Diese Arbeit wird von der Biotechnologie und Biologische Wissenschaften Research Council (BBSRC), der Royal Society und der Universität von Nottingham unterstützt.

1. Bestimmung der Fluoreszenzintensität bei der Bindung von Mant-markierten Nucleotide. <ol><li> 1 uM mant-markierte Nukleotid zu 1 uM Kinesin (Endkonzentrationen) in einem geeigneten Reaktionspuffer. Typischerweise ein Puffer, der Mikrotubuli-Wachstum und Stabilität profitiert verwendet wird (siehe Diskussion). Eine häufig verwendete Puffer 80 mM Piperazin-bis-2-ethansulfonsäure (PIPES) enthält pH6.9, 1 mM MgCl 2 und 1 mM Ethylenglykol-bis-2-Aminoether-tetraessigsäure (EGTA). Anmerkung: Die Konzentration von Kinesin in alle Protokolle angegeben, bezieht sich auf die Konzentration der Nukleotid-Bindungsstellen (dh Motordomänen). Verschiedenen Kinesine existieren als Monomere, Dimere oder Tetramere und so können mehr als ein Nukleotid-Bindungsstelle pro Molekül enthalten. </li><li> Nach einer Inkubationszeit (1-3 min) und mit einem Standard-Fluorimeter, messen Sie den Emissionsspektrum für die mant-markiertes Nukleotid-Kinesin-Komplex. Verwenden Sie eine Anregungswellenlänge von 365 nm undMaßnahme emittierte Licht von 400 bis 500 nm in 1 nm-Schritten. </li><li> Einen Lösung von 1 mM mant-markierte Nukleotid in der in Schritt 1.1 verwendet gleichen Reaktionspuffer. </li><li> Messung des Emissionsspektrums für die mant Nukleotid nur Probe, wie zuvor beschrieben (siehe Schritt 1.2). </li><li> Normalisierung der Spektren des Signals bei der Wellenlänge der Spitzenfluoreszenzintensität des Spektrums mant Nucleotid in Lösung (dh ohne Kinesin) von durch Dividieren dieses Wertes. </li><li> Zeichnen Sie die normierten Spektren (zB 2B), um Fluoreszenzintensität Unterschiede zwischen dem mantATP gebundenen und / oder mantADP gebundenen Kinesin und mant Nukleotid in Lösung beobachten. </li></ol> 2. Messung der Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten für mantATP <ol><li> Zu einer Lösung von bis zu 20 uM Kinesin (siehe Diskussion) in jeder geeigneten Mg 2 + -freien Puffer (zB 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM EGTA, 0,1% Tween 20), fügen Sie 1mM (Endkonzentration) Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 1 mM (Endkonzentration) Dithiothreitol (DTT). Hinweis: Die Zugabe von Tween 20 in den Puffer wird empfohlen, da es reduziert / verhindert den Verlust von Kinesin-Protein auf der für Pufferaustausch verwendete Säule (Schritte 2.3 und 3.3) </li><li> Inkubieren der Lösung bei 25 ° C für 15 min. </li><li> Separate kostenlos Nukleotid-und EDTA aus der Kinesin mit einem Schwerkraft G-25 Sephadex Gelfiltrationssäule nach den Anweisungen des Herstellers (siehe Liste der Materialien). <ol><li> Äquilibrieren die Säule mit mindestens 3 Säulenvolumina eines geeigneten Mg 2 + -freien Puffer (siehe Schritt 2.1). Laden Sie das Kinesin-haltigen Lösung auf die Säule. Vorbereiten einer Sammelröhrchen durch Zugabe eines geeigneten Volumens von 100 mM Magnesiumchlorid-Lösung zu der leeren Hülse, so dass die endgültige Konzentration von Magnesiumchlorid von 1 mm nach dem Sammeln der Kinesin-Lösung. Sofortige Zugabe von Magnesiumchlorid hilft StAbILISE Die Nukleotid-freien Kinesin. </li><li> Eluieren die Kinesin unter Verwendung eines geeigneten Mg 2 + -freien Puffer. Kinesinen instabil sind, wenn sie frei von Nukleotid-so ist es wichtig, schnell zu arbeiten. Bewahren Sie die Nukleotid-freien Kinesin auf Eis und innerhalb von 1-2 Stunden. </li></ol></li><li> Während oder vor der Herstellung von Nukleotid-freien Kinesin, bereiten eine mantATP Konzentrationsreihe in der gleichen Reaktionspuffer als die endgültige Lösung von Nukleotid-freien Kinesin. Bestimmen Sie den Bereich von Konzentrationen der mantATP nach den vorliegenden Konzentration von Kinesin mit einer typischen Serie im Bereich von 0,1 bis 50 um (siehe Schritt 2.5 und Diskussion) erforderlich. </li><li> Bereiten Sie eine Konzentrationsreihe von Nukleotid-freien Kinesin. Für jede Konzentration der mantATP (Schritt 2.4), sollte eine Konzentration von Nukleotid freien Kinesin hergestellt, daß die mant-markierte Nukleotid in 5 bis 10-fachen molaren Überschuß über Kinesin-Nukleotid-Bindungsstellen bestehen. </li><li> Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf der Stopped-flow Fluorimeter bis 365 nm und sammeln emittierten Lichts bei&gt; 400 nm mit einem Langpassfilter. </li><li> Beginnend mit der niedrigsten Konzentration von mantATP, mischen mantATP mit einer geeigneten Konzentration von Nukleotid freien Kinesin in einer 1: 1 v / v-Verhältnis unter Verwendung einer Stopped-Flow-Fluorimeter (3A und 3B Inset). Anmerkung: Die Reaktanten werden 50% beim Mischen verdünnt. Notieren Sie sich die Nukleotid-Konzentration sowohl vor und nach Durchmischung (dh, 3,0 / 1,5 uM), um Verwechslungen zu vermeiden. </li><li> Passen die Veränderung der Fluoreszenzintensität bei jeder Konzentration von mantATP einer Exponentialfunktion zuzüglich einer Linie konstanter negativer Steigung gemessen, um Photobleaching der mant-Gruppe ausmachen (dh Fluoreszenz = A 0 .exp (k obs .T) + (m. t + c), wobei A 0 ist die Amplitude, k obs die Geschwindigkeitskonstante und t die Zeit, siehe Abbildung 3B und Diskussion). Aus diesen Anfällen bestimmen einKonstante (k obs) bei jeder Konzentration von mantATP. Jeder k obs ist eine Faltung der Vereinigung und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (Abbildung 1, K 1 und K -1). </li><li> Entfalten, die Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten durch Auftragen k obs gegen mantATP Konzentration (zB 3C). Passen diese Daten an eine lineare Funktion (dh k obs = k 1 [mantATP] + k-1), um die Steigung und die y-Achsenabschnitt zu erhalten. Die Steigung stellt die Geschwindigkeitskonstante für mantATP Verein (Abbildung 1, k 1) mit den Einheiten M -1 s -1. Der Schnitt stellt die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (Abbildung 1, k -1) mit Einheiten der s -1 (siehe Diskussion). Hinweis: Diese Vorgehensweise kann auch angewendet werden, um die ADP Assoziation und Dissoziation bestimmenGeschwindigkeitskonstanten (1, k und k -4 4) unter Verwendung mantADP als Nukleotid. </li></ol> 3. Messung der Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante für mantADP <ol><li> Zu einer Lösung von 2 uM Kinesin in einem geeigneten Reaktionspuffer (zB 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 0,1% Tween 20) werden 50 uM mantADP (Endkonzentration). </li><li> Inkubieren bei 25 ° C für 30 min. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges mantADP und andere freie Nukleotid durch Puffer Austausch des Kinesin in der gewählten Reaktionspuffer mit einem G-25-Sephadex-Säule (siehe Liste der Materialien) nach den Anweisungen des Herstellers. Die Kinesin-Motordomäne sollte nun mit mantADP geladen werden. </li><li> Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf der Stopped-Flow-Fluorimeter bis 365 nm und sammeln emittierten Lichts bei&gt; 400 nm mit einem Langpassfilter. </li><li> Mischen Sie die mantADP.kinesin Komplex (~ 1 uM) mit einem 50-fach oder mehr Molar Überschuss an unmarkiertem ATP in einer 1: 1 v / v-Verhältnis unter Verwendung einer Stopped-Flow-Fluorimeter (4A und 4B Inset). </li><li> Passen die Abnahme der auf eine einzelne Exponentialfunktion zuzüglich einer Linie konstanter negativer Steigung für Photobleaching der mant-Gruppe entfallen über die Zeit beobachtet Fluoreszenzintensität (dh Fluoreszenz = A 0 .exp (k obs .T) + (m.t + c), wobei A 0 ist die Amplitude, k obs die Geschwindigkeitskonstante und t die Zeit, siehe Abbildung 4B und Diskussion). Die k obs von dieser Passform bestimmt die Geschwindigkeitskonstante für die Dissoziation von ADP (Abbildung 1, K 4) mit Einheiten der s -1 (siehe Diskussion). </li></ol>

<ol>
	<li>Marx, A., Hoenger, A., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+kinesin+motor+proteins.">Structures of kinesin motor proteins.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66, 958-966 (2009).</li><li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport.">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).</li><li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+kinesin+ATP+turnover+to+translocation+and+microtubule+regulation:+one+engine,+many+machines.">Coupling of kinesin ATP turnover to translocation and microtubule regulation: one engine, many machines.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 377-383 (2012).</li><li>Yun, M., Zhang, X., Park, C. G., Park, H. W., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+pathway+for+activation+of+the+kinesin+motor+ATPase.">A structural pathway for activation of the kinesin motor ATPase.</a> EMBO J. 20, 2611-2618 (2001).</li><li>Hirose, K., Akimaru, E., Akiba, T., Endow, S. A., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+conformational+changes+in+a+kinesin+motor+catalyzed+by+interaction+with+microtubules.">Large conformational changes in a kinesin motor catalyzed by interaction with microtubules.</a> Mol. Cell. 23, 913-923 (2006).</li><li>Kikkawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switch-based+mechanism+of+kinesin+motors.">Switch-based mechanism of kinesin motors.</a> Nature. 411, 439-445 (2001).</li><li>Friel, C. T., Bagshaw, C. R., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+the+ATP+turnover+cycle+of+microtubule+motors.">Analysing the ATP turnover cycle of microtubule motors.</a> Methods Mol. Biol. 777, 177-192 (2011).</li><li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+analogues+at+a+glance.">ATP analogues at a glance.</a> J. Cell Sci. 114, 459-460 (2001).</li><li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin-13+MCAK+has+an+unconventional+ATPase+cycle+adapted+for+microtubule+depolymerization.">The kinesin-13 MCAK has an unconventional ATPase cycle adapted for microtubule depolymerization.</a> EMBO J. 30, 3928-3939 (2011).</li><li>Gilbert, S. P., Webb, M. R., Brune, M., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+processive+ATP+hydrolysis+by+kinesin.">Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin.</a> Nature. 373, 671-676 (1995).</li><li>Sadhu, A., Taylor, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+kinesin+ATPase.">A kinetic study of the kinesin ATPase.</a> J. Biol. Chem. 267, 11352-11359 (1992).</li><li>Woodward, S. K., Eccleston, J. F., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+interaction+of+2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP+with+myosin+subfragment+1+and+actomyosin+subfragment+1:+characterization+of+two+acto-S1-ADP+complexes.">Kinetics of the interaction of 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP with myosin subfragment 1 and actomyosin subfragment 1: characterization of two acto-S1-ADP complexes.</a> Biochemistry. 30, 422-430 (1991).</li><li>Hackney, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+ADP-stimulated+ADP+release+and+dissociation+of+tethered+kinesin+from+microtubules.+Implications+for+the+extent+of+processivity.">Pathway of ADP-stimulated ADP release and dissociation of tethered kinesin from microtubules. Implications for the extent of processivity.</a> Biochemistry. 41, 4437-4446 (2002).</li><li>Lockhart, A., Cross, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+motility+of+the+Eg5+microtubule+motor.">Kinetics and motility of the Eg5 microtubule motor.</a> Biochemistry. 35, 2365-2373 (1996).</li><li>Chen, C. J., Porche, K., Rayment, I., Gilbert, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATPase+pathway+that+drives+the+kinesin-14+Kar3Vik1+powerstroke.">The ATPase pathway that drives the kinesin-14 Kar3Vik1 powerstroke.</a> J. Biol. Chem. 287, 36673-36682 (2012).</li><li>Moyer, M. L., Gilbert, S. P., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+ATP+hydrolysis+by+monomeric+and+dimeric+kinesin.">Pathway of ATP hydrolysis by monomeric and dimeric kinesin.</a> Biochemistry. 37, 800-813 (1998).</li><li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase.">real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33, 8262-8271 (1994).</li><li>Goodrich, J. A., Kugel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Binding and Kinetics for Molecular Biologists. 4, 69-97 (2006).</li><li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+reconstituted+in+vitro+and+imaged+by+single-molecule+fluorescence+microscopy.">Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy.</a> Methods Cell Biol. 95, 221-245 (2010).</li><li>Olmsted, J. B., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+and+nucleotide+requirements+for+microtubule+polymerization+in+vitro.">Ionic and nucleotide requirements for microtubule polymerization in vitro.</a> Biochemistry. 14, 2996-3005 (1975).</li><li>Brinkley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules:+a+brief+historical+perspective.">Microtubules: a brief historical perspective.</a> J. Struct Biol. 118, 84-86 (1997).</li><li>Ostap, E. M., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+kinetic+characterization+of+the+Acanthamoeba+myosin-I+ATPase.">Biochemical kinetic characterization of the Acanthamoeba myosin-I ATPase.</a> J. Cell Biol. 132, 1053-1060 (1996).</li><li>Eccleston, J. F., Moore, K. J., Brownbridge, G. G., Webb, M. R., Lowe, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+approaches+to+the+study+of+the+p21ras+GTPase+mechanism.">Fluorescence approaches to the study of the p21ras GTPase mechanism.</a> Biochem. Soc. Trans. 19, 432-437 (1991).</li><li>Ahmadian, M. R., Wittinghofer, A., Herrmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+methods+in+the+study+of+small+GTP-binding+proteins.">Fluorescence methods in the study of small GTP-binding proteins.</a> Methods Mol. Biol. 189, 45-63 (2002).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Hier stellen wir Protokolle zur Beobachtung und Analyse der Kinetik der Übergänge zwischen den Zuständen für eine Nukleotid-Kinesin. Diese Protokolle nutzen die schnelle Vermischung Stopped-Flow-Methode in Verbindung mit fluoreszenzmarkierten Nukleotiden. Verfahren dieser Art haben ausgiebig genutzt worden Nukleotid-Bindungs ​​und Dissoziation für eine Vielzahl von Kinesinen 9-11,13-16 zu studieren. Die beschriebenen Beobachtung der Phosphatfreisetzung (Abbildung 1, Schritt 3) nicht erlauben Methoden. Jedoch kann Stopped-Flow-Fluoreszenz verwendet wird, um diesen Übergang unter Verwendung eines Phosphat Sensorprotein zu koppeln, die Produktion von Phosphat zu einem Fluoreszenzintensitätsänderung 17 zu beobachten. Die Methoden vorgestellt Verwendung Nukleotide mit kleinen Fluorophor methylanthraniloyl (mant) gekennzeichnet, die in der Regel zeigen eine Zunahme der Fluoreszenzintensität, wenn an Proteine ​​gebunden. Weiterhin mant Fluorophor konjugiert, wenn entweder die 2 &#39;oder 3&#39;-Position an der Ribose, hat oft eine geringe oder keine Wirkung auf die Bindung, Dissoziation oder Hydrolyse des Nukleotids 9-12. Mant-markierte Nukleotide sind leicht aus kommerziellen Quellen erhältlich (siehe Liste der Materialien) und Mischungen der 2 &#39;und 3&#39;-Konjugat, wie sie schnell wieder ins Gleichgewicht, wenn auf ein einziges Isomer 8 gereinigt ist. Mant-markierte Nukleotide sind ausgezeichnete Reportermolekülen, durch die die Kinetiken der Nukleotid-Bindung und Dissoziation beobachtet werden. Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden bedeutet, dass das Auslesen der beschriebenen Tests ist eine Echtzeit-Veränderung der Fluoreszenzintensität. Dies macht diese ideal für Assays Stopped-Flow-Fluoreszenz, die schnelle Vermischung der Reagenzien und Echtzeit-Beobachtung von Veränderungen in der Fluoreszenz mit der anschließenden Reaktion verbunden werden können. Die Kombination der Stopped-Flow als Mischtechnik und Fluoreszenz als Verfahren zur Detektion erzeugt ein System, das relativ Probe efreichend. Um beispielsweise die in Figur 3C gezeigten Daten erwerben erfordert 0,8 bis 1,0 mg gereinigtes Kinesin-13, MCAK, und die in 4B gezeigten Daten erwerben erfordert ~ 0,3 mg gereinigtes Kinesin-13, MCAK. Ein Nachteil der Verwendung von mant als Fluorophor ist, dass sie anfällig für Photobleichung ist. Dies kann getrennt von Kinesin Reaktionskinetik durch Mischen einer Lösung von mant-markierte Nukleotid mit Reaktionspuffer, in Abwesenheit von Kinesin in der Stopped-Flow zu beobachten. Eine langsame Abnahme der Fluoreszenzintensität beobachtet, wie die mant-Gruppe wird gebleicht. Über den Bereich der Zeitskalen in den beschriebenen Photobleaching der mant-Gruppe Protokolle verwendet wird, auch durch eine lineare Funktion beschrieben. Daher ist ein einfacher Weg, um Daten für Photobleaching zu korrigieren, um zu einer exponentiellen Funktion mit einer durch eine lineare Funktion (dh mt + c) eher als die gemeinsame Grundlinie flach, durch einen einzigen Parameter beschrieben beschriebenen Grundlinie passen. mantATP verbindlich Bei der Messung von Geschwindigkeitskonstanten für Assoziation und Dissoziation mantATP (Abschnitt 2) die ADP, die mit der Kinesin-Nukleotid-Bindungsstelle in der Abwesenheit von Mikrotubuli verbunden bleibt, müssen entfernt werden. Dies ermöglicht mantATP Assoziation und Dissoziation (Abbildung 1, Schritt 1) isoliert von ADP Dissoziation beobachtet werden. Um dies zu erreichen Kinesin mit mindestens einer 50-fachen Überschuß an EDTA mehr Nukleotid-Bindungsstellen (Schritt 2.1) inkubiert. Die EDTA-Mg 2 +-Ionen maskiert verursacht Mg 2 + aus der Nukleotid-Bindungstasche, die bei der Freisetzung von dem Nukleotid 11 Ergebnisse distanzieren. Deshalb, wenn die Durchführung Schritte 2,1-2,3, ist es wichtig, einen Puffer frei von Mg 2 + zu verwenden. Das Nukleotid-kostenlos-Kinesin-Protein-Puffer ausgetauscht, um sich sowohl aus freien Nukleotid und von EDTA zu trennen. Um diese Trennung, eine Wegwerfgravitationsströmungs ge volll Filtrationssäule ist ausreichend und ist einfach und schnell zu bedienen (siehe Liste der Materialien). Das Zusammenspiel von mantATP mit Nukleotid kostenlos Kinesin wird bei einer Reihe von mantATP Konzentrationen (Schritt 2.4) durchgeführt, um Entfaltung der Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten (Schritt 2.8) zu ermöglichen. Die Theorie hinter Experimente dieser Art ist auch in Bezug 18 beschrieben Bei der Durchführung dieser Experimente mit der niedrigsten Konzentration von mantATP beginnt. Dies beseitigt die Notwendigkeit für die Waschschritte zwischen verschiedenen Konzentrationen. Wird es wahrscheinlich notwendig sein, die Empfindlichkeit der Stopped-Flow-Fluorimeter einzustellen als die mantATP Konzentration erhöht wird. Die mantATP Konzentration muss immer mindestens 5-fachen Überschuß über die Konzentration der Kinesin-Nukleotid-Bindungsstellen auf Pseudo Bedingungen erster Ordnung aufrecht zu erhalten. Da jedoch die Konzentration von mantATP erhöht wird, die Signaländerung kann als Anteil der Nucleotidsequenz, die abnimmt Kinesin bindet überschwemmt zu werden. Therefore wird die Konzentration des Kinesin auch für jedes neue Konzentration mantATP erhöht, so dass die Konzentration des mantATP ist niemals mehr als 10-fachen molaren Überschuß über Nukleotid-Bindungsstellen (Schritt 2.6). mantADP Dissoziation Obwohl Assoziation und Dissoziation Geschwindigkeitskonstanten für mantADP kann durch das gleiche für mantATP (Abschnitt 2) beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Dissoziation von ADP aus einem Kinesin kann direkt durch Vorspannen der Nukleotid-Bindungsstelle mit mantADP (Schritte 3.1-3.3) Die mantADP.kinesin Komplex wird dann mit einem Überschuss von unmarkiertem ATP (Schritt 3.5) gemischt beobachtet werden. Der Überschuss unmarkierten ATP verhindert erneute Bindung von mantADP auf die Kinesin und ermöglicht die Spaltungsreaktion (Abbildung 1, K 4) isoliert von Verband der mantADP beobachtet werden, wodurch. In diesem Assay wird die Konzentration von unmarkiertem ATP mindestens einem 50-fachen molaren Überschuß von Nuk seinleotide Bindungsstellen. Die Theorie hinter diesem Test ist gut in Bezug 18 beschrieben Diese direkte Methode gibt einen genaueren Wert für die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante als die Hochrechnung auf das in Schritt 2.8 beschrieben y-Achse. Einbeziehung der Mikrotubuli Die beschriebenen Verfahren können auch verwendet werden, um die Kinetik der Nukleotid-Bindungs ​​und Dissoziation in Gegenwart von Mikrotubuli zu bestimmen. Mikrotubuli sind an das Nukleotid enthaltenden Spritze vor dem Mischen in der Stopped-Flow eingeführt: die untere Spritze in 3B und 4B (Einlagen). In dieser Konfiguration wird die Kinesin die Nukleotidsequenz gleichzeitig erfüllen, da sie die Mikrotubuli erfüllt. Mikrotubuli stabilisiert werden verwendet, wo die Lebensdauer des Tubulin-Polymer durch die Verwendung entweder einer chemischen Stabilisierung, verlängert, wie Taxol oder einem nicht hydrolysierbaren GTP-Analogon, wie Guanosin-5 &#39;- [(α, β) -methyleno] Triphosphat (GMPCPP, siehe Liste der Materialien). Es ist möglich, zwei Zyklen der Tubulin-Polymerisation mit GMPCPP verwenden, um Mikrotubuli, für viele Monate in flüssigem Stickstoff gelagert werden 9,19 tätigen. Die Verwendung von vorgefertigten Mikrotubuli reduziert deutlich die praktischen Schwierigkeiten bei der Durchführung dieser Tests. Mikrotubuli in den Assays schließen, ist es wichtig, einen Reaktionspuffer für die Mikrotubuli Stabilität zu verwenden. Der Puffer der Wahl ist PIPES basiert, mit dem am häufigsten verwendeten Puffer, der 80 mM PIPES pH 6,9, 1 mM MgCl 2 und 1 mM EGTA (als BRB80 bekannt) 20,21. Die beschriebenen Verfahren sind nicht darauf beschränkt, mit Kinesin, sondern kann angepasst und einem Nukleotid-Bindungsprotein verwendet werden. Zum Beispiel wurden ähnliche Verfahren wie die ATP Umsatz Zyklus von Mitgliedern der Familie von Myosin molekularen Motoren 12,22 und die Verwendung von markierten mant Guanosinnukleotiden erstreckt sich weiter angewendetVerfahren dieser Art GTP hydrolysierende Proteine ​​23,24.

Die Kinesin-Superfamilie sind für Proteine, die durch eine stark konservierte Motordomäne 1. Die Kinesin Motordomäne in Wechselwirkung mit Mikrotubuli in einer Nukleotid-abhängige Weise. Mitglieder der Kinesin-Familie zeigen eine Reihe von Funktionen aus translozierenden Kinesinen, die Fracht in einem gerichteten Art und Weise entlang von Mikrotubuli zu tragen, nicht-Translokation Mikrotubuli-bindenden Ende Kinesinen, die die Dynamik der Mikrotubuli 2,3 regulieren. Kinesinen verwenden Sie den Umsatz von adensosine-5&#39;-Triphosphat (ATP), um ihre Interaktion mit dem Mikrotubuli-Zytoskelett 4-6 regulieren. Die Konformation des Kinesin-Motordomäne und somit seine Affinität für Mikrotubuli hängt von ihrer Nukleotid Zustand: ATP, ADP kann, ADP.Pi oder keine Nucleotid gebunden werden (Abbildung 1). Den molekularen Mechanismus eines Kinesin verstehen, ist ein Verständnis der Beziehung zwischen der ATP-Umsatz und die Mikrotubuli-Wechselwirkung erforderlich sind. DieDaher liegt ein Hauptziel in der Kinesin-Feld, um die funktionellen Eigenschaften der verschiedenen Nukleotid Zustände und die Kinetik der Übergänge zwischen diesen beiden in der Gegenwart und Abwesenheit von Mikrotubuli zu charakterisieren. <img alt="Figur 1" fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Die einfachste ATP Umsatz Zyklus für eine Kinesin besteht aus vier möglichen Zuständen: Nukleotid-freie (Φ), ATP-gebundenen ADP.P i -gebundenen und ADP-gebundenen Jeder der vier Übergänge von einem vorderen und charakterisiert. Rückwärtsgeschwindigkeitskonstante (k x und k x beziehungsweise). Um zu verstehen, wie sich die chemische Zyklus der ATP Umsatz der mechanischen Kreislauf der Mikrotubuli-Interaktion gekoppelt, muss man die Stufe in der ATP-Umsatz Zyklus zu bestimmen, ist Ratenbegrenzung in der Abwesenheit von microtubModule und dann bestimmen, wie der Zyklus wird durch die Anwesenheit von Mikrotubuli verändert. Die einfachste ATP Umsatz-Zyklus besteht aus vier einzelnen Chemikalien Schritten: (1) ATP-Bindung an die leere Stelle (Φ bezeichnet das leere Seite, dh, Nukleotid-freien Kinesin); (2) ATP-Spaltung; (3) phosphat Dissoziation und (4) ADP-Dissoziation (Abbildung 1). Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt setzt die Geschwindigkeitskonstante für die komplette ATP Umsatz-Zyklus. Deshalb, um zu bestimmen, welche geschwindigkeitsbestimmende Schritt jedes der einzelnen Übergänge müssen gemessen und verglichen, um die Geschwindigkeitskonstante für den gesamten Zyklus ist. Methoden, um die Gesamt ATP Umsatz Taktrate konstant werden hier nicht beschrieben zu messen, kann aber in Bezug 7. hier gefunden werden, beschreiben wir Methoden, mit denen Geschwindigkeitskonstanten für einzelne chemische Schritte bestimmt werden kann. Es gibt eine Reihe von Verfahren zur Verfügung, um individuelle Übergänge in dem Umschlagszyklus eines Nukleotids hydrolysierende Protein zu untersuchen. Die hier vorgestellten Methoden nehmen Advantage der Eigenschaften der Nucleotide mit dem Fluorophor markierten methylanthraniloyl, die üblicherweise als mant, die eine Änderung in der Fluoreszenzintensität nach der Bindung an Protein 8 Anzeige bezeichnet. Mant der Gruppe verwendet wird, da seine geringe Größe bedeutet, dass, wenn sie auf die Ribose (2A) gekoppelt ist, hat es im allgemeinen wenig oder keine Wirkung auf die Kinetik der Nukleotid-Bindungs ​​oder Hydrolyse 9-12. Hier stellen wir Protokolle beschreiben die Verwendung von mant-markierten Nukleotiden in Verbindung mit der Stopped-Flow-Fluoreszenz, um die Beobachtung der Bindung und Dissoziation Nukleotidsequenz der ATP-Umsatz Zyklus eines Kinesin ermöglichen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="781">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:279px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">2&#8217;/3&#8217;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&#8217;triphosphate&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-202</td>
			<td style="width:279px;">mantATP</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">2&#8217;/3&#8217;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&#8217;-diphosphate&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-201</td>
			<td style="width:279px;">mantADP</td>
		</tr>
		<tr height="134">
			<td height="134" style="height:134px;width:220px;">Mg-ATP</td>
			<td style="width:147px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;"># 10519979001</td>
			<td style="width:279px;">The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100&#160;mM in 100&#160;mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260&#160;nm (e = 15400&#160;M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20&#160;oC.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP120-500</td>
			<td style="width:279px;">0.5&#160;M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled.</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:220px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:147px;">Melford</td>
			<td style="width:136px;">MB1015</td>
			<td style="width:279px;">1&#160;M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">NAP-5 column</td>
			<td style="width:147px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;"># 17-0853</td>
			<td style="width:279px;">G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:220px;">GMPCPP</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-405</td>
			<td style="width:279px;">nonhydrolysable analogue of GTP</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:220px;">Stopped-flow fluorimeter&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Applied Photophysics</td>
			<td style="width:136px;">SX20</td>
			<td style="width:279px;">A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1&#160;-&#160;100&#160;s to be monitored.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the atp turnover cycle of kinesins

Die Kinesin-Superfamilie der Mikrotubuli-assoziierten Motorproteine ​​teilen einen charakteristischen Motordomäne, die sowohl hydrolysiert ATP und bindet Mikrotubuli. Kinesinen anzuzeigen Unterschiede innerhalb der Superfamilie sowohl in Umsatz und ATP in Mikrotubuli-Interaktion. Diese Unterschiede anpassen spezifischen Kinesinen, um verschiedene Funktionen wie Luftfrachtbeförderung, Mikrotubuli-Gleiten, Mikrotubuli-Depolymerisation und Stabilisierung von Mikrotubuli. Um den Mechanismus der Wirkung eines Kinesin verstehen, ist es wichtig zu verstehen, wie der chemischen Zyklus der ATP Umsatz der mechanischen Zyklus der Mikrotubuli-Wechselwirkung gekoppelt. Um den ATP Umsatz-Zyklus zu sezieren, ist ein Ansatz, um fluoreszenzmarkierte Nukleotide zu nutzen, um einzelne Schritte des Zyklus zu visualisieren. Bestimmung der Kinetik der Übergang jedes Nukleotid in der ATP-Umsatz Zyklus ermöglicht die geschwindigkeitsbestimmende Schritt oder Schritte zur vollständigen Zyklus zu identifizieren. Für Kinesin, ist es wichtig, den geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt zu kennen,die Abwesenheit von Mikrotubuli, da dieser Schritt im allgemeinen beschleunigt mehrere Tausendfache, wenn das Kinesin Wechselwirkung mit Mikrotubuli. Der Zyklus in Abwesenheit von Mikrotubuli wird dann zu der in Gegenwart von Mikrotubuli zu einer Kinesin ATP Umsatz Zyklus verstehen verglichen. Die Kinetik der einzelnen Nucleotid-Übergänge sind in der Regel zu hoch, um durch manuelles Mischen von Reaktanten, insbesondere in Anwesenheit von Mikrotubuli zu beobachten. Eine schnelle Mischvorrichtung, wie einer Stopped-Flow-Fluorimeter, die Kinetik auf Zeitskalen von nur wenigen Millisekunden beobachtet werden kann, kann verwendet werden, um solche Übergänge zu beobachten. Hier beschreiben wir Protokolle, in denen eine schnelle Vermischung der Reagenzien durch stopped-flow in Verbindung mit Fluoreszenz-markierten Nukleotiden verwendet werden, um die ATP-Umsatz Zyklus eines Kinesin sezieren.

Ein Anstieg der Fluoreszenzintensität des mant Gruppe wird typischerweise bei Bindung mant-markierten Nukleotids zu einer Kinesin beobachtet. Jedoch ist das Ausmaß einer solchen Signaländerung abhängig von der jeweiligen Kinesin in Frage. Daher ist es sinnvoll, Gleichgewichtsmessungen durchzuführen, um sowohl das Vorhandensein und das Ausmaß einer Änderung der Fluoreszenzintensität vor voran kinetische Assays bestätigen. Repräsentative Fluoreszenzspektren für mantATP und mantADP, sowohl in Lösung als auch im Komplex mit der Kinesin-13, MCAK, sind in 2B gezeigt. Diese Daten unterstreichen die Fluoreszenzintensität Anstieg sowohl mantATP und mantADP bei der Bindung an MCAK angezeigt. Die Veränderung der Fluoreszenzintensität bei der Bindung von mant Nukleotid zu einem Kinesin wird verwendet, um über die Assoziation und Dissoziation von ATP und ADP-Bericht (Abschnitte 2 und 3). Im Fall von MCAK wird ein Fluoreszenzintensitätsdifferenz zwischen mantATP.kinesin und mantADP.kinesin beobachtet <sup&gt; 9. 3A zeigt die Reaktion, die beim Mischen mit mantATP Nukleotid-freien Kinesin auftritt. Repräsentative Daten, die die Erhöhung der Fluoreszenzintensität, die bei der Bindung an die mantATP Kinesin-13 auftritt, wird MCAK in 3B gezeigt. Daten des Typs in 3B gezeigt wird in einem Bereich von Konzentrationen mantATP gesammelt. Ein Plot der Geschwindigkeitskonstanten (k obs) ermittelt gegen die mantATP Konzentration ist in 3C gezeigt. Montage dieser Daten an eine lineare Funktion (dh k obs = k 1 [mantATP] + k-1) können Dekonvolution der Geschwindigkeitskonstanten, die obs (Schritt 2.8) k beitragen. Deshalb, so dass die Bestimmung sowohl des Vereins und der Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante für mantATP (Abbildung 1, K 1 und K <em&gt; -1 beziehungsweise). 4A zeigt die Reaktion, die beim Mischen mantADP.kinesin mit einem Überschuß von unmarkiertem ATP stattfindet. Die Daten in Abbildung 4B zeigt die für mantADP bei der Dissoziation von Kinesin-13, MCAK beobachtete Abnahme der Fluoreszenzintensität. Durch den Einbau dieser Daten an einer e-Funktion (Schritt 3.6) die Geschwindigkeitskonstante für die Dissoziation von mantADP direkt bestimmt wird. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Die Nukleotide mit dem Fluorophor methylanthraniloyl (mant) markiert werden verwendet, um einzelne Schritte in der ATP-Umsatz-Zyklus zu isolieren. (A) Struktur des mantATP, die die Position des Fluorophors mant entweder die 2 &#39;oder 3&#39; Position der Ribose gebunden ist. (B) Normalisierte Fluoreszenzspektren für mantATP und mantADP in Lösung (MaxP) und eine mantATPd mantADP im Komplex mit dem Kinesin MCAK (MATP + MCAK und MADP + MCAK). Die mantATP Spektren normiert auf die Fluoreszenz bei max für mantATP in Lösung und der mantADP Spektren normiert auf max für mantADP in Lösung Fluoreszenz. Die Spektren der mant Nukleotide mit MCAK vermischt werden zu 1 min nach dem Mischen gesammelt. Die Konzentration von Reagenzien und Fluorimeter Einstellungen werden als in Protokoll beschriebenen Schritte 1.1 und 1.2. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Die Messung der Assoziationsgeschwindigkeitskonstante von mantATP. (A) Schematische Darstellung der Reaktion, die Stelle nach Mischen durch Stopped-Flow nimmt: mantATP (MATP) bindet an Nukleotid-freien Kinesin. Die Fluoreszenzintensität bei der Bindung an das Protein die mant-Gruppe steigt. (B) Fluoreszenzsignaländerung (schwarz) beim Mischen mantATP (25 M) mit MCAK (5 M nu beobachtettid-frei,). Diese Daten sind fit (rot gestrichelt) auf eine einzige Exponentialfunktion zuzüglich einer Linie konstanter negativer Steigung, die für die Photobleaching der mant Fluorophor-Konten (siehe Diskussion). Einschub: Inhalt der Spritzen vor dem Mischen auf der Stopped-Flow-Fluorimeter. (C) Geschwindigkeitskonstanten (k obs) für die Reaktion von mantATP mit Nukleotid-freien MCAK bestimmt aufgetragen gegen die Konzentration von mantATP. Dieses Grundstück wird eine lineare Region mit der Gradient der Assoziationsgeschwindigkeitskonstante (Abbildung 1, K 1) mit Einheiten der M -1 s -1 und die y-Achse als die Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (Abbildung 1, k -1) haben Einheiten von s -1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> . Abbildung 4. Messung der Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante für mantADP (A) Schematische Darstellung der Reaktion, die Stelle nach Mischen durch Stopped-Flow nimmt: Kinesin mit mantADP vorgespannt ist in einen Überschuss von unmarkiertem ATP verdünnt. Distanziert mantADP durch unmarkierte ATP ersetzt, wodurch die Rückreaktion von mantADP Verein (siehe Diskussion) zu verhindern. Die Intensität der Fluoreszenz des mant-Gruppe nimmt bei der Dissoziation aus dem Protein. Nach der Dissoziation von mantADP vom Kinesin MCAK beobachtet (B) Fluoreszenzabnahme. Das Fluoreszenzsignal (schwarz) ist fit (rot gestrichelt) zu einem einzigen exponentiellen zuzüglich einer Linie konstanter negativer Steigung für Photobleaching der mant-Gruppe (siehe Diskussion) zu berücksichtigen. Die Geschwindigkeitskonstante bestimmt ist, die Geschwindigkeitskonstante für die Dissoziation mantADP (1, k4). Einschub:. Inhalt der Spritzen vor dem Mischen auf einem Stopped-Flow-Fluorimeter <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins at JoVE.com

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

Kinesine von Nukleotid-abhängige Wechselwirkung mit Mikrotubuli aus: ein Zyklus von ATP Umsatz zu einem Zyklus von Mikrotubuli-Wechselwirkung gekoppelt. Hier beschreiben wir Protokolle, die Kinetik der einzelnen Nukleotid-Übergänge in der ATP-Umsatz Zyklus eines Kinesin mit fluoreszenzmarkierten Nukleotiden und Stopped-Flow-Fluoreszenz analysiert.

Verwendung von Stopped-Flow-Fluoreszenz und markierte Nukleotide ATP, um die Umsatz-Zyklus von Kinesine Analysieren

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

use-stopped-flow-fluorescence-labeled-nucleotides-to-analyze-atp

Research

JoVE Journal

Chemistry

15.4K Aufrufe.  University of Nottingham.  Kinesine von Nukleotid-abhängige Wechselwirkung mit Mikrotubuli aus: ein Zyklus von ATP Umsatz zu einem Zyklus von Mikrotubuli-Wechselwirkung gekoppelt. Hier beschreiben wir Protokolle, die Kinetik der einzelnen Nukleotid-Übergänge in der ATP-Umsatz Zyklus eines Kinesin mit fluoreszenzmarkierten Nukleotiden und Stopped-Flow-Fluoreszenz analysiert. 

Serie: Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of molecular iodine to samarium metal in THF.1,2-3 It is a mild and selective single electron reductant and its versatility is a result of its ability to initiate a wide range of reductions including C-C bond-forming and cascade or sequential reactions. SmI2 can reduce a variety of functional groups including sulfoxides and sulfones, phosphine oxides, epoxides, alkyl and aryl halides, carbonyls, and conjugated double bonds.2-12 One of the fascinating features of SmI-2-mediated reactions is the ability to manipulate the outcome of reactions through the selective use of cosolvents or additives. In most instances, additives are essential in controlling the rate of reduction and the chemo- or stereoselectivity of reactions.13-14 Additives commonly utilized to fine tune the reactivity of SmI2 can be classified into three major groups: (1) Lewis bases (HMPA, other electron-donor ligands, chelating ethers, etc.), (2) proton sources (alcohols, water etc.), and (3) inorganic additives (Ni(acac)2, FeCl3, etc).3
Understanding the mechanism of SmI2 reactions and the role of the additives enables utilization of the full potential of the reagent in organic synthesis. The Sm-Barbier reaction is chosen to illustrate the synthetic importance and mechanistic role of two common additives: HMPA and Ni(II) in this reaction. The Sm-Barbier reaction is similar to the traditional Grignard reaction with the only difference being that the alkyl halide, carbonyl, and Sm reductant are mixed simultaneously in one pot.1,15 Examples of Sm-mediated Barbier reactions with a range of coupling partners have been reported,1,3,7,10,12 and have been utilized in key steps of the synthesis of large natural products.16,17 Previous studies on the effect of additives on SmI2 reactions have shown that HMPA enhances the reduction potential of SmI2 by coordinating to the samarium metal center, producing a more powerful,13-14,18 sterically encumbered reductant19-21 and in some cases playing an integral role in post electron-transfer steps facilitating subsequent bond-forming events.22 In the Sm-Barbier reaction, HMPA has been shown to additionally activate the alkyl halide by forming a complex in a pre-equilibrium step.23
Ni(II) salts are a catalytic additive used frequently in Sm-mediated transformations.24-27 Though critical for success, the mechanistic role of Ni(II) was not known in these reactions. Recently it has been shown that SmI2 reduces Ni(II) to Ni(0), and the reaction is then carried out through organometallic Ni(0) chemistry.28
These mechanistic studies highlight that although the same Barbier product is obtained, the use of different additives in the SmI2 reaction drastically alters the mechanistic pathway of the reaction. The protocol for running these SmI2-initiated reactions is described.

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

A straightforward procedure for the preparation of samarium diiodide (SmI2) in THF is described. The role of two main additives namely hexamethylphosphoramide (HMPA) and Ni(acac)2 in Sm mediated reactions is demonstrated in the Sm-Barbier reaction.

Herstellung und Verwendung von Samariumdiiodid (SmI<sub&gt; 2</sub&gt;) In der organischen Synthese: die mechanistische Rolle von HMPA und Ni (II)-Salzen in Samarium Barbier Reaction

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

Forschung

Chemie

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

Steady-State-, Pre-Steady-State-und Einzel-Umsatz Kinetic Measurement für DNA Glycosylase Aktivität

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice through their ice-binding surfaces. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modified technique used to determine the ice planes to which the AFPs bind. FIPA is based on the original ice-etching method for determining AFP-bound ice-planes. It produces clearer images in a shortened experimental time. In FIPA analysis, AFPs are fluorescently labeled with a chimeric tag or a covalent dye then slowly incorporated into a macroscopic single ice crystal, which has been preformed into a hemisphere and oriented to determine the a- and c-axes. The AFP-bound ice hemisphere is imaged under UV light to visualize AFP-bound planes using filters to block out nonspecific light. Fluorescent labeling of the AFPs allows real-time monitoring of AFP adsorption into ice. The labels have been found not to influence the planes to which AFPs bind. FIPA analysis also introduces the option to bind more than one differently tagged AFP on the same single ice crystal to help differentiate their binding planes. These applications of FIPA are helping to advance our understanding of how AFPs bind to ice to halt its growth and why many AFP-producing organisms express multiple AFP isoforms.

Antifreeze proteins (AFPs) bind to specific planes of ice to prevent or slow ice growth. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modification of the original ice-etching method for determination of AFP-bound ice planes. AFPs are fluorescently labeled, incorporated into macroscopic single ice crystals, and visualized under UV light.

Bestimmung der eisbindenden Ebenen von Frostschutzproteinen durch Fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, yielding results with high accuracy and high reproducibility. In metabolic and nutrition studies GC allows assessment of changes in fatty acid concentrations following interventions or during changes in physiological state such as pregnancy. Solid phase extraction (SPE) using aminopropyl silica cartridges allows separation of the major lipid classes including triacylglycerols, different phospholipids, and cholesteryl esters (CE). GC combined with SPE was used to analyze the changes in fatty acid composition of the CE fraction in the livers of virgin and pregnant rats that had been fed various high and low fat diets. There are significant diet/pregnancy interaction effects upon the omega-3 and omega-6 fatty acid content of liver CE, indicating that pregnant females have a different response to dietary manipulation than is seen among virgin females.

Pregnancy leads to significant changes to the fatty acid composition of maternal tissues. Lipid profiles can be obtained via gas chromatography to allow identification and quantification of fatty acids in individual lipid classes among rats fed various high and low fat diets during pregnancy.

Der Einsatz von Gas-Chromatographie zu Änderungen der Zusammensetzung der Fettsäuren in Rattenlebergewebe während der Schwangerschaft Analysieren

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Fluoreszenz-basierte Überwachung von PAD4 Aktivität über eine Pro-Fluoreszenz Substratanalogon

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

Preparation and Use of Carbonyl-decorated Carbenes in the Activation of White Phosphorus

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures in multi-gram scale quantities. The goal of this manuscript is to clearly detail how to handle and prepare these unique carbenes such that a synthetic chemist of any skill level can work with them. The two carbenes described are a diamidocarbene (DAC, carbene 1) and a monoamidoaminocarbene (MAAC 2). These carbenes are highly electron-deficient and as such display reactivity profiles that are atypical of more traditional N-heterocyclic carbenes. Additionally, these two carbenes only differ in their electrophilic character and not their steric parameters, making them ideal for studying how carbene electronics influence reactivity. To demonstrate this phenomenon, we are also describing the activation of white phosphorus (P4) using these carbenes. Depending on the carbene used, two very different phosphorus-containing compounds can be isolated. When the DAC 1 is used, a tris(phosphaalkenyl)phosphane can be isolated as the exclusive product. Remarkably however, when MAAC 2 is added to P4 under identical reaction conditions, an unexpected carbene-supported P8&#160;allotrope of phosphorus is isolated exclusively. Mechanistic studies demonstrate that this carbene-supported P8allotrope forms via a [2+2] cycloaddition dimerization of a transient diphosphene which has been trapped by treatment with 2,3-dimethyl-1,3-butadiene.

Here, we present a protocol for the synthesis of two carbonyl-decorated carbenes. The protocol makes these interesting compounds readily available to chemists of all skill levels. In addition to the synthesis of these two carbenes, their use in the activation of white phosphorus is also described.

Herstellung und Verwendung von Carbonyl-dekoriert Carbene bei der Aktivierung von weißem Phosphor

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures ...

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET radiopharmaceuticals. Due to their multi-day biological half-life, antibodies must be labeled with positron-emitting radionuclides with relatively long physical decay half-lives. Traditionally, the positron-emitting isotopes 124I (t1/2 = 4.18 d), 86Y (t1/2 = 14.7 hr), and 64Cu (t1/2 = 12.7 hr) have been used to label antibodies for PET imaging. More recently, however, the field has witnessed a dramatic increase in the use of the positron-emitting radiometal 89Zr in antibody-based PET imaging agents. 89Zr is a nearly ideal radioisotope for PET imaging with immunoconjugates, as it possesses a physical half-life (t1/2 = 78.4 hr) that is compatible with the in vivo pharmacokinetics of antibodies and emits a relatively low energy positron that produces high resolution images. Furthermore, antibodies can be straightforwardly labeled with 89Zr using the siderophore-derived chelator desferrioxamine (DFO). In this protocol, the prostate-specific membrane antigen targeting antibody J591 will be used as a model system to illustrate (1) the bioconjugation of the bifunctional chelator DFO-isothiocyanate to an antibody, (2) the radiosynthesis and purification of a 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate, and (3) in vivo PET imaging with an 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate in a murine model of cancer.

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

Die Biokonjugation und Radiosynthese<sup&gt; 89</sup&gt; Zr-DFO-markiertem Antikörper

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass spectrometer, it is necessary to characterize and understand the physical principles of the source. Most commercial ambient ionization sources utilize jets of nitrogen, helium, or atmospheric air to facilitate the ionization of the analyte. As a consequence, schlieren photography can be used to visualize the gas streams by exploiting the differences in refractive index between the streams and ambient air for visualization in real time. The basic setup requires a camera, mirror, flashlight, and razor blade. When properly configured, a real time image of the source is observed by watching its reflection. This allows for insight into the mechanism of action in the source, and pathways to its optimization can be elucidated. Light is shed on an otherwise invisible situation.

This paper presents a protocol for the visualization of gaseous streams of an ambient ionization source using schlieren photography and mass spectrometry.

Visualisierung von Ambient-Massenspektrometrie mit der Verwendung von Schlieren Fotografie

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

Ein optimiertes Protokoll für die effiziente radioaktive Markierung von Gold-Nanopartikeln durch eine Verwendung von<sup&gt; 125</sup&gt; I-markiertem Azide prosthetische Gruppe

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Herstellung und Auswertung der<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-markierte Dreizähnige Chelate für Pre-Targeting Bioorthogonale Chemie

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...