Wir danken Dr. Julie K. Horton für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Dr. Rajendra Prasad für Anregungen und Diskussionen. Teile dieser Forschung wurden ursprünglich in The Journal of Biological Chemistry, Sassa A et veröffentlicht. al., &quot;DNA-Sequenz Context Auswirkungen auf die Aktivität von humanem Glycosylase 8-Oxoguanine DNA Glycosylase.&quot; J Biol Chem. 287, 36702-36710 (2012) 2. Diese Arbeit wurde unterstützt, im Ganzen oder in Teilen, durch National Institutes of Health Research Project Grants Z01-ES050158 im Interne Research Program, NIEHS.

1. Herstellung des Enzyms DNA-Substrat und <ol><li> Over-express OGG1 als GST-Fusionsprotein in E. coli, nutzen die GST-tag für die Reinigung, und entfernen Sie dann die GST-tag durch Spaltung mit HRV-3C Protease (Abbildung 1) 6. </li><li> Kaufen Sie das chemisch synthetisiert 5&#39;-6-Carboxy-(6-FAM) markierte Oligonukleotid mit einem einzelnen 8-oxoG Rückstand und ihre komplementäre unmarkiertem Oligonukleotidstrang. Die 34-mer-Oligonucleotide enthalten ein 8-oxoG an Position 17 vom 5&#39;-Ende. Reinigen dieser Oligonucleotide durch Polyacrylamidgelelektrophorese. </li><li> Bereiten doppelsträngigen DNA-Substrats, das 8-oxoG durch Mischen von 5&#39;-6-FAM markierte Oligonukleotid mit ihren komplementären Strang in einem Molverhältnis von 1:1,2 in Hybridisierungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Das Röhrchen in einen Schwimmer in kochendem Wasser 5 min. Lassen Sie den Schlauch an Ort und Stelle und dann lassen Sie das Wasser langsam abkühlen zu room Temperatur (dies dauert ca. 2 h). </li><li> Führen Probenvorbereitung und das Experiment unter niedrigen oder minimalen Lichtverhältnissen so zu minimieren Bleichen der Fluoreszenz-Markierung. </li></ol> 2. Messung der Beharrungszustand Zeit Course und Active-Site Titration von OGG1 2.1. Probenvorbereitung und steady-state Zeitverlauf <ol><li> Bereiten DNA Substrat und OGG1 Lösungen getrennt in Reaktionspuffer (50 mM HEPES, pH 7,5, 20 mM KCl, 0,5 mM EDTA und 0,1% Rinderserumalbumin) in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Die Konzentration der DNA ist 400 nm und die scheinbare Konzentration OGG1 30, 60, 90, oder 120 nm, wie durch einen Bradford-Protein-Assay bestimmt. Legen Sie die Reaktionsgefäße in einem Heizblock Satz bei 37 ° C Pre-Inkubation Enzym und DNA-Substrat-Lösungen separat bei 37 ° C für 1 min. </li><li> Starten Sie die Reaktion durch Mischen gleicher Volumina der OGG1 und DNA-Substrat-Lösungen durch Pipettieren. Nach dem Mischen diese Lösunggen 1:1 (v / v), sind die Endkonzentrationen 200 nM DNA und 15, 30, 45 oder 60 nM OGG1 sind. Entfernen Aliquote (10 ul) in zeitlichen Abständen und wird die Reaktion durch Mischen mit 1 ul 1 M NaOH. Da die Steuerung für die Zeit-Verläufe, 10 ul des Reaktionsgemisches ohne Enzym wird mit 1 ul 1 M NaOH gemischt. </li><li> Die Reaktionsröhrchen Proben in einem 90 ° C Heizblock 5 min zu spalten, das resultierende Produkt AP-Website. Nach dem Erhitzen, fügen Sie 1 ul 1 M HCl, um jede Probe zu neutralisieren. </li><li> In das gleiche Volumen (12 ul) Gelladepuffer (95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,02% Bromphenolblau und 0,02% Xylencyanol) zu jeder Reaktion Probe, und legen Sie dann die Mischung in einem Heizblock bei 95 ° C eingestellt für 2 min, dann sofort den Schlauch auf Eis. </li><li> Laden der Proben (5 ul) auf einem 15% igen denaturierenden Polyacrylamidgel mit 8 M Harnstoff in 89 mM Tris-HCl, pH 8,8, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA und. Das Substrat und die gespaltenen Produkte sind nach abgetrenntAusführen des Gels. </li></ol> 2.2. Imaging des Gels <ol><li> Scannen Sie das Gel mit einem Imager, der die Fluoreszenz-markierten DNA erkennen und visualisieren das Substrat und Produkt-Bands. </li><li> Quantifizierung der Banden nach der Bebilderung das Gel. Beachten Sie, dass einige Hintergrund Spaltung nach der Behandlung des Substrats selbst mit NaOH (2A) beobachtet werden. Subtrahieren diesem Hintergrund aus der gemessenen Menge jedes Reaktionsprodukt. </li></ol> 2.3. Datenanalyse <ol><li> Zur Erstellung der Menge des Produkts an jedem Reaktionszeit (t) (Fig. 2B) ausgebildet ist. Analysieren der Rohdaten unter Verwendung der Gleichung 1, um die Amplitude des Burst (A 0, y-Achse) und der Steigung der linearen stationären Phase (V ss) zu bestimmen. </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1.jpg" /><ol start="2"><li> Grundstückdie y-Achse relativ zu der Gesamt-Protein-Konzentration (dh ersichtlich Enzymkonzentration, 2C), der ein Maß der aktiven Fraktion des Enzyms. Verwenden Sie eine lineare Anpassung mit Nullachsenabschnitt um den Korrekturfaktor für die Bestimmung des Anteils an aktivem Enzym bereitzustellen. </li><li> Zeichnen Sie die Steady-State-Rate relativ zum aktiven Enzym-Konzentration (Abbildung 2D) und bietet das Produkt Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (dh Steigung der angepassten Linie). </li></ol> 3. Messung der Pre-steady-state Zeitverlauf Wie in 2, Produktbildung während der Burst-Phase gezeigt zu schnell ist, um durch manuelles Mischen und Abschrecken zu messen. Somit kann eine schnelle Quench-Flow-Gerät bieten eine leistungsfähige Methode, um schnelle Reaktionen, die auf die Millisekunde Zeitskala (Abbildung 3) 5 auftreten messen. Das Gerät verwendet einen Computer-gesteuerten Antriebsmotor schnell mischen einnd löschen Reaktionen nach angegebenen Reaktionszeiten. Verwenden Sie zum Beispiel eine Kintek RQF-3 Schnelle Quench-Flow-Instrument, um die anfängliche Burst-Phase und anschließender Steady-State-Phase des Produkt-Bildung durch OGG1 katalysiert messen. Schnelle Quench-Flow Instruments sind von verschiedenen Herstellern erhältlich. 3.1. Vorbereitung der Probe Gesondert vorbereiten DNA Substrat und OGG1 Lösungen in 1,5-ml-Röhrchen wie in 2-1 beschrieben. Die Konzentrationen von DNA und aktive OGG1 sind 400 nM und 80 nM. Dies führt zu einer Endkonzentration von 200 nM und 40 nM DNA aktiv OGG1 nach dem Mischen 1:1 (v / v). 3.2. Vorbereitung der schnellen Quench-Flow-Gerät <ol><li> Schließen Sie ein zirkulierendes Wasserbad zur schnellen Quench-Flow-Instrument für Kontrolle der Temperatur (37 ° C). </li><li> Stellen Sie die Parameter des Gerätes und wählen die entsprechende Reaktion Schleife für den gewünschten Zeitpunkten nach den Anweisungen des Herstellerstionen. Die Reaktion Schleifen sind von variablen Längen, alternative Reaktionszeiten bieten. </li><li> Bereiten Reaktionspuffer und NaOH stillen Lösungen in 10 ml Luer Lock Einmalspritzen und befestigen diese Spritzen, um das Laufwerk Ports und laden Sie die Antrieb Reservoirs mit Reaktionspuffer (Spritzen B) und 142 mM NaOH (Spritze Q) (Spritze Ladeventile in LOAD-Position) . Um die Luftblasen aus der Spritze zu entfernen, funktioniert die Lösung hin und her mehrmals. </li><li> Senken Sie den Schrittmotor, bis sie die Spitze der Spritze (Spritze Ladeventile Sample laden Ventile in Position FIRE). </li><li> Spülen Sie die Loops, die Reaktion Loop, und die Exit-Linie mit Wasser und Methanol. Trocknen Sie die geröteten Bereiche komplett (Ventile in FLUSH Position). </li></ol> 3.3. Pre-steady-state Zeitverlauf <ol><li> Machen Sie ein Loch in der Spitze eines verkappten 1,5-ml-Röhrchen mit einer 16-Gauge-Nadel. Bringen Sie ein Rohr an der Ausfahrt Linie um den gestoppten Reaktion zu sammeln. </li><li> Stellen Sie die gewünschte reaction Zeit (in Sekunden) über die Tastatur ein. Der Schrittmotor wird eine Sicherungskopie zu for-Schleife Lautstärke so einzustellen, wie konstant Quench Volumen zu halten. Position Kolben für Spritze B gegen den Schrittmotor-Plattform durch Zugabe von Puffer mit den Einwegspritzen, die an den Antrieb Ports. </li><li> Füllen Sie 1 ml Luer Lock Einmalspritzen mit DNA-Substrat und OGG1 Lösungen, bzw. (Probenventile in LOAD-Position). Bringen Spritzen mit DNA-Substrat und OGG1 Lösungen für jede der Probenmenge Ports, und füllen Sie dann die Probe Loops mit DNA-Substrat und OGG1 Lösungen bzw. (Sample Load-Ventile in LOAD-Position). </li><li> Stellen Sie alle Spritze Ladeventile Sample Ladeventile der FIRE Position. Starten Sie die Reaktion durch eine Tastatur Hub (zB Presse von &quot;G&quot; oder &quot;START&quot;-Taste). DNA-Substrat und OGG1 Lösungen (18 ul pro Stück) werden sofort in der Reaktionsschleife gemischt. </li><li> Warten Sie, bis die Reaktion automatisch an der gewünschten Reaktionszeit durch Mischen 36 ul der r abgeschreckteaktion Mischung mit 86 ul 142 mM NaOH. Nach Quenchen der Reaktion wird die Probe aus der Auslassleitung abgeführt. </li><li> Legen Sie die Spritze Ladeventile der LOAD-Position und die Probe Ladeventile dem FLUSH Position. Spülen Sie die Loops, die Reaktion Loop, und die Exit-Linie mit Wasser und Methanol und trocknet wie in 3.2 beschrieben. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Zeitpunkt. </li><li> Durchführen einer Kontrollexperiment ohne Enzym, um einen Hintergrund-Korrektur, die von Hand oder mit dem schnellen Abschrecken Instrument durchgeführt werden soll. Um ein Steuerelement mit der S-Quench Instrument durchzuführen, füllen Sie die Sample-Loop für die DNA mit DNA-Substrat aber halten Sie die Sample-Loop für OGG1 leer. Stellen Sie die Reaktionszeit, führen Sie die Mischung und Abschrecken in 3.3.4-3.3.6 beschrieben. </li><li> Waschen Sie die Probe Loops und die Reaktion Schleife mit 2 M NaOH, 2 M HCl, Wasser und Methanol und dann trocknen Sie die gewaschene Linien. Nach der Einstellung der Schrittmotor zur Ausgangsposition, schalten Sie die Spritze Ladeventile der LOAD Positionierungn und waschen Sie die Antrieb Stauseen mit Wasser. </li><li> Behandeln der abgeschreckten Proben Reaktion mit Hitze und dann getrennten Substrat und Produkt-DNA von 15% denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese, wie in 2.1 beschrieben. </li><li> Visualisierung und Quantifizierung der Banden auf dem Gel, wie in 2.2 beschrieben. </li></ol> 3.4. Datenanalyse Montieren Sie die zeitlichen Verläufe der Produktbildung durch nicht-lineare Regressionsanalyse, um eine Gleichung mit einer steigenden exponentiellen und linearen Terme (Gleichung 2) die Bereitstellung der ersten Ordnung Geschwindigkeitskonstante (k obs), die Amplitude des Bursts (A 0) und eine lineare Geschwindigkeit (v ss). <img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2.jpg" /> 4. Einzel-Umsatz Zeitverlauf <ol><li> Bereiten DNA Substrat und OGG1 in separaten 1,5-ml-Röhrchen wie in 2-1 beschrieben. Die Konzentrationgen von DNA und aktive OGG1 sind 100 nm und 500 nM; ergibt dies Endkonzentrationen von 50 nM und 250 nM DNA OGG1 nach dem Mischen 1:1 (v / v). </li><li> Bereiten Sie den schnellen Quench-Flow-Gerät und bereiten die Reaktion Proben wie in 3.2 und 3.3 beschrieben. </li><li> Behandeln Sie die Proben abgeschreckt Reaktion mit Wärme und unterziehen sie 15% denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf separaten Substrat und Produkte wie in 2.1 beschrieben. </li><li> Visualisierung und Quantifizierung der Banden auf dem Gel, wie in 2.2 beschrieben. </li><li> Montieren Sie die zeitlichen Verläufe der Produktbildung zu einem einzigen exponentiellen die erster Ordnung (k obs) zu bestimmen, wie in Gleichung 3 gegeben. </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3.jpg" />

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Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die kinetischen Ansätze hier beschriebenen Methoden, um einen Überblick über elementare kinetischen Konstanten definieren. Wenn ein Zeitverlauf der Produktbildung ist biphasisch mit der ersten enzymatischen Umsatz auftretenden schnell, dann ein Schritt nach Chemie geschwindigkeitsbestimmenden während anschließende katalytische Umsätze. Im Falle OGG1 kann die erste Umsatz unter Verwendung hoher Konzentrationen Enzym entweder mit Begrenzung (S &lt;E) oder hohen (S&gt; E) DNA-Konzentrationen werden. Im ersten Fall wi...

Einer aeroben Umgebung beeilt genomische Instabilität. Ein wesentlicher promutagene DNA Läsion aus oxidativem Stress ist 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG). Dies ist aufgrund der mehrdeutigen Codierung Potential 8-oxoG. Menschliche 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) ist verantwortlich für die Initiierung Basenexzisionsreparatur von 8-oxoG. Die glycosylase Aktivität OGG1 schneidet das 8-oxoG Basis resultierende Produkt in DNA mit einer Apurin Website (AP-site). Eine schwache Lyaseaktivität von OGG1 können die AP-Website in einigen Fällen einzuschneiden. Kinetische Charakterisierung von DNA Glycosylasen allgemein fest, dass sie zweiphasige zeitliche Verläufe aufweisen. Nach einer anfänglichen schnellen Phase der Produktbildung (dh Burst) wird eine lineare stationären Phase beobachtet 1-3. Dieses Verhalten ist, das einen Schritt nach Chemie (dh Konformationsänderung oder Produkt release) ist geschwindigkeitsbestimmend während des linearen Teils der Zeitverlauf, während der Bohrerst Phase, die oft als die transiente Phase bezeichnet, entspricht die Produktbildung in der aktiven Stelle des Enzyms während des ersten Zyklus der Reaktion. Bei Produkt-Release Rate Limiting während der Steady-State-Phase ist, bieten Aktivitätsmessungen eine qualitative Messung der Produkt-DNA Bindungsaffinität, aber keine kinetische Informationen über Veranstaltungen im aktiven Zentrum des Enzyms (dh Chemie). Dementsprechend sind Methoden zu isolieren und messen die exponentielle pre-steady-state Burst-Phase benötigt, um Ereignisse während der ersten enzymatischen Umsatz an das Enzym aktive Zentrum 4 sondieren. Es gibt drei Standard kinetische Ansätze, um die katalytische Verhalten OGG1 charakterisieren, (1) Steady-State, (2) pre-steady-state, und (3) Single-Turnover. Diese Ansätze unterscheiden sich durch die Konzentration des Enzyms in dem Reaktionsgemisch und dem Enzym zu Substrat-Verhältnis in jedem Ansatz verwendet. In einem typischen Steady-State-Ansatz,manchmal als mehrere Umsatzkinetik bezeichnet werden, sind geringe Konzentrationen von Enzym zur Bildung Produkt folgen. Die Substratkonzentration übersteigt bei weitem die Enzymkonzentration so dass mehrere enzymatische Umsätze nicht wesentlich beeinträchtigen Substratkonzentration. In dieser Situation sollte Zeitverläufe linear sein, und es ist oft schwierig zu erkennen, ob ein Burst in der ersten Umsatz aufgrund der geringen Enzymkonzentration in diesem Ansatz trat; beachten Burstamplitude entspricht der Enzymkonzentration. Dies kann durch Verwendung einer höheren Enzymkonzentration und Extrapolieren der linearen Zeitverlauf auf den Zeitpunkt Null zu erfassen, ob die erste enzymatischen Umsetzung schnell aufgetreten überwunden werden. Der Achsenabschnitt auf der Ordinate (y-Achse) sollte proportional zur Enzymkonzentration und stellt ein Maß für das Enzym aktiv mit dem Substrat in Eingriff. Obwohl dieser Ansatz im Prinzip den Nachweis für die Existenz eines Burst-Phase, und ein DIF-schiedenen Ansatz erforderlich, um die Kinetik der Burst-Phase messen. In vielen Fällen ist der Burst-Phase ist zu schnell, um durch manuelles Mischen und Abschrecken Techniken messen. In dieser Situation nähert sich pre-steady-state und Single-Turnover-kinetische (dh transient kinetische) erfordern oft einen schnellen-mixing und Abschrecken Instrument zu frühen Zeitpunkten einer Reaktion 5 folgen. In einer vorher stationären Ansatz hohe Konzentrationen des Enzyms, so dass eine erhebliche Menge an Produkt in der ersten Umsatzes gebildet werden. Da mehrere Umsätze gefolgt sind katalytische Radfahren (dh die lineare Phase, die die Burst folgt) zu beobachten, ist Substratkonzentration größer als die Enzymkonzentration ([Enzym] &lt;[Substrat]). Um Ereignisse im aktiven Zentrum des Enzyms zu isolieren ohne Katalysator Radfahren, sind Single-Turnover-Bedingungen verwendet. In diesem Fall wird das Substrat mit dem Enzym gesättigt (E &gt;&gt; S), so dass alle von dem Substrat wird i teilnehmenn der &quot;einzigen Umsatz&quot; und wird typischerweise eine Single-exponentiellen Zeitverlauf. Wie oben für Enzyme, die eine Burst-Phase, Produkt-Release (k off) weisen darauf hingewiesen, begrenzt oft die Geschwindigkeit der Steady-State-Phase des zeitlichen Verlaufs. Die Rate der Freisetzung (v ss, Konz. / Zeit) aus der Steigung der linearen steady-state-Phase bestimmt werden. Die aktive Enzymkonzentration (E) benötigt wird, um die Rate der Produkt-Release einer intrinsischen Geschwindigkeitskonstante konvertieren wo k off = v ss / [E]. Wichtig ist, dass das aktive Enzym-Konzentration in der Regel niedriger als der gemessene Proteinkonzentration durch Verunreinigungen, inaktives Enzym, Enzym nicht-produktiv Substrat gebunden, und die Methode zur Protein-Konzentration bestimmen. Die aktive Enzymkonzentration kann aus dem Burstamplitude bestimmt werden, wenn Produkt-Release ist langsam. So Extrapolation eine steady-state zeitlichen Verlauf zuNull Zeit liefert eine Schätzung der aktiven Enzym benötigt, um k off (Produktversion) aus dem beobachteten steady-state zu berechnen. Um die Kinetik des Bursts messen, ist ein Pre-Steady-State-Ansatz notwendig, um Produkt-Bildung während der ersten Umsätze, die vor dem linearen stationären Phase tritt folgen. Die Burst-Kinetik folgt die Bildung von Enzym-Zwischenprodukts. Sobald die Reaktion durch Mischen von Enzym mit dem Substrat eingeleitet wird, die Menge an Enzym-Produkt schnell erhöht, bis die Reaktion einen stationären Zustand erreicht Phase. Wenn Katalyse ist viel schneller als Produkt-Release ist die Amplitude des Bursts gleich aktiv engagiert Enzym und dem beobachteten exponentiellen Annäherung an das Gleichgewicht (k obs) entspricht der Geschwindigkeit der chemischen Umwandlung von Substrat zu Produkt, vorausgesetzt, dass das Gegenteil von Chemie vernachlässigbar. In einigen Fällen katalytischen cyklammern stört mit einem pre-steady-state-Analyse, z. B. wenn die Größen der Preise für Chemie und Produkt-Release sind nicht signifikant unterschiedlich. In diesem Fall, unter Verwendung überschüssigen Enzym relativ zu dem Substrat verhindert katalytische Rad-und Grenzwerte Substrat mit dem Enzym in einem Umsatz gebunden. Dementsprechend kann die erste chemische Schritt der Reaktion isoliert und genau bestimmt als die Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung (k obs). Diese Geschwindigkeitskonstante sollte ähnlich k obs ermittelt aus der pre-steady-state oben beschriebenen Ansatz. Hier beschreiben wir, wie diese kinetische Ansätze verwendet werden, um die Aktivität von glycosylase OGG1 analysieren.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5'-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>5'-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Unlabeled oligonucleotides (complementary strand)</td>
 <td>Eurofins MWG Operon</td>
 <td></td>
 <td>Polyacrylamide gel purification grade is recommended. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BD Medical</td>
 <td>309628</td>
 <td>Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml BD Luer Lock disposable syringe</td>
 <td>BE Medical</td>
 <td>309604</td>
 <td>Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Circulating water bath</td>
 <td>Any vender</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument</td>
 <td>KinTek Corporation</td>
 <td></td>
 <td>Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Typhoon Phosphorimager 8600</td>
 <td>GE Healthcare Life Sciences</td>
 <td></td>
 <td>Imager from other vendors can be used as well.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KaleidaGraph</td>
 <td>Synergy Software</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

steady-state, pre-steady-state, and single-turnover kinetic measurement for dna glycosylase activity

Menschliche 8-Oxoguanin-DNA-Glycosylase (OGG1) schneidet das mutagene oxidative DNA Läsion 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) von DNA. Kinetische Charakterisierung OGG1 vorgenommen wird, um die Raten von 8-oxoG Exzision und Produkt-Release zu messen. Wenn die Konzentration niedriger als OGG1 Substrat-DNA ist, sind Zeitverläufe der Produktbildung zweiphasige, eine schnelle exponentielle Phase (dh Burst) der Produktbildung durch einen linearen stationären Phase. Anfängliches Platzen der Produktbildung entspricht der Konzentration des Enzyms auf das Substrat ordnungsgemäß in Eingriff, und der Burst-Amplitude abhängig von der Konzentration des Enzyms. Die ersten Ordnung Geschwindigkeitskonstante des Bursts entspricht der intrinsischen Rate von 8-oxoG Exzision und die langsamere steady-state Inflationsrate misst die Rate der Freisetzung (Produkt DNA Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante, k off). Hier beschreiben wir Steady-State-, pre-steady-state und Single-Turnover-Ansätze zu isolieren und zu messen specific Schritte während OGG1 katalytische Radfahren. A fluoreszenzmarkierte Läsion enthaltenden Oligonukleotid und gereinigt OGG1 werden verwendet, um präzise kinetische Messungen zu erleichtern. Seit niedrig Enzymkonzentrationen verwendet werden, um steady-state Messungen, manuelles Mischen von Reagenzien und Abschrecken der Reaktion machen kann durchgeführt werden, um die steady-state (k off) zu ermitteln. Zusätzlich zeigt Extrapolation der stabilen Frequenz bis zu einem Punkt auf der Ordinate auf Null Mal, dass ein Platzen der Produktbildung in der ersten Umsatz (dh der y-Achse positiv ist) eingetreten ist. Die ersten Ordnung Geschwindigkeitskonstante der exponentiellen Burst-Phase kann unter Verwendung eines schnellen Vermischung und Abschrecken Technik, die die Menge des Produkts, in kurzen Zeitabständen (&lt;1 s) vor der stationären Phase gebildet untersucht und entspricht der Höhe von 8 werden oxoG-Exzision (dh Chemie). Die chemische Schritt kann auch unter Verwendung eines Single-Turnover-Ansatz, wo katalytische Radfahren istverhindert durch Sättigen Substrat-DNA mit dem Enzym (E&gt; S). Diese Ansätze lassen sich messen elementare Geschwindigkeitskonstanten, die die Effizienz der Entfernung von einer DNA-Läsion beeinflussen.

Die Steady-State kinetischen Analyse wurde unter Verwendung von 200 nM DNA Substrat und vier verschiedenen scheinbaren Konzentrationen OGG1 (15, 30, 45 und 60 nm), wie durch einen Bradford-Protein-Assay bestimmt 2 durchgeführt. Die Zeitverläufe der Produktbildung von einer linearen Gleichung, um die y-Achse, die 2,2 waren, 11, 15 und 26 nm, relativ zueinander Proteinkonzentration (2B) zu bestimmen, zu passen. Die y-fängt wurden weiter aufgetragen relativ zueinander tatsächlichen Proteinko...

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Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Zeit Kurse für die glycosylase Aktivität von 8-oxoguanine DNA glycosylase sind zweiphasige ausstellenden ein Platzen der Produkt-Bildung und einer linearen steady-state-Phase. Verwendung Quench-Flow-Techniken, die platzen und die Steady-State-Raten gemessen werden können, die Exzision von 8-oxoguanine und Freisetzung des glycosylase DNA aus dem Produkt entsprechen.

Steady-State-, Pre-Steady-State-und Einzel-Umsatz Kinetic Measurement für DNA Glycosylase Aktivität

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

steady-state-pre-steady-state-single-turnover-kinetic-measurement-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

19.2K Aufrufe.  NIEHS, National Institutes of Health. Zeit Kurse für die glycosylase Aktivität von 8-oxoguanine DNA glycosylase sind zweiphasige ausstellenden ein Platzen der Produkt-Bildung und einer linearen steady-state-Phase. Verwendung Quench-Flow-Techniken, die platzen und die Steady-State-Raten gemessen werden können, die Exzision von 8-oxoguanine und Freisetzung des glycosylase DNA aus dem Produkt entsprechen.

Serie: Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of biomacromolecules, including DNA. Therefore, efficient detection of DNA oxidation is important for a variety of research disciplines, including medicine and toxicology. A common biomarker of oxidatively damaged DNA is 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo; often erroneously referred to as 8-hydroxy-2&#39;-deoxyguanosine (8-OH-dGuo or 8-oxo-dG)). Several protocols for 8-oxo-dGuo measurement by high pressure liquid chromatography with electrochemical detection (HPLC-ED) have been described. However, these were mainly applied to purified DNA treated with pro-oxidants. In addition, due to methodological differences between laboratories, mainly due to differences in analytical equipment, the adoption of published methods for detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED requires careful optimization by each laboratory. A comprehensive protocol, describing such an optimization process, is lacking. Here, a detailed protocol is described for the detection of 8-oxo-dGuo by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues. It illustrates how DNA sample preparation can be easily and rapidly optimized to minimize undesirable DNA oxidation that can occur during sample preparation. This protocol shows how to detect 8-oxo-dGuo in cultured human alveolar adenocarcinoma cells (i.e., A549 cells) treated with the oxidizing agent KBrO3, and from the spleen of mice exposed to the polycyclic aromatic hydrocarbon dibenzo(def,p)chrysene (DBC, formerly known as dibenzo(a,l)pyrene, DalP). Overall, this work illustrates how an HPLC-ED methodology can be readily optimized for the detection of 8-oxo-dGuo in biological samples.

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&amp;#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

The goal of this protocol is the detection of the DNA oxidation marker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by HPLC-ED, in DNA from cultured cells or animal tissues.

HPLC-Messung der DNA-Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#39;-Desoxyguanosin, in kultivierten Zellen und tierischen Geweben

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

Forschung

Chemie

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Herstellung von Mica und Siliziumsubstraten für die DNA-Origami-Analyse und Experimentieren

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Ethylene Polymerizations Using Parallel Pressure Reactors and a Kinetic Analysis of Chain Transfer Polymerization

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel &#945;-diimine ethylene polymerization catalyst. Initial polymerizations with the catalyst lead to optimized reaction conditions, including catalyst concentration, ethylene pressure and reaction time. Using gas-uptake data for these reactions, a procedure to calculate the initial rate of propagation (kp) is presented. Using the optimized conditions, the ability of the nickel &#945;-diimine polymerization catalyst to undergo chain transfer with diethylzinc (ZnEt2) during ethylene polymerization was investigated. A procedure to assess the ability of the catalyst to undergo chain transfer (from molecular weight and 13C NMR data), calculate the degree of chain transfer, and calculate chain transfer rates (ke) is presented.

A protocol for the high-throughput analysis of polymerization catalyst, chain transfer polymerizations, polyethylene characterization, and reaction kinetic analysis is presented.

Ethylenpolymerisationen Mit Parallel Druckreaktoren und eine kinetische Analyse chain transfer polymerization

We demonstrate a method for high-throughput catalyst screening using a parallel pressure reactor starting from the initial synthesis of a nickel ...

Fabrication and Testing of Photonic Thermometers

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being leveraged for developing sophisticated photonic sensors. Silicon photonic sensors seek to exploit the strong confinement of light in nano-waveguides to transduce changes in physical state to changes in resonance frequency. In the case of thermometry, the thermo-optic coefficient, i.e., changes in refractive index due to temperature, causes the resonant frequency of the photonic device such as a Bragg grating to drift with temperature. We are developing a suite of photonic devices that leverage recent advances in telecom compatible light sources to fabricate cost-effective photonic temperature sensors, which can be deployed in a wide variety of settings ranging from controlled laboratory conditions, to the noisy environment of a factory floor or a residence. In this manuscript, we detail our protocol for the fabrication and testing of photonic thermometers.

We describe the process of fabrication and testing of photonic thermometers.

Herstellung und Prüfung von photonischen Thermometer

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since the approval of romidepsin, a class I HDAC inhibitor for cancer therapy, and the clinical investigation of HDAC6-specific inhibitors for multiple myeloma. The present method is used to determine the inhibitory activity of test compounds on HDAC1 and HDAC6 in cells. The isoform activity is measured using the ultra-high-performance liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (UHPLC-MS) analysis of specific substrates incubated with treated and untreated HeLa cells. The method has the advantage of reflecting the endogenous HDAC activity within the cell environment, in contrast to cell-free biochemical assays conducted on isolated isoforms. Moreover, because it is based on the quantification of synthetic substrates, the method does not require the antibody recognition of endogenous acetylated proteins. It is easily adaptable to several cell lines and an automated process. The method has already proved useful in finding HDAC6-selective compounds in neuroblasts. Representative results are shown here with the standard HDAC inhibitors trichostatin A (non-specific), MS275 (HDAC1-specific), and tubastatin A (HDAC6-specific) using HeLa cells.

The present method serves to identify isoform-specific inhibitors of histone deacetylases (HDAC) in HeLa cells by the UHPLC-MS analysis of multiple substrates. This is an antibody-free method developed to reflect HDAC1 and HDAC6 activity in the living cell environment, in contrast to single-isoform cell-free assays.

Gleichzeitige Messung von HDAC1 und HDAC6 Tätigkeit in HeLa-Zellen mit UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

Entwirren hohe Festigkeit-Copolymer-Aramid-Fasern um die Bestimmung der mechanischen Eigenschaften ermöglichen

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands for in vivo investigations. Within this protocol, a robust and reliable remote-controlled radiosynthesis of [11C]SNAP-7941, an antagonist to the melanin-concentrating hormone receptor 1, is described. The radiosynthesis starts with cyclotron produced [11C]CO2 that is subsequently further reacted via a gas-phase transition to [11C]CH3OTf. Then, this reactive intermediate is introduced to the precursor solution and forms the respective radiotracer. Chemical as well as the radiochemical purity are determined by means of RP-HPLC, routinely implemented in the radiopharmaceutical quality control process. Additionally, the molar activity is calculated as it is a necessity for the following real-time kinetic investigations. Furthermore, [11C]SNAP-7941 is applied to MDCKII-WT and MDCKII-hMDR1 cells for evaluating the impact of P-glycoprotein (P-gp) expression on cell accumulation. For this reason, the P-gp expressing cell line (MDCKII-hMDR1) is either used without or with blocking prior to experiments by means of the P-gp substrate (&#177;)-verapamil and the results are compared to the ones observed for the wildtype cells. The overall experimental approach demonstrates the importance of a precise time-management that is essential for every preclinical and clinical study using PET tracers radiolabelled with short-lived nuclides, such as carbon-11 (half-life: 20 min).

Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941

Here, we represent a protocol for the fully automated radiolabelling of [11C]SNAP-7941 and the analysis of the real-time kinetics of this PET-tracer on P-gp expressing and non-expressing cells.

Technischer Aspekt der automatisierten Synthese und Echtzeit-Kinetik-Evaluierung von [11C]SNAP-7941

Positron emission tomography (PET) is an essential molecular imaging technique providing insights into pathways and using specific targeted radioligands ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment screening. NMR-based activity assays are ideally suited to work at the higher concentrations of test compounds required to detect these weaker inhibitors. The dynamic range and chemical shift dispersion in an NMR experiment can easily resolve resonances from substrate, product, and test compounds. This contrasts with spectrophotometric assays, in which read-out interference problems often arise from compounds with overlapping UV-vis absorption profiles. In addition, since they lack reporter enzymes, the single-enzyme NMR assays are not prone to coupled-assay false positives. This attribute makes them useful as orthogonal assays, complementing traditional high throughput screening assays and benchtop triage assays. Detailed protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells. The methods are demonstrated using two nucleoside ribohydrolase enzymes. The use of 1H NMR is shown for the purine-specific enzyme, while 19F NMR is shown for the pyrimidine-specific enzyme. The protocols are generally applicable to any enzyme where substrate and product resonances can be observed and distinguished by NMR spectroscopy. To be the most useful in the context of drug discovery, the final concentration of substrate should be no more than 2-3x its Km value. The choice of NMR experiment depends on the enzyme reaction and substrates available as well as available NMR instrumentation.

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-based activity assays have been developed to identify and characterize inhibitors of two nucleoside ribohydrolase enzymes. Protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells.

NMR-based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and chemical research. To meet the demand for high-performance microreactors, we developed a femtoliter droplet array (FemDA) device and exemplified its application in massively parallel cell-free protein synthesis (CFPS) reactions. Over one million uniform droplets were readily generated within a finger-sized area using a two-step oil-sealing protocol. Every droplet was anchored in a femtoliter microchamber composed of a hydrophilic bottom and a hydrophobic sidewall. The hybrid hydrophilic-in-hydrophobic structure and the dedicated sealing oils and surfactants are crucial for stably retaining the femtoliter aqueous solution in the femtoliter space without evaporation loss. The femtoliter configuration and the simple structure of the FemDA device allowed minimal reagent consumption. The uniform dimension of the droplet reactors made large-scale quantitative and time-course measurements convincing and reliable. The FemDA technology correlated the protein yield of the CFPS reaction with the number of DNA molecules in each droplet. We streamlined the procedures about the microfabrication of the device, the formation of the femtoliter droplets, and the acquisition and analysis of the microscopic image data. The detailed protocol with the optimized low running cost makes the FemDA technology accessible to everyone who has standard cleanroom facilities and a conventional fluorescence microscope in their own place.

The overall goal of the protocol is to prepare over one million ordered, uniform, stable, and biocompatible femtoliter droplets on a 1 cm2 planar substrate that can be used for cell-free protein synthesis.

Ein Femtoliter Droplet Array für massive parallele Proteinsynthese aus einzelnen DNA-Molekülen

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Quantitative Atomic-Site Analysis of Functional Dopants/Point Defects in Crystalline Materials by Electron-Channeling-Enhanced Microanalysis

A novel elemental and chemical analysis scheme based on electron-channeling phenomena in crystalline materials is introduced, where the incident high-energy electron beam is rocked with the submicrometric pivot point fixed on a specimen. This method enables us to quantitatively derive the site occupancies and site-dependent chemical information of impurities or intentionally doped functional elements in a specimen, using energy-dispersive X-ray spectroscopy and electron energy-loss spectroscopy attached to a scanning transmission electron microscope, which is of significant interest to current materials science, particularly related to nanotechnologies. This scheme is applicable to any combination of elements even when the conventional Rietveld analysis by X-ray or neutron diffraction occasionally fails to provide the desired results because of limited sample sizes and close scattering factors of neighboring elements in the periodic table. In this methodological article, we demonstrate the basic experimental procedure and analysis method of the present beam-rocking microanalysis.

We provide a general outline of quantitative microanalysis methods for estimating the site occupancies of impurities and their chemical states by taking advantage of electron-channeling phenomena under incident electron beam-rocking conditions, which reliably extract information from minority species, light elements, oxygen vacancies, and other point/line/planar defects.