Diese Arbeit wird durch NSERC Zuschüsse an BK und RG finanziert. Die Autoren möchten auch Kehe Xie und Russell Hosain für ihre Golgi-Cox-Färbung Expertise danken.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der kanadischen Rat der Tierpflege durchgeführt und von der University of Lethbridge, Animal Care Committee genehmigt. 1. Zucht und taktile Stimulation <ol><li> Bestellen trächtigen Ratten von gemeinsamen Tier Lieferanten oder züchten Welpen im Haus mit Standard-Laborzuchtverfahren. </li><li> Haus alle Tiere in einer temperaturgeregelten Zuchtraum (21 ° C), auf einem 12:12 h Licht gehalten: Dunkel-Zyklus und den Zugang zu Nahrung und Wasser ad libitum. </li><li> Wenn Jungtiere geboren werden, Haus weiblichen Ratten einzeln mit ihrem Nachwuchs. </li><li> Um eine zusätzliche Belastung, sofort nach der Geburt bezogen Handhabung zu vermeiden, beginnen taktile Stimulation der Jungtiere bei P3. </li><li> Taktile Stimulation sollte drei Mal pro Tag (09.00, 13.00 und 16.00 Uhr) von P3-P21 durchgeführt werden sollte und Welpen von ihren Müttern entwöhnt werden bei P21. </li><li> Bei Verwendung einer Quer Wurf Design, die Hälfte der Welpen from jeder Wurf taktile Stimulation die andere Hälfte dient als Kontrolle zu unterziehen. Zufallsprinzip die gleiche Anzahl von männlichen und weiblichen Jungtiere zu jeder Gruppe. Um Welpen unterziehen taktile Stimulation und Kontrollen unterscheiden, markieren Sie eine Gruppe von Jungtieren mit einem Permanentmarker auf den Hinterbeinen und Schwanz. Markierung muss erneut angewendet jeden zweiten Tag werden. </li></ol> Taktile Stimulation <ol start="7"><li> Dämme entfernen aus ihrem Käfig und legen Sie sie in einem temporären Käfig mit Futter und Wasser. Halten Sie den Staudamm und temporäre Käfig in der Züchtung / Gehäuse Raum. </li><li> Wiegen Rattenjungen als Gruppe vor der morgendlichen Sitzung taktile Stimulation (09.00). Für jede Sitzung, Welpen Transport Ratte ihre Käfige zu einem separaten Testraum für die taktile Stimulation. Setzen Sie den Käfig auf einem Heizkissen, die auf 24 ° C eingestellt </li><li> Verwenden Sie einen steifen Bord, um den Käfig in zwei Hälften teilen. Zeigen Rattenjungen in den taktile Stimulation Gruppe eine Hälfte und Kontrolle Welpen in der anderen Hälfte.Stellen Sie einen Timer bis 15 min. </li><li> Mit einer weichen Feder-wie Staubwedel, Bürste alle Jungtiere in der Gruppe taktile Stimulation in der gleichen Zeit für 15 aufeinander folgenden min. Die jungen Rattenjungen (~ P3-P12) ususally sich zusammen und scheinen einen tiefen Schlaf-Zyklus geben, was es sehr einfach, alle Welpen auf einmal zu stimulieren. Da die Welpen Alter, werden sie aktiv, mit einigen Jungtieren zu Fuß und die Untersuchung während der Sitzung. Der Experimentator sollte kontinuierlich zu bewegen wandernde Jungtiere in der Gruppe zu gewährleisten, erhält jeder Welpe gleich Stimulation. </li><li> Sobald die 15 Minuten-Sitzung beendet ist, transportieren die Welpen zurück zum Zuchtraum und gibt die Mutter an den Käfig. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang drei Mal am Tag für die 19 Tage des taktilen Stimulation. Nach der letzten Sitzung taktile Stimulation bei P21, sollten die Jungtiere von ihren Müttern entwöhnt werden. Welpen sollten dann in Käfigen mit 5 oder 6 andere entwöhnt Tiere des gleichen Geschlechts untergebracht werden. </li><li> Wenn Ratten durchlaufen keine weiteren Tests, sollten sie un gelassen werdengestört, auf dem normalen Licht: Dunkel-Zyklus mit Zugang zu Nahrung und Wasser libitm (abgesehen von regelmäßigen Käfig Reinigung und Handhabung), bis sie etwa 100 Tage alt zu erreichen. Wenn andere experimentelle Manipulationen unterzogen, sollten die Tiere behandelt oder getestet werden in Übereinstimmung mit diesen Laborprotokolle. </li></ol> 2. Opfer und Golgi-Cox Färbung <ol><li> Bei etwa P100, eine Überdosis verabreichen Natrium-Pentobarbital über IP-Injektion, um die Ratten und perfuse intrakardial mit etwa 100 ml 0,9% Kochsalzlösung. </li><li> Extrahieren Sie die Köpfe, wenn die Durchblutung abgeschlossen ist. Entfernen Sie die Gehirn aus dem Schädel, Schneiden der Sehnerv unten mit Mühe, das Kleinhirn intakt zu halten; Forscher können die Riechkolben zu halten oder zu entfernen. Zeigen extrahiert Gehirne in einem undurchsichtigen Nalgene Flasche mit 20 ml Golgi-Cox-Lösung 14. </li><li> Halten Sie die Gehirne in Golgi-Cox-Lösung für 14 Tage. Nach 14 Tagen, ersetzen Sie den Golgi-Cox-Lösung mit einer 30% igen Saccharoselösung. Halten Sie die Köpfe der Saccharose-Lösung für 2-5 Tage vor dem Schneiden. </li></ol> Hinweis: Wenn Gehirne nicht innerhalb von 14 Tagen nach der Übertragung auf die Saccharose-Lösung geschnitten werden kann, muss der Forscher, die Saccharose mit einem neuen Bestand von 30% Saccharose ersetzen. Der Forscher kann die Saccharose alle zwei Wochen für 4 Monate ohne nachteilige Auswirkungen auf die Färbung zu ersetzen. <ol start="4"><li> Um Abschnitt das Gehirn, das Gehirn sollte trocken getupft und mit dem Schneidetisch mit cyanocacrylic Kleber fixiert werden. Um Reißen oder ungleichmäßige Schnitte zu vermeiden, müssen die Forscher vorsichtig sein und sicherstellen, dass das gesamte Gehirn ist fest an der Bühne gesichert. </li><li> Die Vibratoms Behälter muss mit 6% Saccharose-Lösung auf ein Niveau, das die Schneideklinge deckt gefüllt werden. Stellen Sie die Parameter Vibratoms zu einer Geschwindigkeit und Amplitude bis 5, (dem Mittelpunkt auf beiden Skalen). Schneiden Sie das Gehirn in 200 um Abschnitte und legen die Abschnitte auf einem 2% verkleistert MikroUmfang Rutsche. Achten Sie darauf, die Abschnitte im Laufe des Schnitt feucht zu halten. </li><li> Wenn alle Abschnitte von Interesse gesammelt wurden, drücken die Abschnitte auf die Objektträger durch Druck auf den Schieber mit angefeuchtetem Löschpapier. Bewahren Sie die Folien in einer Objektträgergestell in der Feuchtigkeitskammer, bis sie bereit sind, angefärbt werden. Sie sollten in der Feuchtigkeitskammer für zumindest 12 Stunden länger als 4 Tage bleiben, aber nicht. Die Folien müssen feucht sein und sollte nicht erlaubt werden, zu trocknen. </li><li> Bereiten Sie die Färbung Regiment vor Beginn der Färbung. Etiketten zwölf Glas Färbeschalen (10,7 x 8,5 x 6,8 cm) und Prozess in der folgenden Weise: <ol><li> Destilliertes Wasser - 1 min </li><li> Ammoniumhydroxid - 30 min (im Dunkeln) </li><li> Destilliertes Wasser - 1 min </li><li> Kodak Fix für Film - 30 min (im Dunkeln) </li><li> Destilliertes Wasser - 1 min </li><li> 50% Alkohol - 1 min </li><li> 70% Alkohol - 1 min </li><li> 95% Alkohol - 1 min </li><li> 100% Alcohol - 5 min </li><li> Alcohol 100% - 5 min </li><li> Lösung (1/3 Chloroform, 1/3 HemoDe, 1/3 von 100% Alkohol) - 15 min </li><li> HemoDe - 15 min </li></ol></li></ol> * Xylol in verwendet wird, ersetzen von HemoDe werden. Um eine einheitliche Qualität der Färbung zu gewährleisten, sollten neue Lösungen für jede Folie verarbeitet Rack verwendet werden. <ol start="8"><li> Nach der letzten 15 Minuten Auftauchen in HemoDe, Deckglas die Folien mit Permount. </li><li> Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen, bevor die Prüfung mit einem Mikroskop. </li></ol>

<ol>
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E., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+associated+with+exposure+to+drugs+of+abuse.">Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse.</a> Neuropharmacology. 47, 33-46 (2004).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass wir keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Aufgrund der offenen Plastizität des sich entwickelnden Gehirns, ist es wichtig, dass die experimentellen Verfahren, die früheren Erfahrungen werden sorgfältig überprüft und wird versucht, für alle dazwischenliegenden Variablen zu steuern. Aus diesem Grund wird ein Quer Wurf-Design während der taktile Stimulation Verfahren eingesetzt, um sicherzustellen, dass Welpen erhalten ähnliche Erfahrungen in allen anderen Bereichen der Entwicklung. Darüber hinaus ist es auch wichtig, dass mehrere Jungtiere aus mehreren Würfen sind für die Analyse ausgewählt, um die Möglichkeit, dass Effekte resultieren aus einer Vorspannung in einem einzigen Wurf Welpen oder zu vermeiden. Taktile Stimulation wird angenommen, dass die natürlich vorkommende mütterliche Verhalten nachahmen, Lecken und Putzen, die vermutlich von Vorteil für Nachkommen Entwicklung zu sein. Obwohl frühere Forschung hat betont, die erste Woche des Lebens (P0-P7), um eine kritische Periode für Lecken und Putzen 16 sein, nach 18 Tagen der ta die schiere Größe der Veränderung identifiziertctile Stimulation kann bedeuten, dass, obwohl sensiblen Zeiten gibt, ist längere Belichtungs überlegen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Jungtiere Empfangen taktile Stimulation in diesem experimentellen Paradigma erleben auch lecken und Pflege von ihren Müttern, damit die taktile Stimulation ist zusätzlich zu den normalen Stimulation durch die Mutter verabreicht. Schließlich muss man sich auch bewusst Region abhängige Änderungen. Obwohl taktile Stimulation während der Entwicklung erhöht dendritischen Komplexität im präfrontalen Kortex, bedeutet dies nicht garantieren, dass strukturelle Veränderungen dieser Art wird sich in allen Hirnregionen sein. Es ist möglich, dass neuronale Morphologie in anderen Hirnregionen wie dem parietalen Kortex, würde in einem auffallend andere Art und Weise auf die gleiche Erfahrung zu reagieren. , Weil die taktile Stimulation Verfahren ist leicht verwaltet und stellt keine Gefahr für den Nachwuchs oder Absetzbecken, die das Potenzial, als ein wertvolles Werkzeug für viele Forschungsstudien zur Verbesserung der Entwicklung zum Ziel zu dienen hat jedochal Ziele. Bezüglich Golgi-Cox-Färbung von Hirngewebe sind die entscheidenden Schritte zur erfolgreichen Visualisierung von neuronalen Zellen, wie folgt: 1) Es muss eine ausreichende Durchblutung des Gehirns mit Kochsalzlösung sein. Falsche oder unzureichende Perfusion der Hirngewebe führt zu Blutgefäß-Artefakte, die es schwierig, tatsächlich neuronale Zellen sichtbar durch das Labyrinth der Blutgefäße, aber auch kompliziert die Fähigkeit, Neuronen zu fotografieren Malerei zu machen. 2) perfundierten Gehirn sollte in Golgi-Cox-Lösung und Saccharose-Lösung im Dunkeln gelagert werden. Speichern des Hirngewebe im Dunkeln reduziert die Hintergrundfärbung des Gewebes, was wiederum die Wahrscheinlichkeit des erfolgreichen Visualisierung Qualität neuronalen Zellen. 3) Das Hirngewebe ist in Saccharose-Lösung nach der 14 Tage Lagerung im Golgi-Cox-Lösung gespeichert. Wenn das Gewebe in 30% Saccharose-Lösung für 2-5 Tage eingetaucht, sind die Köpfe biegsamer bewegend und Reißen der Abschnitte verhindert, wennSchneiden. Es ist wichtig, Hirngewebe von der Saccharose-Lösung für eine erhöhte Zeitperioden verbleibenden verhindern (es sei denn, die Saccharoselösung kontinuierlich durch frische Lösung ersetzt), weil längerer Lagerung in Saccharose verringert die Qualität der Färbung. 4) Schließlich, sobald Folien wurden gebeizt und Abdeckung gerutscht, sollten sie genügend Zeit, um vor der Anzeige mit einem Mikroskop trocknen gegeben werden. Wenn Folien dürfen nicht ausreichend trockene Luft, kann das Gewebe zu verdunkeln, wodurch erfolgreiche Visualisierung von kortikalen Neuronen. Stabile Änderungen in psychologische Funktion und Verhaltens-Reaktionen, die in Reaktion auf Erfahrungen auftreten, werden vermutlich durch Reorganisation neuronaler Morphologie und synaptischer Verbindungen 17 erleichtert werden. Da diese Strukturänderungen eine messbare Ressource für erfahrungsabhängige Plastizität, ist die Verwendung eines zuverlässigen Färbeverfahren wichtig. Diese Vibratoms basierend Golgi-Cox Färbeverfahren bietet zuverlässige Fleckening von feinen Ästen und dendritischen Dornen, die nicht offensichtlich sein, kann mit anderen Protokollen wie Celloidin-Einbettung. Die Besonderheit des Golgi-Cox-Verfahren beruht auf seiner Fähigkeit, nur einen kleinen Teil der neuronalen Elemente (1-10%), die Rückverfolgung einzelner Neuronen für große Entfernungen ermöglicht färben. Trotz der Tatsache, dass nur ein kleiner Bruchteil der Neuronen mit dem Farbstoff imprägniert, Zellen, sichtbar gemacht werden, halten alle Funktionen, einschließlich Zellkörper, Dendriten, Axonen und Dendriten. Wenn darüber hinaus das Färbungsverfahren korrekt durchgeführt wird, werden die gefärbten Zellen zeichnen sich klar und deutlich gegen einen transparenten Hintergrund, weil andere kortikalen Strukturen bleiben ungefärbt und transparent. Aufgrund der Erkenntnis, dass die anhaltende Veränderungen in der äußeren Funktionieren muß die Plastizität des Nervensystems, dh die Fähigkeit von Neuronen, ihre Struktur und Konnektivität zu ändern, stellt die Golgi-Cox Färbeverfahren Forscher mitzuverlässige Technik zu visualisieren und quantifizieren diese Plastizität.

Obwohl es viele gemeldet und genutzt Techniken für die Prüfung der negativen frühen Erfahrungen auf die Hirnreifung, wie perinatalen Stress 1,2, sensorische Deprivation 3 und Medikamententoxizität 4, gibt es eingesetzt, um die Auswirkungen der positiven Erfahrungen nur sehr wenige Methoden untersuchen diese Zeit. Abgesehen von ökologischen Bereicherung ist taktile Stimulation einer der wenigen Gehirn Verbesserung Behandlungen mit nachgewiesener Wirkung 5. Taktile Stimulation ist eine Methode der sensorischen Stimulation der Haut, die das mütterliche Verhalten nachahmt, Ratte, Lecken und Putzen. Die allgemeine Akzeptanz als eine positive Manipulation ergibt sich aus Studien, dass taktile Stimulation verbessert die Reifung von Früh-und Neugeborenen-Ratten 6. Darüber hinaus Forschung im Labor Meaney 7 hat gezeigt, dass höhere Mütter lecken und Pflege sind, um positive Ergebnisse bei den Nachkommen verbunden. Aufgrund tiese positive Einflüsse, taktile Stimulation rasch entwickelte sich zu einem Sanierungsstrategie zur Minderung der Angst 8, die Verbesserung der Ergebnisse mit Hirnverletzung 9-11 zugeordnet und Dämpfen Drogen Sensibilisierung 12 ausgerichtet. Als solches ist taktile Stimulation eine wertvolle Technik für die Förderung der positiven ersten Erfahrungen, mit einem bewährten Fähigkeit, dramatisch neu zu organisieren neuronale Morphologie und synaptische Konnektivität des sich entwickelnden Gehirns. Um zu untersuchen und zu quantifizieren, Veränderungen in der neuronalen Morphologie, ist es notwendig, intakten Neuronen zu visualisieren. Der Golgi-Cox-Färbung Verfahren ist eine Modifikation von Camillo Golgi der Technik, die in den späten 1800er Jahren, die diskrete Färbung von einer kleinen Anzahl von Neuronen komplette 13 liefert. Obwohl das Verfahren scheint Neuronen zufällig und Reproduzierbarkeit wird allgemein als Hauptfehler, den kleinen Imprägnierungsrate ermöglicht die Visualisierung der gesamten neuronalen Elements, einschließlich ce genannten Fleckll Körper, Dendriten dendritischen Dornen, und Axone. Ebenso hat die erforderliche Zeit, um eine vorgegebene Gehirn mit Golgi-Lösung zu imprägnieren auch als Gang zitiert. Da jedoch einmal Färbung abgeschlossen Gewebe kann unbegrenzt aufbewahrt werden, und die Zeit zwischen der Durchblutung des Gehirns und Visualisierung von Neuronen mit einem Mikroskop kann in weniger als 21 Tagen durchgeführt werden, ist die Zeit nicht unvernünftig. Zusätzlich mit kleinen Änderungen zum Protokoll, Golgi-Cox-Färbung kann effektiv genutzt werden, um Gehirn von Nagetieren aus allen Altersgruppen zu imprägnieren. Da die Veränderungen auf der strukturellen Ebene haben, anhaltende Änderungen an Verhaltens-und psychologische Funktionieren gebracht worden, stellt der Golgi-Cox-Färbetechnik Forschern ein wertvolles Werkzeug, um Neuroplastizität messen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dichromate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P188</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mercuric Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M1561</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chromate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P220</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A669-500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kodak Rapid Fix</td>
			<td>Vistek</td>
			<td>Kodak 146 4016</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH-95 &amp; Anhydrous</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>No Cat Numbers</td>
			<td>All other Et-OH are dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiffers- Soft Feather-Like dusters</td>
			<td>Safeway</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Can be found at most grocery stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-9378</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HemoDe</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>23410</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Sp15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>160004-365</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>062011-9</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the effects of a positive early experience, tactile stimulation, on dendritic morphology and synaptic connectivity with golgi-cox staining

Um längerfristige Verhaltensänderungen zu erzeugen, muss Erfahrungen produzieren stabile neuronale Morphologie und synaptische Verbindungen. Taktile Stimulation ist eine positive Erfahrung, die frühen ahmt Müttern lecken und Pflege bei der Ratte. Offenlegen von Rattenjungen zu dieser positiven Erfahrung kann leicht und kostengünstig durch den Einsatz hoch zugänglichen Materialien, wie ein Hausstaubtuch abgeschlossen sein. Mit einem Kreuz-Wurf-Design, sind Jungtiere entweder strich oder ungestört, für 15 min, drei Mal pro Tag während der perinatalen Periode. Um die neuroplastische Veränderungen zu dieser positiven ersten Erfahrungen im Zusammenhang zu messen, wird Golgi-Cox-Färbung von Hirngewebe eingesetzt. Aufgrund der Tatsache, dass Golgi-Cox Imprägnieren färbt eine diskrete Anzahl von Neuronen und nicht alle der Zellen, Färbung von Nagetiergehirn mit Golgi-Cox-Lösung ermöglicht die Visualisierung der gesamten neuronalen Elemente, einschließlich der Zellkörper, Dendriten, Axonen, und dendritischen Dornen. Das Färbeverfahren is durchgeführt über mehrere Tage und erfordert, dass der Forscher achten auf Details. Sobald jedoch Färbung abgeschlossen ist, das gesamte Gehirn wurde imprägniert und kann unbegrenzt fortlaufenden Analyse konserviert werden. Daher ist Golgi-Cox-Färbung eine wertvolle Ressource für das Studium erfahrungsabhängige Plastizität.

Wenn diese Färbungsverfahren wurde entsprechend folgt, wird konsistente und einheitliche Färbung von Dendriten und Dornen erzeugt. Siehe Abbildung 1 für eine Darstellung der Golgi-Cox neuronale Färbung. Dieses Verfahren erzeugt Färbung, die vergleichbar mit der neu in-vitro-Methoden entwickelt und kann gestatten Visualisierung von dendritischen Felder, die unterbrechungsfreie folgende Gewebeeinbettung sind, ist. Das Vibratom basierende Technik für Golgi-Cox-Färbung wurde festgestellt, weiter verbreitet Färbung der endständigen Zweige und pyramidalen Neuronen zu erzeugen, als die Färbung mit entweder Celloidin eingebettet und Kryostat-geschnittenen Gewebes 15. Da außerdem dieses Verfahren der Färbung imprägniert das gesamte Gehirn, alle Abschnitte können entweder sofort oder in der Zukunft zu analysieren. Da die Lage der morphologischen Veränderung ist es nicht immer offensichtlich, wenn Erzeugen eines ursprünglichen Hypothese, ermöglicht dieses Verfahren für die Erforschung weiterer Hirnregionen eind verhindert Entsorgung von Gewebe, das in der Zukunft nützlich sein können. Diese Färbung Methode für zuverlässige Anfärbung von allen Alters Rattenhirnen (P0-Alter) verwendet werden. Wenn jedoch Färbung junge Gehirne (&lt;1 g), das Gehirn nur in der Golgi-Cox Lösung bleiben 6 Tage, anstatt der 14 Tage erwachsenen Gehirn empfohlen, alle anderen Verfahren konstant gehalten werden. Die Hauptschwierigkeit, die während dieser Golgi-Cox Färbung auftreten können, ist die Unfähigkeit, hochwertige Färbung der zentralen Hirnregionen, einschließlich des Thalamus zu produzieren. Das gesamte Gehirn gleichzeitig imprägniert, kann zentralen Regionen empfangen ideale Konzentrationen von Flecken. Trotz dieser Erkenntnis, die Golgi-Cox-Technik produziert außergewöhnliche Färbung der subkortikalen Regionen wie dem Hippocampus und Striatum. Eine letzte Einschränkung des Verfahrens ergibt sich aus einer unvollständigen Entfernung von Blut aus dem Gehirn während der Perfusion Prozess. Blut kann zu Artefakten in dem Hirngewebe zu erzeugendas macht es schwierig zu fotografieren und verfolgen die Neuronen. Golgi-Cox Färbetechniken eine zuverlässige Messung der dendritischen Morphologie und Neuroanatomie, die nützlich für eine umfangreiche Reihe von Studien entwickelt, um Veränderungen auf neuronaler Ebene zu untersuchen ist. Bei der Untersuchung der neuronalen Struktur im präfrontalen Kortex folgenden taktile Stimulation in der frühen postnatalen Phase zeigte Golgi-Cox-Färbung dramatischen Anstieg der dendritischen Komplexität. Anatomischen Veränderungen frühzeitig taktile Stimulation Zusammenhang kann visuell durch Vergleich Wirbelsäule Dichte von pyramidalen Neuronen aus einer Kontrollratte, Neuronen von einer Ratte, die taktile Stimulation unterpyramiden (siehe Fig. 1) nachgewiesen werden. Außerdem können Parameter wie dendritische Verzweigung, dendritische Länge und Wirbelsäule Dichte berechnet und statistisch analysiert, um kontinuierliche Daten über Tiere verglichen werden können erzeugen. Um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen, sollte auf Analyse Uhr durchgeführt werdenINDESTLISTE von drei Tieren pro Behandlungsgruppe und etwa fünf Neuronen pro Hemisphäre sollte zufällig für jede Gehirnregion unter Analyse ausgewählt werden. den dendritischen Komplexität (Stacheln / um x um von Dendriten) von Tieren, die taktile Stimulation und Tiere, die nicht taten empfangen Abbildung 2 zeigt . In den beiden apikalen und basilar Felder der Neuronen aus dem mPFC (Cg3) analysiert, führte taktile Stimulation der Proliferation von neuronalen Parameter. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. A. Repräsentative Foto eines Golgi-Cox gefärbten Pyramidenzelle aus der Schicht III der Bereich Cg3 in einer Ratte, die taktile Stimulation während der Entwicklung eingegangen. B. Repräsentative vergrößert (1.000 X) Foto von dendritischen Dornen auf den Terminal-Dendriten in der basilaris Bereich der Cg3 , das hellere Bild links ist für eine Ratte in der Kontrollgruppe und den dunkleren Bild auf der right ist von einer Ratte, die taktile Stimulation erhalten. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50694/50694fig2.jpg" /> 2. Illustrative Darstellung der durchschnittlichen apikalen dendritischen basilaris und Komplexität (Stacheln / &amp;mgr; m × &amp;mgr; m) für die Neuronen in der Cg3 Bereich von erwachsenen Ratten, die entweder empfangen taktile Stimulation während der Entwicklung oder nicht (* p &lt;0,01).

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Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

Dieser Beitrag beschreibt die Verfahren für die taktile Stimulation von Rattenjungen und anschließende Golgi-Cox-Färbung der neuronalen Morphologie. Taktile Stimulation ist eine positive Erfahrung, die in der Perinatalperiode durch Streicheln Welpen mit einem Haushalts duster verwaltet wird. Golgi-Färbung cox ist ein zuverlässiges Verfahren ermöglicht die Visualisierung der gesamten Neuronen.

Visualisierung der Auswirkungen einer Früh Positive Erfahrung, taktile Stimulation, auf dendritischen Morphologie und synaptische Verbindungen mit Golgi-Cox Färbung

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.9K Aufrufe.  University of Lethbridge.  Dieser Beitrag beschreibt die Verfahren für die taktile Stimulation von Rattenjungen und anschließende Golgi-Cox-Färbung der neuronalen Morphologie. Taktile Stimulation ist eine positive Erfahrung, die in der Perinatalperiode durch Streicheln Welpen mit einem Haushalts duster verwaltet wird. Golgi-Färbung cox ist ein zuverlässiges Verfahren ermöglicht die Visualisierung der gesamten Neuronen. 

Serie: Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

State-Dependency Auswirkungen auf TMS: Ein Blick auf Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Forschung

Neurowissenschaften

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Die Ableitung der zeitliche Verlauf der Glutamate Ausverkauf mit Dekonvolutionsanalyse von Astrozytäre Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within histological brain samples. While it is preferable from a practical perspective to prepare brain sections at the greatest thickness possible, in order to increase the probability of identifying stained neurons that are fully contained within single sections, this approach is limited from a technical perspective by the working distance of high-magnification microscope objectives. We report here a protocol to stain neurons using the Golgi-Cox method in mouse brain sections that are cut at 500 &#956;m thickness, and to visualize neurons throughout the depth of these sections using an upright microscope fitted with a high-resolution 30X 1.05 N.A. silicone oil-immersion objective that has an 800 &#956;m working distance. We also report two useful variants of this protocol that may be employed to counterstain the surface of mounted brain sections with the cresyl violet Nissl stain, or to freeze whole brains for long-term storage prior to sectioning and final processing. The main protocol and its two variants produce stained thick brain sections, throughout which full neuron dendritic&#160;trees and dendrite spines may be reliably visualized and quantified.

We present a protocol for using the Golgi-Cox staining method in thick brain sections, in order to visualize neurons with long dendritic&#160;trees contained within single tissue samples. Two variants of this protocol are also presented that involve cresyl violet counterstaining, and the freezing of unprocessed brains for long-term storage.

Imaging Neurone innerhalb Dickhirnschnitten Mit der Golgi-Cox-Methode

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

Analyse dendritischer Morphologie in Spalten und Schichten

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific frequency and in turn modulate ongoing cortical oscillatory activity. This neurotool allows the establishment of a causal link between endogenous oscillatory activity and behavior. Most of the tACS studies have shown online effects of tACS. However, little is known about the underlying action mechanisms of this technique because of the AC-induced artifacts on Electroencephalography (EEG) signals. Here we show a unique approach to investigate online physiological frequency-specific effects of tACS of the primary motor cortex (M1) by using single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) to probe cortical excitability changes. In our setup, the TMS coil is placed over the tACS electrode while Motor Evoked Potentials (MEPs) are collected to test the effects of the ongoing M1-tACS. So far, this approach has mainly been used to study the visual and motor systems. However, the current tACS-TMS setup can pave the way for future investigations of cognitive functions. Therefore, we provide a step-by-step manual and video guidelines for the procedure.

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) allows the modulation of cortical excitability in a frequency-specific fashion. Here we show a unique approach which combines online tACS with single pulse Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) in order to "probe" cortical excitability by means of Motor Evoked Potentials.

Effekte der transkraniellen Wechselstrom Stimulation auf Primärbewegungsrinde durch Online-kombinierter Ansatz mit Transcranial magnetische Anregung

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Kombination von Optogenetik mit künstlichen Mikro-RNAs, die Effekte gen Knockdown präsynaptischen Funktion innerhalb intakte neuronale Schaltkreise zu charakterisieren

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the brains of AD patients, these do not improve memory functions. Since A&#946; aggregates in the brain before the appearance of memory impairments, targeting A&#946; may be inefficient for treating AD patients who already exhibit memory deficits. Therefore, downstream signaling due to A&#946; deposition should be blocked before AD development. A&#946; induces axonal degeneration, leading to the disruption of neuronal networks and memory impairments. Although there are many studies on the mechanisms of A&#946; toxicity, the source of A&#946; toxicity remains unknown. To help identify the source, we propose a novel protocol that uses microscopy, gene transfection, and live cell imaging to investigate early changes caused by A&#946; in axonal growth cones of cultured neurons. This protocol revealed that A&#946; induced clathrin-mediated endocytosis in axonal growth cones followed by growth cone collapse, demonstrating that inhibition of endocytosis prevents A&#946; toxicity. This protocol will be useful in studying the early effects of A&#946; and may lead to more efficient and preventative AD treatment.

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &amp;#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Here a protocol to investigate the early effects of amyloid-&#946; (A&#946;) in the brain is presented. This shows that A&#946; induces clathrin-mediated endocytosis and collapse of axonal growth cones. The protocol is useful in studying early effects of A&#946; on axonal growth cones and may facilitate prevention of Alzheimer's disease.

Visualisierung von axonale Wachstum Kegel Zusammenbruch und frühe Amyloid β-Effekte in kultivierten Maus Neuronen

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...