Diese Arbeit wurde von einem Discovery-Grant CDCB aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada (NSERC) unterstützt, ein John R. Evans Leaders Fund Forschungsinfrastruktur Zuschuss CDCB aus Kanada Foundation for Innovation (CFI Projektnummer 30381) und durch eine Entdeckung Grant NJM von NSERC. ELL wurde von einem Ontario Graduate Scholarship und von einem OVC Stipendium des Ontario Veterinary College an der University of Guelph unterstützt. CDS wurde durch einen Bachelor-Student Aspirantur von NSERC unterstützt. ALM wurde von einem Alexander Graham Bell Stipendium NSERC und von einem OVC Stipendium des Ontario Veterinary College an der University of Guelph unterstützt.

Erwachsene weibliche CD1-Stamm-Mäuse wurden in dieser Studie verwendet. Ähnliche Färbung kann unter Verwendung beider Geschlechter in verschiedenen Altersstufen durchgeführt werden. Versuchstiere wurden nach den Grundsätzen und Richtlinien des Canadian Council on Animal Care betreut, und das experimentelle Protokoll wurde von der University of Guelph Animal Care Committee genehmigt. 1. Golgi-Cox Staining <ol><li> Golgi-Cox Imprägnierung von Brains <ol><li> Macht die Golgi-Cox Lösung von 1% (w / v) Kaliumdichromat, 0,8% (w / v) Kaliumchromat und 1% (w / v) Quecksilberchlorid durch das Kaliumdichromat Auflösen und Kaliumchromat in hochwertiges Wasser separat . Mischen Sie die Lösungen, fügen Sie das Quecksilberchlorid und filtern die endgültige Lösung unter Verwendung von Grad 1 Filterpapier. Bewahren Sie die Lösung im Dunkeln für bis zu einem Monat. </li><li> Betäuben die Maus mit 5% Isofluran. </li><li> Euthanize die Maus durch Enthauptung und schnell das Gehirn entfernen. </li><li> Legen Sie das Gehirn in ein 20 ml Glasszintillationsröhrchen mit 17 ml Golgi-Cox-Lösung und Inkubieren im Dunkeln bei RT 25 d. </li><li> Cryoprotect das Gehirn, indem es in ein konisches 50 ml-Röhrchen mit 40 ml Saccharose Kryoprotektivum (30% (w / v) Sucrose in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4) im Dunkeln bei 4 ° C für 24 h platziert. HINWEIS: Die folgenden optionalen drei Schritte als Alternative zum Hauptprotokoll verwendet werden können, um das Gehirn in dieser Phase für die langfristige Lagerung einfrieren. </li><li> Frieren Sie das ganze Gehirn, indem es in 200 ml Isopentan getaucht, das auf Trockeneis vorgekühlt wurde. </li><li> Das tiefgefrorene Gehirn in ein 50 ml konischen Röhrchen und speichert im Dunkel bei -80 ° C. </li><li> Wenn bereit zu gehen, aufzutauen, das Gehirn, indem es in ein konisches 50 ml-Röhrchen mit 40 ml Saccharose Kryoschutzmittels im Dunkeln bei 4 ° C für 24 h platziert. </li></ol></li><li> Gehirn Sectioning <ol><li> Entfernen Sie das Gehirn aus dem Saccharose und block es zum Schneiden durch das Kleinhirn mit einer Rasierklinge abgeschnitten und eine flache Kante an dem verbleibenden kaudalen Ende des Gehirns zu verlassen. </li><li> Wärme-Agar (3% (w / v) in Wasser), bis sie geschmolzen und abkühlen lassen, bis sie geringfügig über seinem Schmelzpunkt liegt. </li><li> Legen Sie das Gehirn in einem kleinen Einweg wiegt Gericht mit seinen Schwanzende bedruckten Seite nach unten und fügen Sie eine ausreichende Menge an geschmolzenem Agar, das Gehirn zu decken. </li><li> Sobald der Agar sich verfestigt hat, Überschüssiges Agar verlassen etwa 2 bis 4 mm um das Gehirn und das Gehirn auf die Bühne eines Vibratom mit seinem caudalen Ende der Vorderseite nach unten Leim eine kleine Menge von Ethylcyanoacrylat Leim. </li><li> Füllen Bühnenbereich des Vibratom mit einer ausreichenden Menge an Saccharose Gefrierschutzmitteln, das Gehirn zu bedecken, und Abschnitt des Gehirn bei einer Schichtdicke von 400 bis 500 um (je nach der Hirnregion zu untersuchenden) unter Verwendung eine Schwingungsfrequenz von 86 Hz und eine Klingenvorschubgeschwindigkeit von 0,125 mm / s. </li><li> Mit einem kleinen Pinsel, Place Hirnschnitten in eine Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatte mit im Handel erhältlichen maschenBodenEinsätze und vorgefüllt mit 10 ml 6% (w / v) Sucrose in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4 enthält. </li><li> Inkubieren Abschnitte im Dunkeln bei 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> Die Entwicklung Hirnschnitten <ol><li> Unter Verwendung der maschenBodenEinsätze, übertragen Hirnschnitten in eine neue Vertiefung mit 5 ml 2% (w / v) Paraformaldehyd (PBD) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4. Inkubieren auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 15 min bewegt. </li><li> Wasche zweimal Abschnitte von ihnen, um neue Vertiefungen mit 5 ml Wasser zu übertragen. Waschen Sie auf einer Wippe mit mäßiger Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 5 min bewegt. </li><li> Transferabschnitte in einen neuen gut, die 5 ml von 2,7% (v / v) Ammoniumhydroxid. Inkubieren auf einem Schüttler mit einer langsamen Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 15 min bewegt. </li><li> Wasche zweimal Abschnitte von ihnen, um neue Vertiefungen mit 5 ml Wasser zu übertragen. waschen Sie ona Wippe für 5 Minuten bei mäßiger Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT bewegt. </li><li> Transferabschnitte in einen neuen gut , die 5 ml Fixativ A (siehe Materialien Table) , die in Wasser 10 - fach von seiner ursprünglichen Konzentration verdünnt gekauft wurde. Inkubieren auf einer Wippe mit einer langsamen Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 25 min bewegt. </li><li> Wasche zweimal Abschnitte von ihnen, um neue Vertiefungen mit 5 ml Wasser zu übertragen. Waschen Sie auf einer Wippe mit mäßiger Geschwindigkeit im Dunkeln bei RT für 5 min bewegt. </li></ol></li><li> Montage Gehirnschnitte <ol><li> Mit einem kleinen Pinsel, montieren Schnitte auf Objektträger. Überschüssiges Wasser und Agar Pinzette und ein kleines Gewebe verwendet wird. Stellen Sie sicher, dass alle Agar, bevor mit Dehydratation entfernt wird. </li><li> Allow Abschnitte an der Luft trocknet bei RT für etwa 45 min (400 &amp; mgr; m Abschnitte) oder 90 min (500 &amp; mgr; m Abschnitte). HINWEIS: Der Zeitpunkt und die richtige Höhe der Trockenheit ist kritisch und muss möglicherweise in jedem zu bestimmendenLabor in Abhängigkeit von der Umgebungstemperatur und der Luftfeuchtigkeit. Ein zu kurzer Trocknungszeit führt zu Abschnitten aus den Folien während der anschließenden Entwässerungsschritte fallen, und ein zu lange Trocknungszeit führt zu Abschnitten Knacken. Abschnitte werden nach wie vor auf der entsprechenden Ebene der Trockenheit sein glänzend erscheinen. </li><li> Stain Schnitte mit Kresylviolett von Dias in Coplin Färbeschalen wie angezeigt setzt. HINWEIS: Dieser optionale Schritt für Abschnitte verwendet werden kann, die eingefroren nie hatte, um neuronale Kerne mit Kresylviolett zu färben. Wir haben gefunden, dass das Clearing und Rehydratisieren Abschnitte vor der Inkubation in Kresylviolett führt zu noch über Abschnitte und niedrige Hintergrundfärbung. <ol><li> Platzieren in Mittel für 5 min löschen. Wiederhole einmal. </li><li> Legen Sie in 100% Ethanol für 5 min. Wiederhole einmal. </li><li> Platzieren in 95% Ethanol in Wasser, dann 75% Ethanol in Wasser und dann 50% Ethanol in Wasser für 2 min je. </li><li> Legen Sie in Wasser für 5 min. </li><li> Platzieren in 0,5% (w / v) cresyl violet in Wasser für 7 min. </li><li> Legen Sie in Wasser für 2 min. Wiederhole einmal. </li></ol></li><li> Dehydratisieren Abschnitte durch wie angegeben Dias in Coplin Färbeschalen platzieren. <ol><li> Platzieren in 50% Ethanol in Wasser, dann 75% Ethanol in Wasser und dann 95% Ethanol in Wasser für 2 min je. </li><li> Legen Sie in 100% Ethanol für 5 min. Wiederhole einmal. </li><li> Platzieren in Mittel für 5 min löschen. Wiederhole einmal. HINWEIS: Diese Austrocknung und Clearing Zeiten sind ausreichend Gehirn der Maus zu verarbeiten, wie in diesem Manuskript beschrieben. Wir haben jedoch für andere Arten, einschließlich Ratten und cowbird beobachtet, dass der endgültige Clearing Schritt muß bis 15 min insgesamt verlängert werden. </li></ol></li><li> Coverslip Abschnitte eine wasserfreie Befestigungsmedium verwendet. </li><li> Erlauben Folien für mindestens 5 d horizontal im Dunkeln bei RT zu trocknen. </li></ol></li></ol> 2. Imaging Stained Neurone innerhalb Thick Hirnschnitten <ol><li> Erfassen von Bildstapel </strong&gt; <ol><li> Schalten Sie das Mikroskop Glühbirne, die Kamera und Objekttischsteuerung. </li><li> Öffnen Sie die Mikroskop - Software (zB Neurolucida). </li><li> Platzieren einer Folie auf dem Mikroskoptisch. </li><li> Erfassen eine 2D-Weitsichtbild des Gehirns Abschnitt eine niedrige Vergrößerung Ziel Verwendung wie 1,25X 0,4 NA PlanApo oder 4x 0,16 NA <ol><li> Fokus Bild und stellen Sie die Kameraeinstellungen einschließlich der Belichtungszeit und Weißabgleich. </li><li> Erstellen Sie einen Referenzpunkt mit der linken Maustaste irgendwo auf dem Abschnitt </li><li> Nehmen Sie das Bild von „erwerben einzelnes Bild“ im Bildaufnahmefenster auswählen. </li></ol></li><li> Erfassen Mitte Auflösung Bildstapel der Fläche enthält, die Neuronen (e) von Interesse, unter Verwendung eines 10X-0,3 NA uPlan FL N Ziels. <ol><li> das Bild konzentrieren und die Kameraeinstellungen einschließlich der Belichtung und Weißabgleich einzustellen. </li><li> Stellen Sie die obere und untere Grenze für die Bildstapel durch an der Oberseite des Abschnitts eine fokussierendend die Auswahl von „gesetzt“ neben „top of stack“ innerhalb des Bildaufnahmefensters, und dann auf den Boden des Abschnitts konzentriert und „set“ neben „bottom of stack“ innerhalb des Bildaufnahmefensters ausgewählt wird. </li><li> Stellen Sie das Schrittweite bis 5 um durch „5 &amp; mgr; m“ neben „Abstand zwischen den Bildern“ innerhalb des Bildaufnahmefensters eintritt. </li><li> Nehmen Sie das Bild Stapel von „acquire Bildstapel“ im Bildaufnahmefenster auswählen. </li><li> Wiederholen der obigen Schritte den gesamten Bereich von Interesse zu erfassen, um sicherzustellen, dass alle Bildstapel von mindestens 10% überlappen, in der X- und Y-Achsen. </li></ol></li><li> Erfassen hochauflösenden Bildstapeln der Fläche des Neurons von Interesse enthalten, unter Verwendung eines 30X 1,05 NA Silikonölimmersionsobjektiv. <ol><li> Anwenden von 3 bis 4 Tropfen Silikon Sionsöl auf den Objektträger und legt das Ziel über den Objektträger, um sicherzustellen, Kontakt herzustellen zwischen dem Objektiv und oil. </li><li> das Bild konzentrieren und die Kameraeinstellungen einschließlich der Belichtung und Weißabgleich einzustellen. </li><li> Stellen Sie die obere und untere Grenze für die Bildstapel durch an die Oberseite des Abschnitts Fokussierung und die Auswahl von „gesetzt“ neben „top of stack“ innerhalb des Bildaufnahmefensters, und dann auf den Boden des Abschnitts Fokussierung und die Auswahl von „gesetzt“ neben „bottom of stack“ innerhalb des Bildaufnahmefensters. </li><li> Stellen Sie die Schrittweite auf 1 &amp; mgr; m um „1 &amp; mgr; m“ neben „Abstand zwischen den Bildern“ innerhalb des Bildaufnahmefensters eintritt. </li><li> Nehmen Sie das Bild Stapel von „acquire Bildstapel“ im Bildaufnahmefenster auswählen. </li><li> Wiederholen der obigen Schritte den gesamten Bereich von Interesse zu erfassen, um sicherzustellen, dass alle Bildstapel von mindestens 10% überlappen, in der X- und Y-Achsen. </li></ol></li><li> Speichern Sie die Datei und speichern Sie alle Bilddateien im TIFF-Format für externe Verarbeitung. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Erstellen von Z-Projektionsbilder und Bild Montages <ol><li> Erstellen Z-Projektionsbilder in ImageJ <ol><li> Offene ImageJ-Software, die das Bio-Formate Plugin installiert hat. </li><li> Wählen Sie &quot;Plugins&quot; -&gt; &quot;Bio-Formate&quot; -&gt; &quot;Bio-Formate Importeur&quot;. </li><li> Wählen Sie die Bildstapel-Datei zu öffnen. </li><li> Sobald die Datei geöffnet wird, um das Format zu ändern, indem RGB „Bild“ wählen -&gt; „Type“ -&gt; „RGB-Farbe“. </li><li> Erstellen Sie die Z-Projektion durch Auswahl von &quot;Bild&quot; -&gt; &quot;Stacks&quot; -&gt; &quot;Z Projekt ...&quot;. </li><li> Speicher zweidimensionales Z-Projektionsbild als TIFF-Datei. </li></ol></li><li> Erstellen Sie ein zweidimensionales Bild Montage der gesamten Fläche von Interesse. <ol><li> Öffnen Sie die Software (zB Adobe Photoshop). </li><li> Wählen Sie &quot;Datei&quot; -&gt; &quot;Automatisieren&quot; -&gt; &quot;Photomerge&quot;. </li><li> Wählen Sie „Durchsuchen“ und dann alle imag hinzufügenes Dateien zusammengeführt werden. </li><li> Stellen Sie sicher, dass „Blend Images Together“ ausgewählt ist, und wählen Sie dann „OK“. </li><li> Speichern Sie die Montagebild des gesamten Bereichs von Interesse als TIFF-Datei. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Wir beschreiben hier ein Golgi-Cox Färbeprotokolls zusammen mit zwei nützliche Varianten für Neuronen im dicken Hirnschnitten sichtbar zu machen. Wie in den Repräsentative Ergebnisse gezeigt, die Verwendung eines hochauflösenden Ziel, die eine lange 800 &amp; mgr; m Arbeitsabstand hat ermöglicht die zuverlässige Visualisierung der gesamten Neuronen über die gesamte Tiefe des Gehirns bei 500 &amp; mgr; m geschnitten Abschnitte. Diese Studie von relativ dicken Hirnschnitten erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass gef...

Die Visualisierung von einzelnen Neuronen innerhalb von Gewebeproben ermöglicht die in - situ - Analyse von Neuronen morphologischer Eigenschaften, die unser Verständnis des Gehirns deutlich fortgeschritten sind und wie sie durch endogene Krankheit oder exogene Umweltfaktoren beeinflusst werden. Die Golgi-Cox-Färbeverfahren sind ein kostengünstiges, relativ einfaches Mittel eine Stichprobe von Neuronen im Gehirn Anfärben. Zuerst von Golgi 1 entwickelt und modifiziert von Cox 2 in den 1800er Jahren haben die Forscher weiter verfeinert , diese Technik im Laufe der Jahre klar, gut gefärbten Neuronen zu erzeugen , die verwendet werden können , zu visualisieren und sowohl Dendritenbaum Morphologie und Wirbelsäule Dichte 3, 4, zu quantifizieren 5, 6, 7, 8, 9. Eine wichtige technische Überlegungen für die Visualisierung von gefärbten Neuronen in Hirnschnitten ist die maximale Schichtdicke, die von der Arbeitsabstand der verfügbaren hochvergrößernde / hochauflösendes Mikroskop-Objektive begrenzt ist. Gemeinsame Öl-Tauchziele in den 60 - 100X Bereich hervorragende Auflösung bieten, sind aber durch ihre Arbeitsabstände begrenzt, die typischerweise nicht größer sind als 200 &amp; mgr; m. Hirnschnitte bei der 200 um Bereich schneiden kann ausreichend sein , bestimmte Neuron Typen sichtbar zu machen , die innerhalb dieser Schichtdicke enthalten sein können, beispielsweise pyramidalen Neuronen in flachen Schichten der Hirnrinde 10, 11, 12, pyramidalen Neuronen in der CA1 - Region des Hippocampus 13, 14 und Körnerzellen im Gyrus dentatus des Hippocampus 15. Neurone mit relativ mehrDendritenbäume wie pyramidalen Neuronen in tiefen Schichten des Hirnrinde , die für Maus kann mehr als 800 erstrecken , um von dem Zellkörper 16, eine größere Herausforderung bieten , da Gehirne in einem perfekten Winkel geschnitten werden müßten den gesamten Dendriten Baum enthalten innerhalb von 200 &amp; mgr; m-Scheiben. Dies kann auch nicht durchführbar sein, wenn ein Dendrit oder eine ihrer Verzweigungen in der rostralen oder kaudalen Richtung erstrecken. Während es möglich ist , diese Einschränkung zu adressieren , indem ein Neuron über mehrere benachbarte Hirnschnitte Tracing stellt dieser Ansatz eine erhebliche technische Herausforderung , die Abschnitte genau in Ausrichtung 17 zur Verfolgung. Ein praktischer Ansatz wäre gesamte Neuronen in Hirnschnitten enthalten ist, zu visualisieren, die mit einer größeren Dicke geschnitten werden. Wir berichten hier über eine Technik Neuronen zu färben innerhalb von 400 bis 500 &amp; mgr; m dicker Hirnschnitten von Mäusen, die die Golgi-Cox-Methode und dessen mo zu visualisierenrphology unter Verwendung eines hochauflösenden Silizium-Ölimmersionsobjektiv, das einen 800 um Arbeitsabstand aufweist. Das Golgi-Cox Imprägnierung und Verarbeitungsprotokoll , das wir beschreiben , wird aus einem der zitierten modernen Protokollen in der Literatur 6 modifiziert. Unser Ansatz mit dicken Hirnschnitten bietet den Vorteil einer Erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Identifizierung Neuronen jeglicher Art, die im Abschnitt vollständig enthalten sind. Neben dem Hauptprotokoll wir auch zeigen zwei Varianten, die einzigartige Vorteile bieten: (1) Golgi-Cox-Färbung mit Cresylviolett Gegenfärbemittel auf der Oberfläche der montierten Teile, um die Grenzen der Hirnregionen zu definieren und Schichten des identifizieren Großhirnrinde, und (2) Golgi-Cox-Färbung mit einem Zwischengefrierschritt für die lang~~POS=TRUNC von imprägniertem gesamtem Gehirn vor dem Schneiden und Endverarbeitung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="775">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">potassium dichromate</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">P188-100</td>
			<td style="width:167px;">Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">potassium chromate</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">P220-100</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mercuric chloride</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">S25423</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Whatman grade 1 filter paper</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">1001-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">isoflurane</td>
			<td style="width:147px;">Pharmaceutical Partners of Canada</td>
			<td style="width:175px;">CP0406V2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">20 mL scintillation vial</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">03-337-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">sucrose</td>
			<td style="width:147px;">Bioshop Canada</td>
			<td style="width:175px;">SUC700.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">S5011-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">S9390-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">50 mL conical tube</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">12-565-271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">isopentane</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">AC126470010</td>
			<td>also known as 2-methylbutane. Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">agar</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">A1296-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">small weigh dish</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">02-202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">vibratome</td>
			<td style="width:147px;">Leica</td>
			<td style="width:175px;">VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">6 well tissue culture plates</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">08-772-1b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mesh bottom tissue culture inserts</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">07-200-214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:288px;">paraformadelhyde, 16%</td>
			<td style="width:147px;">Electron Microscope Sciences</td>
			<td style="width:175px;">15710-S</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">ammonium hydroxide</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">A669S-500</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Kodak Fixative A</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">P7542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">superfrost plus slides</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">CitroSolv clearing agent</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">22-143-975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">anhydrous ethyl alcohol</td>
			<td style="width:147px;">Commercial Alcohols</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">cresyl violet</td>
			<td style="width:147px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:175px;">C1791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">permount</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:175px;">SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">upright microscope</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">BX53 model</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">colour camera, 12 bit</td>
			<td style="width:147px;">MBF Biosciences</td>
			<td style="width:175px;">DV-47d</td>
			<td style="width:167px;">QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:288px;">three-dimensional motorized microscope stage, controller and enoders</td>
			<td style="width:147px;">MBF Biosciences</td>
			<td style="width:175px;">N/A</td>
			<td>Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">4x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">4x 0.16 N.A. UplanSApo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">10x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">10x 0.3 N.A. UPlan FL N&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">30x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td>30x 1.05 N.A. UPlanSApo&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">60x microscope objective</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td>60x 1.42 N.A. PlanAPO N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">silicone immersion oil</td>
			<td style="width:147px;">Olympus</td>
			<td style="width:175px;">Z-81114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Neurolucida software</td>
			<td style="width:147px;">MBF Biosciences</td>
			<td style="width:175px;">Version 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:147px;">U. S. National Institutes of Health</td>
			<td style="width:175px;">Current version</td>
			<td>With the OME Bio-Formats plugin installed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Photoshop software</td>
			<td style="width:147px;">Adobe</td>
			<td style="width:175px;">version CS6</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging neurons within thick brain sections using the golgi-cox method

Der Golgi-Cox-Methode von Neuron-Färbung ist seit mehr als zweihundert Jahren beschäftigt unser Verständnis der neuronalen Morphologie innerhalb histologischen Hirnproben vorzurücken. Zwar ist es aus praktischer Sicht zu bevorzugen ist, um Hirnschnitt bei der größten Dicke möglich ist, um die Wahrscheinlichkeit des Identifizierens stained Neuronen zu erhöhen, die vollständig innerhalb einzelnen Abschnitte enthalten ist, herzustellen, ist dieser Ansatz aus technischen Sicht von dem Arbeitsabstand von hohen begrenztem Lineare Wiedergabe Mikroskopobjektive. Wir berichten hier über ein Protokoll Neuronen färbt das Golgi-Cox-Verfahren in Mausgehirnschnitte verwenden, die bei 500 &amp; mgr; m Dicke geschnitten werden, und Neuronen in der gesamten Tiefe dieser Abschnitte zur Visualisierungen mit einem hochauflösenden 30X 1,05 NA Silikon ausgerüstet ein aufrechtes Mikroskop Ölimmersionsobjektiv, das einen 800 um Arbeitsabstand aufweist. Wir berichten auch zwei nützliche Varianten dieses Protokolls, das verwendet werden kann, um die Oberfläche des gegenzufärbenmontiert Gehirnschnitt mit der Kresylviolett Nissl-Färbung, oder ganze Gehirne für die Langzeitlagerung vor dem Schneiden und Endverarbeitung gefrieren. Das Hauptprotokoll und seine zwei Varianten produzieren gefärbte dicke Hirnschnitten, wobei durchwegs voll Neuron Dendritenbäume und Dendriten Stacheln können zuverlässig sichtbar gemacht und quantifiziert werden.

500 &amp; mgr; m dicke Gehirnschnitte - Dieses Golgi-Cox-Färbung Protokoll und seine beiden beschriebenen optionalen Varianten können einzelne Neuronen innerhalb von 400 zu visualisieren eingesetzt werden. Repräsentatives Bild montages von zweidimensionalen Z-Projektionen Ziel unter Verwendung eines 10X aufgefangen und 5 um Schritte in der Z - Achse ist in Abbildung 1 gezeigt: A1 - C1 für einen großen Bereich der koronalen Hirnschnitten, die den anterioren cingulär...

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Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

Wir präsentieren ein Protokoll der Golgi-Cox-Färbung in dicken Hirnschnitten für die Verwendung, um Neuronen mit langen Dendritenbäume innerhalb einzelner Gewebeproben enthalten ist, zu visualisieren. Zwei Varianten dieses Protokolls werden auch vorgestellt, Kresylviolett Gegenfärbung einzubeziehen und das Einfrieren von nicht verarbeiteten Gehirne für die Langzeitlagerung.

Imaging Neurone innerhalb Dickhirnschnitten Mit der Golgi-Cox-Methode

The Golgi-Cox method of neuron staining has been employed for more than two hundred years to advance our understanding of neuron morphology within ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.2K Aufrufe.  University of Guelph.  Wir präsentieren ein Protokoll der Golgi-Cox-Färbung in dicken Hirnschnitten für die Verwendung, um Neuronen mit langen Dendritenbäume innerhalb einzelner Gewebeproben enthalten ist, zu visualisieren. Zwei Varianten dieses Protokolls werden auch vorgestellt, Kresylviolett Gegenfärbung einzubeziehen und das Einfrieren von nicht verarbeiteten Gehirne für die Langzeitlagerung. 

Serie: Imaging Neurons within Thick Brain Sections Using the Golgi-Cox Method

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

Eine schnelle Annäherung an High-Resolution Fluoreszenz-Imaging in Semi-Thick Hirnschnitten

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Forschung

Neurowissenschaften

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

Morphometrische Analysen von Netzhautschnitte

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile stimulation is a positive early experience that mimics maternal licking and grooming in the rat. Exposing rat pups to this positive experience can be completed easily and cost-effectively by using highly accessible materials such as a household duster. Using a cross-litter design, pups are either stroked or left undisturbed, for 15 min, three times per day throughout the perinatal period. To measure the neuroplastic changes related to this positive early experience, Golgi-Cox staining of brain tissue is utilized. Owing to the fact that Golgi-Cox impregnation stains a discrete number of neurons rather than all of the cells, staining of the rodent brain with Golgi-Cox solution permits the visualization of entire neuronal elements, including the cell body, dendrites, axons, and dendritic spines. The staining procedure is carried out over several days and requires that the researcher pay close attention to detail. However, once staining is completed, the entire brain has been impregnated and can be preserved indefinitely for ongoing analysis. Therefore, Golgi-Cox staining is a valuable resource for studying experience-dependent plasticity.

This paper describes the procedures for tactile stimulation of rat pups and subsequent Golgi-Cox staining of neuronal morphology. Tactile stimulation is a positive experience that is administered in the perinatal period by stroking pups with a household duster. Golgi-cox staining is a reliable procedure permitting the visualization of entire neurons.

Visualisierung der Auswirkungen einer Früh Positive Erfahrung, taktile Stimulation, auf dendritischen Morphologie und synaptische Verbindungen mit Golgi-Cox Färbung

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures in behaving animals remains a technical challenge, especially if the structures must be targeted stereotaxically. This protocol describes convenient surgical and electrophysiological techniques that maintain the animal&#8217;s head in the stereotaxic plane and unambiguously isolate the spiking activity of single neurons. The protocol combines head restraint of alert rodents, juxtacellular monitoring with micropipette electrodes, and iontophoretic dye injection to identify the neuron location in post-hoc histology. While each of these techniques is in itself well-established, the protocol focuses on the specifics of their combined use in a single experiment. These neurophysiological and neuroanatomical techniques are combined with behavioral monitoring. In the present example, the combined techniques are used to determine how self-generated vibrissa movements are encoded in the activity of neurons within the somatosensory thalamus. More generally, it is straightforward to adapt this protocol to monitor neuronal activity in conjunction with a variety of behavioral tasks in rats, mice, and other animals. Critically, the combination of these methods allows the experimenter to directly relate anatomically-identified neurophysiological signals to behavior.

This protocol describes the design and surgical implantation of a head-restraining mechanism to monitor neuronal activity in sub-cortical brain structures in alert rats. It delineates procedures to isolate single neurons in the juxtacellular configuration and to efficiently identify their anatomical locations.

Juxtacellular Überwachung und Lokalisierung von einzelnen Neuronen im Sub-kortikalen Hirnstrukturen der Alarm, Head-zurückhaltende Ratten

There are a variety of techniques to monitor extracellular activity of single neuronal units. However, monitoring this activity from deep brain structures ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to synaptic degeneration, inflammation, neuronal death, and learning deficits. Humans cannot regenerate lost neurons in the case of AD in part due to impaired proliferative capacity of the neural stem/progenitor cells (NSPCs) and reduced neurogenesis. Therefore, efficient regenerative therapies should also enhance the proliferation and neurogenic capacity of NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is a regenerative organism, and we can learn the basic molecular programs with which we could design therapeutic approaches to tackle AD. For this reason, the generation of an AD-like model in zebrafish was necessary. Using our methodology, we can introduce synthetic derivatives of A&#946;42 peptide with tissue penetrating capability into the adult zebrafish brain, and analyze the disease pathology and the regenerative response. The advantage over the existing methods or animal models is that zebrafish can teach us how a vertebrate brain can naturally regenerate, and thus help us to treat human neurodegenerative diseases better by targeting endogenous NSPCs. Therefore, the amyloid-toxicity model established in the adult zebrafish brain may open new avenues for research in the field of neuroscience and clinical medicine. Additionally, the simple execution of this method allows for cost-effective and efficient experimental assessment. This manuscript describes the synthesis and injection of A&#946;42 peptides into zebrafish brain.

This protocol describes the synthesis, characterization, and injection of monomeric amyloid-&#946;42 peptides for generating amyloid toxicity in adult zebrafish to establish an Alzheimer&#39;s disease model, followed by histological analyses and detection of aggregations.

Modellierung von Amyloid-β42 Toxizität und Neurodegeneration bei Erwachsenen Zebrafisch-Gehirn

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Bildgebung des primären Hirnrinde Zellen unter Verwendung einer 2D Kultursystem zu leben

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Determining the Functional Status of the Corticospinal Tract Within One Week of Stroke

High interindividual variability in the recovery of upper limb (UL) function after stroke means it is difficult to predict an individual&#39;s potential for recovery based on clinical assessments alone. The functional integrity of the corticospinal tract is an important prognostic biomarker for recovery of UL function, particularly for those with severe initial UL impairment. This article presents a protocol for evaluating corticospinal tract function within 1 week of stroke. This protocol can be used to select and stratify patients in trials of interventions designed to improve UL motor recovery and outcomes after stroke. The protocol also forms part of the PREP2 algorithm, which predicts UL function for individual patients 3 months poststroke. The algorithm sequentially combines a UL strength assessment, age, transcranial magnetic stimulation, and stroke severity, within a few days of the stroke. The benefits of using PREP2 in clinical practice are described elsewhere. This article focuses on the use of a UL strength assessment and transcranial magnetic stimulation to evaluate corticospinal tract function.

This protocol is for evaluating corticospinal tract function within 1 week of stroke. It can be used to select and stratify patients in trials of interventions designed to improve upper limb motor recovery and outcomes and in clinical practice for predicting upper limb functional outcomes 3 months after stroke.

Bestimmung des Funktionellen Status des Corticospinal Tract innerhalb einer Woche nach dem Schlaganfall

High interindividual variability in the recovery of upper limb (UL) function after stroke means it is difficult to predict an individual&#39;s potential ...