Primäre neuronale Zellkultur ist ein ideales Modellsystem, um dissoziierte Neuronen in vitro Kultur zu studieren. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, die zellulären Merkmale dissoziierter Zellen, wie Mechanismen, Funktionen und Morphologie in vitro Bedingungen, für einige Wochen so nahe wie möglich an in vivo-Bedingungen zu halten. Legen Sie die runden Abdeckungsscheine in eine 24-Well-Platte unter dem Biosicherheitsschrank.
Fügen Sie 90 Mikroliter Poly-L-Ornithin auf jeden Deckelschlupf. Schließen Sie die Kappe und legen Sie die Platte vorsichtig für zwei Tage in den 37-Grad-Inkubator. Bereiten Sie das Kulturmedium und das Saatmedium vor und halten Sie sie bei vier Grad Celsius.
Bereiten Sie die funktionierende Trypsin-Lösung in DMEM/F12 vor und halten Sie sie bei vier Grad. Legen Sie das Kulturmedium und das Saatmedium bei 37 Grad in den Inkubator. Nehmen Sie die 24-Well-Platte aus dem Inkubator.
Waschen Sie die Deckelrutschen dreimal mit doppelt destilliertem Wasser. Lassen Sie die Deckelscheine mindestens zwei Stunden lang vollständig trocknen. Bereiten Sie drei Petri-Gerichte mit kalten PBS gefüllt, drei Petri-Gerichte mit kalten HBSS gefüllt, und fünf Petri-Gerichte mit kalten Seziermedium auf Eis gefüllt.
Die Uterushörner verbrauchen und dreimal auf Eis in kaltem PBS waschen. Von hier aus sollten alle Schritte auf Eis durchgeführt werden, um Gewebeschäden zu minimieren. Nach dem letzten Waschschritt die Welpen in HBSS von der Gebärmutter trennen und in das kalte Seziermedium übertragen.
Enthaupten Sie die Welpen im Sektionsmedium mit einer Schere. Öffnen Sie das Calvarium vom Foramen magnum bis zum unteren Rand der Orbitalhöhle. Entfernen Sie mit einem Paar feiner Zangen die Schädelbasis und schälen Sie den Schädel vom Gehirn weg.
Entfernen Sie vorsichtig die Meningen des Kleinhirns, beginnend von der seitlichen Oberfläche des mittleren Kleinhirn-Pedonkels und Pons. Schneiden Sie beide Kleinhirn-Pedunkels und trennen Sie das Kleinhirn vom Rest des Gehirns. Die gesammelte Kleinhirn sofort in ein steriles 15-ml-Konusrohr mit DMEM/F12 gefüllt auf Eis legen.
Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1.000 g bei vier Grad für eine Minute in DMEM/F12. Wiederholen Sie dies dreimal, indem Sie jedes Mal den Überstand mit einer Pipette vorsichtig entfernen und das Pellet in frischem DMEM/F12 wieder aufhängen. Fügen Sie zwei Milliliter vorgewärmtes Trypsin und sanft Pipette, um sie zusammen zu mischen.
Legen Sie das Rohr für 12 Minuten in ein 37-Grad-Wasserbad. Nach der Inkubation das Rohr in den Sicherheitsschrank bringen und 10 mLs DMEM/F12 hinzufügen, um das Trypsin zu inaktivieren. Zentrifugieren Sie die Mischung bei 1, 200 g für fünf Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie ihn in frischem Medium wieder auf, gefolgt von der Zentrifugation dreimal. Vorbefeuchten einer sterilen Kunststoffpipette mit DMEM/F2. Fügen Sie 3,5 Milliliter DNAse-Arbeitslösung in das gleiche Rohr.
Trituieren Sie das Gewebe mehrmals mit einer Pipette, bis die Flüssigkeit eine homogene milchige Farbe erreicht. 10 ml kaltes DMEM/F12 in das Gemisch geben und zur Zentrifuge übergehen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1, 200 g bei vier Grad für fünf Minuten.
Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören. Entfernen Sie das Saatmedium aus dem Inkubator. 500 Mikroliter vorgewärmtes Saatmedium hinzufügen und mit der Pipette gut mischen.
Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Verdünnen Sie die Zellsuspension mit Saatmedium auf eine Dichte von 500.000 Zellen pro Milliliter. Fügen Sie 90 Mikroliter der Mischung zu jedem Brunnen in der Mitte des Deckels.
Legen Sie die Platte drei bis vier Stunden bei 37 Grad in den Inkubator. Nach der Inkubation 500 Mikroliter vorgewärmtes Kulturmedium in jeden Brunnen geben. Ersetzen Sie die Platte bei 37 Grad in den Inkubator.
Ersetzen Sie nach sieben Tagen das alte Medium durch das frische Kulturmedium II. Bereiten Sie eine separate 24-Well-Platte mit entsprechender numerischer Organisation vor und fügen Sie 100 Mikroliter PFA 4% zu jedem Brunnen hinzu. Nach den gewünschten Tagen in der Kultur die Deckelschlüpfer vorsichtig aus den Brunnen der originalen Kulturplatte entfernen und in die entsprechenden Brunnen der pfA-Platte legen, die im vorherigen Schritt beschrieben wurden. Fügen Sie PFA zu den Brunnen hinzu, um die Deckschlips vollständig einzutauchen.
Halten Sie die PFA-Platte 30 bis 120 Minuten bei vier Grad. Stellen Sie die Platte nach der Inkubation auf Raumtemperatur wieder her. Waschen Sie die Abdeckung rutscht vorsichtig mit PBS für fünf Minuten dreimal.
Abbildung 2 im Text zeigt die Kleinhirnzellenkultur ab E18. Die Immunfluoreszenz für Calbindin zeigt Purkinje-Neuronen mit axonalen Extensions um drei Tage in vitro. Um sieben bis zehn Tage in vitro sind dendritische Prozesse offensichtlich.
Nach 21 Tagen sind komplexe dendritische Zweige vorhanden. Abbildung drei im Text zeigt Kleinhirnzellkulturen, die an verschiedenen embryonalen Tagen beginnen. Der Immunfluoreszenznachweis von Calbindin zeigt Purkinje-Neuronen mit frühen Axonen erst nach 18 Tagen in vitro.
Purkinje NeuronKulturen begann bei E14 und E15 entwickeln Dendriten, aber nie so komplex wie diejenigen, die entwickeln, wenn E18 der Ausgangspunkt ist. Abbildung 4 im Text zeigt, dass sich verschiedene Zelltypen aus E18-Kulturen nach 21 Tagen in vitro entwickeln. Calbindin grüne Immunfluoreszenz zeigt Purkinje Neuronen.
Rote Immunfluoreszenz für Parvalbumin in B und C zeigen hemmende Interneuronen. Rote Immunfluoreszenz für Natriumspannungs-Gated-Kanal in E und F zeigt Granulat-Neuronen. Das vorliegende Protokoll ist kostengünstig und einfach durchzuführen.
Am Ende dieses Videos werden Sie in der Lage sein, Kleinhirnneuronen zu sammeln und zu kultiieren und sie an gewünschten DIVs zu fixieren.
