in den sterilen Laminar-Flow-Bank und Digest die Hippocampus-Gewebe mit 1 ml Aufschlußlösung Papain enthalten. Bereiten Sie die Aufschlusslösung wie in Schritt 1,9 bis 1,10, aber verwenden MEM statt DMEM. Hinweis: Die Schritte 3,9-3,12 sind kritisch und sollte innerhalb von 10 abgeschlossen sein - 15 min. </li><li> Nach Abschluss der Verdauung, zurückziehen sorgfältig die Aufschlußlösung durch vorsichtiges Absaugen mit einer Pipette. </li><li> Waschen Sie die hippocampi 3-mal mit Neuron Medium durch aufeinanderfolgende Zugabe und danach sorgfältig die Entnahme von 1 ml frisches Kulturmedium pro Waschgang. Zentrifuge nicht die Zellsuspension. </li><li> Nach dem letzten Waschschritt sorgfältig verreiben das Gewebe in 1 ml Medium Neurons. </li><li> Zählen Sie die Zellen, die eine Zählkammer mit und Platte 35.000 Zellen in 500 &amp; mgr; l Neuron Medium pro einer einzigen Vertiefung einer 24-Well-Platte (die Platte erwähnt in 3.2). HINWEIS: Optional kann eine Zelle aliquoten mit Trypanblau counterstained werden, um die Vitalität der Zellpräparation zu beurteilen. Kontrollieren Sie die Plattierungsdichte durch visuelle InspektionIon mit dem Mikroskop (in der Regel 90 bis 110 Zellen pro Gesichtsfeld eines Standard-10X-Objektiv). </li><li> Ort Neuronen in den Inkubator bei 37 ° C, 6% v / v CO 2 für 1 h. </li><li> Sende Inkubation, nehmen die vorbereiteten Einsätze (ausgesät mit konfluenten Astrozyten Monolayern) aus dem Inkubator (siehe Schritt 2.8). Tauschen Sie das Medium durch die Astrozyten Medium ansaugt und mit 500 &amp; mgr; l frisches Neuron Medium zu ersetzen. HINWEIS: Die Einsätze konfluenten Astrozyten Monolayern nach 2 beherbergen sollte - 3 DIV (Tage in vitro). </li><li> Legen Sie die Einsätze mit Astrozyten sorgfältig in die Vertiefungen, die die Neuronenkulturen enthalten (Schritt 3.13) mit einer sterilen Zange. </li><li> Platzieren der resultierenden indirekten neuron-Astrozyten Kokultur wieder in den Inkubator bei 37 ° C, 6% v / v CO 2. HINWEIS: Unter diesen Bedingungen kann Neuronen für bis zu 4 Wochen in vollständig definiertem Medium kultiviert werden. Kein Mediumwechsel notwendig ist. Für Langzeitkulturen, wird empfohlen, e zu füllenMPTY Brunnen mit sterilem Wasser, um die Verdunstung von der 24-Well-Platte zu reduzieren. </li><li> Führen Sie in - vitro - Zellanalysen nach Kulturperioden gewünscht (zB für Immunzytochemie, PCR, Western Blot, elektrophysiologischen Ableitungen (Patch - Clamp oder Multielektroden - Array)) 7,15,18. HINWEIS: Die Kultursystem eignet sich auch für akute und chronische pharmakologische Behandlung der Kulturen 11. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Das Hauptziel des aktuellen Protokolls ist es, völlig getrennte neuronale und astrozytären Kulturen, während sie in gemeinsam genutzten Medium beibehalten wird. Aus diesem Grund erhalten die Reinheit der Kulturen sollten zu Beginn des Verfahrens überprüft werden. Wir empfehlen die Verwendung von Neuron-spezifischen Tubulin, neurofilaments oder NeuN Protein als neuronale Marker GFAP als astrozytären Marker, O4 Antigen als Oligodendrozyten Vorläufermarker und Iba1 Protein Mikroglia zu identifizieren. <p class="...

In den vergangenen Jahrzehnten hat sich die allgemeine Interpretation von neuroglia Funktion aus der Zuschreibung eines nur unterstützend auf eine aktive regulatorische Rolle in Bezug auf neuronale Funktion 1 entwickelt. Aufgrund ihrer prominenten Auswirkungen auf Gehirn - Homöostase in Gesundheit und Krankheit 2, Astrozyten sind von besonderem Interesse für die wissenschaftliche Gemeinschaft. In den letzten Jahren haben auf Neuron-Glia - Wechselwirkung in vivo und in vitro 3 eine Vielfalt von Studien konzentriert. Doch die meisten der Kultursysteme nicht für die getrennte Analyse der beiden Zelltypen und ihrer jeweiligen secretomes ermöglichen. Verschiedene Ansätze nutzen die direkte Co - Kultivierung von Neuronen und Glia 4-6 lang anhaltende Überleben und physiologisch relevanten neuronalen Netzwerk Entwicklung zu erreichen. Das vorliegende Protokoll erreicht die gleichen Ziele , während die beiden Zelltypen zu halten 7 physikalisch getrennt. Im Vergleich zu conditioned Medium nähert sich 8,9, unser System ermöglicht die bidirektionale Kommunikation zwischen Neuronen und Astrozyten zu studieren. Die Expression der sekretierten Signalmoleküle können überwacht werden, während die Zellen in dem gemeinsam genutzten Medium maturate. Diese Möglichkeit ist besonders relevant, da Astrozyten lösliche Faktoren freisetzen, wie beispielsweise Zytokinen, Wachstumsfaktoren und extrazelluläre Matrixmoleküle 10,11, wodurch neuronal wachstumsregulierende und Funktion 7,12. Somit wurde gezeigt, dass die Zugabe an retinalen Ganglionzellen in vitro Thrombospondin die Bildung der Synapsen 13 induziert. Jedoch sind auch andere noch unbekannte Faktoren notwendig Synapsen zu machen funktionellen 13. Darüber hinaus haben freigesetzten Moleküle von Astrozyten, um identifiziert zu werden, um die Basis von Neuron-Glia Interaktionen zu verstehen. Der Anbau von primären Neuronen und Astrozyten aus Maus und Ratte wurde zuvor 14-16 beschrieben. Hier sind wirpräsentieren ein elegantes und vielseitiges Werkzeug beide Zelltypen in einem indirekten Kokultur Ansatz zu kombinieren. Da die beiden Kulturen noch physikalisch getrennt werden, um die gleiche Medium teilen, um die Auswirkungen von Neuronen, Astrozyten und lösliche Moleküle können separat analysiert werden, wodurch ein leistungsfähiges Werkzeug für Neuron-Glia-Interaktionsstudien zu schaffen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:115px;">Reagents</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">B27</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">17504-044</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Cell culture grade water</td>
			<td style="width:152px;">MilliQ</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Cell culture grade water</td>
			<td style="width:152px;">MilliQ</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:115px;">Cytosine-&#223;-D arabinofuranoside (AraC)</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">C1768</td>
			<td style="width:191px;">CAUTION: H317, H361</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">DMEM</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)&#160;</td>
			<td style="width:151px;">41966-029</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">DNAse</td>
			<td style="width:152px;">Worthington</td>
			<td style="width:151px;">LS002007</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">G1397</td>
			<td style="width:191px;">CAUTION: H317-334</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Glucose</td>
			<td style="width:152px;">Serva</td>
			<td style="width:151px;">22700</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">HBSS</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">14170-088</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">HEPES</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">15630-056</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Horse serum</td>
			<td style="width:152px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:151px;">S9135</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">L-Cysteine</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">C-2529</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">MEM</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">31095-029</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Ovalbumin</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A7641</td>
			<td style="width:191px;">CAUTION: H334</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Papain</td>
			<td style="width:152px;">Worthington</td>
			<td style="width:151px;">3126</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">PBS</td>
			<td style="width:152px;">self-made&#160;</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P0899</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Poly-L-ornithine</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">P3655</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">S8636</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:152px;">Gibco (Life Technologies)</td>
			<td style="width:151px;">25300054</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Equipment</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">24 well plates</td>
			<td style="width:152px;">Thermoscientific/Nunc</td>
			<td style="width:151px;">142475</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">24-wells plate (for the&#160; indirect co-culture)</td>
			<td style="width:152px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353504</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Binocular</td>
			<td style="width:152px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;">MZ6</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Cell-culture inserts</td>
			<td style="width:152px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:151px;">353095</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:152px;">Heraeus</td>
			<td style="width:151px;">Multifuge 3S-R</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Counting Chamber</td>
			<td style="width:152px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:151px;">650010</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Forceps</td>
			<td style="width:152px;">FST Dumont (#5)</td>
			<td style="width:151px;">11254-20</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">glass cover slips (12 mm)</td>
			<td style="width:152px;">Carl Roth (Menzel- Gl&#228;ser)</td>
			<td style="width:151px;">P231.1</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Incubator</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">Heracell 240i</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Micro tube (2 ml)</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">72,691</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Microscope</td>
			<td style="width:152px;">Leica</td>
			<td style="width:151px;">DMIL</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Millex Syringe-driven filter unit</td>
			<td style="width:152px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">SLGV013SL</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:152px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:151px;">Innova 4000</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Parafilm</td>
			<td style="width:152px;">Bemis</td>
			<td style="width:151px;">PM-996</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Petri dishes (10 cm)</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">833,902</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">pipette (1 ml)</td>
			<td style="width:152px;">Gilson</td>
			<td style="width:151px;">Pipetman 1000</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Sterile work bench</td>
			<td style="width:152px;">The Baker Company</td>
			<td style="width:151px;">Laminar Flow SterilGARD III</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:152px;">FST Dumont</td>
			<td style="width:151px;">14094-11</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Syringe</td>
			<td style="width:152px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:151px;">9003016</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">T75 flask</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">833,911,002</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">tube (15 ml)</td>
			<td style="width:152px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:151px;">64,554,502</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Water bath</td>
			<td style="width:152px;">GFL</td>
			<td style="width:151px;">Water bath type 1004</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the indirect neuron-astrocyte coculture assay: an in vitro set-up for the detailed investigation of neuron-glia interactions

Proper neuronaler Entwicklung und Funktion ist die Voraussetzung der Entwicklungs- und adulten Gehirn. Jedoch sind die Mechanismen, die die stark kontrollierten Bildung und Aufrechterhaltung von komplexen neuronalen Netzwerken zugrunde liegenden nicht vollständig bisher verstanden. Die offenen Fragen Neuronen in Gesundheit und Krankheit betreffen , sind vielfältig und das Erreichen von Verständnis der grundlegenden Entwicklung der menschlichen Pathologien zu untersuchen, zum Beispiel Alzheimer-Krankheit und Schizophrenie. Die detaillierte Analyse der Neuronen in vitro durchgeführt werden. Allerdings Neuronen fordern Zellen und brauchen die zusätzliche Unterstützung von Astrozyten für ihre langfristige Überleben. Diese zelluläre Heterogenität in Konflikt mit dem Ziel, die Analyse von Neuronen und Astrozyten zu sezieren. Wir stellen Ihnen hier eine Zellkultur-Assay, der für die langfristige Co-Kultivierung von reinen primären Neuronen und Astrozyten, die die gleiche chemisch definierten Medium gemeinsam nutzen können, während er physisch zu seingetrennt. In diesem Aufbau überleben die Kulturen für bis zu vier Wochen, und der Test ist für eine Vielzahl von Untersuchungen über Neuron-Glia-Interaktion geeignet.

Die Analyse der neuronalen Kulturen über den indirekten Cokultur-System ist vielfältig und kann in verschiedenen Stadien der Kultur Reifung durchgeführt werden. Aufgrund der Tatsache, dass die Zellen für bis zu 4 Wochen, sind Langzeituntersuchungen der Kulturen möglich aufrechterhalten werden kann. Das Schema in der Mitte linken Seite von Abbildung 1 zeigt die Co - Kultur - Setup. Mit dem Einsatz dieses S...

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The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Dieses Protokoll beschreibt die indirekte Neuron-Astrozyten Co-Kultur für compartmentalized Analyse von Neuron-Glia Interaktionen.

Die indirekte Neuron-Astrozyten Cokultur Assay: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Für die detaillierte Untersuchung von Neuron-Glia Interaktionen Set-up

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

the-indirect-neuron-astrocyte-coculture-assay-an-vitro-set-up-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

14.6K Aufrufe.  Ruhr-University.  Dieses Protokoll beschreibt die indirekte Neuron-Astrozyten Co-Kultur für compartmentalized Analyse von Neuron-Glia Interaktionen. 

Serie: The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Brain Imaging Investigation of the Neural Correlates of Observing Virtual Social Interactions

The ability to gauge social interactions is crucial in the assessment of others&#x2019; intentions. Factors such as facial expressions and body language affect our decisions in personal and professional life alike 1. These "friend or foe" judgements are often based on first impressions, which in turn may affect our decisions to "approach or avoid". Previous studies investigating the neural correlates of social cognition tended to use static facial stimuli 2. Here, we illustrate an experimental design in which whole-body animated characters were used in conjunction with functional magnetic resonance imaging (fMRI) recordings. Fifteen participants were presented with short movie-clips of guest-host interactions in a business setting, while fMRI data were recorded; at the end of each movie, participants also provided ratings of the host behaviour. This design mimics more closely real-life situations, and hence may contribute to better understanding of the neural mechanisms of social interactions in healthy behaviour, and to gaining insight into possible causes of deficits in social behaviour in such clinical conditions as social anxiety and autism 3.

This article demonstrates an experimental design in which whole-body animated characters are used in conjunction with functional magnetic resonance imaging (fMRI) to investigate the neural correlates of observing virtual social interactions.

Brain Imaging Untersuchung der neuronalen Korrelate von Observing virtuellen sozialen Interaktionen

The ability to gauge social interactions is crucial in the assessment of others&#x2019; intentions. Factors such as facial expressions and body language ...

Forschung

Neurowissenschaften

Brain Imaging Investigation of the Memory-Enhancing Effect of Emotion

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the neural mechanisms underlying this enhancing effect of emotion on memory. A method that has proven particularly influential in the 
investigation of the memory-enhancing effect of emotion is the so-called subsequent memory paradigm (SMP). This method was originally used to investigate the 
neural correlates of non-emotional memories3, and more recently we and others also applied it successfully to studies of emotional memory (reviewed in4, 5-7). 
Here, we describe a protocol that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion using the SMP in conjunction with 
event-related functional magnetic resonance imaging (fMRI). An important feature of the SMP is that it allows separation of brain activity specifically 
associated with memory from more general activity associated with perception. Moreover, in the context of investigating the impact of emotional stimuli, 
SMP allows identification of brain regions whose activity is susceptible to emotional modulation of both general/perceptual and memory-specific processing. 
This protocol can be used in healthy subjects8-15, as well as in clinical patients where there are alterations in the neural correlates of emotion perception 
and biases in remembering emotional events, such as those suffering from depression and post-traumatic stress disorder (PTSD)16, 17.

We present a protocol that uses functional magnetic resonance imaging to investigate the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion. This protocol allows identification of brain activity specifically linked to memory-related processing, contrary to more general perceptual processing, and can be used with healthy and clinical populations.

Brain Imaging Untersuchung der Memory-Effekt der Emotion

Emotional events tend to be better remembered than non-emotional events1,2. One goal of cognitive and affective neuroscientists is 
to understand the ...

Brain Imaging Investigation of the Impairing Effect of Emotion on Cognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional distractibility) effects (reviewed in 1). Complementing our recent protocol 2 describing a method that allows investigation of the neural correlates of the memory-enhancing effect of emotion (see also 1, 3-5), here we present a protocol that allows investigation of the neural correlates of the detrimental impact of emotion on cognition. The main feature of this method is that it allows identification of reciprocal modulations between activity in a ventral neural system, involved in 'hot' emotion processing (HotEmo system), and a dorsal system, involved in higher-level 'cold' cognitive/executive processing (ColdEx system), which are linked to cognitive performance and to individual variations in behavior (reviewed in 1). Since its initial introduction 6, this design has proven particularly versatile and influential in the elucidation of various aspects concerning the neural correlates of the detrimental impact of emotional distraction on cognition, with a focus on working memory (WM), and of coping with such distraction 7,11, in both healthy 8-11 and clinical participants 12-14.

We present a protocol that allows investigation of the neural mechanisms mediating the detrimental impact of emotion on cognition, using functional magnetic resonance imaging. This protocol can be used with both healthy and clinical participants.

Brain Imaging Untersuchung der beeinträchtigende Wirkung von Emotion auf Kognition

Emotions can impact cognition by exerting both enhancing (e.g., better memory for emotional events) and impairing (e.g., increased emotional ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form during the earliest stages of brain development and are maintained throughout the animal's life. The brain ventricular system is found in vertebrates, and the ventricles develop after neural tube formation, when the central lumen fills with cerebrospinal fluid (CSF) 1,2. CSF is a protein rich fluid that is essential for normal brain development and function3-6.
In zebrafish, brain ventricle inflation begins at approximately 18 hr post fertilization (hpf), after the neural tube is closed. Multiple processes are associated with brain ventricle formation, including formation of a neuroepithelium, tight junction formation that regulates permeability and CSF production. We showed that the Na,K-ATPase is required for brain ventricle inflation, impacting all these processes 7,8, while claudin 5a is necessary for tight junction formation 9. Additionally, we showed that "relaxation" of the embryonic neuroepithelium, via inhibition of myosin, is associated with brain ventricle inflation.
To investigate the regulation of permeability during zebrafish brain ventricle inflation, we developed a ventricular dye retention assay. This method uses brain ventricle injection in a living zebrafish embryo, a technique previously developed in our lab10, to fluorescently label the cerebrospinal fluid. Embryos are then imaged over time as the fluorescent dye moves through the brain ventricles and neuroepithelium. The distance the dye front moves away from the basal (non-luminal) side of the neuroepithelium over time is quantified and is a measure of neuroepithelial permeability (Figure 1). We observe that dyes 70 kDa and smaller will move through the neuroepithelium and can be detected outside the embryonic zebrafish brain at 24 hpf (Figure 2).
This dye retention assay can be used to analyze neuroepithelial permeability in a variety of different genetic backgrounds, at different times during development, and after environmental perturbations. It may also be useful in examining pathological accumulation of CSF. Overall, this technique allows investigators to analyze the role and regulation of permeability during development and disease.

We describe a live whole animal quantitative measurement for permeability of the embryonic zebrafish brain. The technique analyzes the ability to retain cerebrospinal fluid and molecules of different molecular weights within the neural tube lumen and quantifies their movement out of the ventricles. This method is useful for determining differences in epithelial permeability and maturation during development and disease.

Ein Assay zur Durchlässigkeit des Zebrafisch-Embryos Neuroepithel

The brain ventricular system is conserved among vertebrates and is composed of a series of interconnected cavities called brain ventricles, which form ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell für die Untersuchung der zellulären Pathophysiologie in Globoidzell- Leukodystrophie

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In - vitro - Modellierung von Cancerous Neural Invasion: The Dorsalwurzelganglion Modell

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other proteins associated with neurodegenerative diseases, the reported in vitro aggregation kinetics for tau protein are less consistent presenting a relatively high variability. Here we describe the development of an in vitro aggregation assay that mimics the expected steps associated with tau misfolding and aggregation in vivo. The assay uses the longest tau isoform (huTau441) which contains both N-terminal acidic inserts as well as four microtubule binding domains (MBD). The in vitro aggregation is triggered by addition of heparin and followed continuously by thioflavin T fluorescence in a 96 well microplate format. The tau aggregation assay is highly reproducible between different wells, experimental runs and batches of the protein. The aggregation leads to tau PHF-like morphology which is very efficient in seeding the formation of de novo fibrillar structures. In addition to its application in studying the mechanism of tau misfolding and aggregation, the current assay is a robust tool for screening drugs that could interfere with the pathogenesis of tau.

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

The tau aggregation assay described in this manuscript mimics the anticipated features of in vivo tau misfolding and aggregation.

In-vitro- Test zur Untersuchung der Aggregation von Tau-Protein und Drogen-Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...