In-vivo-Bildgebung wurde mit dem IVIS Shared Resource an der University of Colorado Cancer Center (durch Gewährung P30-CA046934 unterstützt). Durchflusszytometrie wurde in der Durchflusszytometrie Shared Resource, University of Colorado Cancer Center (durch Gewährung P30CA046934 unterstützt) durchgeführt. Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health (RO1CA137078 DKG) unterstützt. ABLS ist ein Fellow des Pediatric Scientist Entwicklungsprogramm, durch Zuschüsse von der American Academy of Pediatrics, der American Pediatric Society und der Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (K12-HD000850) unterstützt.

Alle Experimente mit Tieren folgten die von der Universität von Colorado Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt regulatorischen Standards. Die nachgewiesene Protokoll wurde von der University of Colorado Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Phospho-Protein-Western Blot <ol><li> Herstellung von Lysaten <ol><li> Kulturzelllinien, die den Rezeptor-Tyrosin-Kinase von Interesse exprimieren. Ernten der Zellen und die Platte 3-5 x 10 6 Zellen / Probe in 400 &amp;mgr; l Wachstumsmedium in einer 48-Well-Gewebekulturschale. Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO 2 für 2-3 Stunden. </li><li> 100 l 5x TKI Lösung in Wachstumsmedium und Inkubation für 60 min. </li><li> Vorbereitung Lysepuffer mit 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10% (v / v) Glycerin, 1% (v / v) Triton X-100 und Protease-Inhibitoren. Wenn Kulturen wird nicht mit Pervanadat vor der Ernte behandelt werden, fügen Phosphatase-Inhibitoren (1 mM Natrium orthovanadate und 0,1 mM Natriummolybdat) mit Lysepuffer. </li><li> Bereiten Pervanadat (PV)-Phosphatase-Inhibitor-Lösung unmittelbar vor Gebrauch. Vorbereitung einer 0,3% igen Lösung von Wasserstoffperoxid (VORSICHT) in kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einem dunklen Röhrchen auf Eis (1:100 Verdünnung einer 30% Stammlösung). Kochen Sie ein Aliquot von 0,2 M Natriumorthovanadat (OV, VORSICHT) stock-Lösung für 5 min. 1:10 verdünnt in PBS auf 20 mM OV Lösung bei Raumtemperatur (RT) zu machen. Mischungs 0,3% Wasserstoffperoxid und 20 mM OV 1:1 und Inkubieren im Dunkeln bei RT für 20 min. </li><li> Verdünnen PV in Vollmedium (60 ul PV + 940 ul Medium). 100 l verdünnt PV / gut. Bei 37 ° C in 5% CO 2 für 3 min und dann legen Platte auf Eis. </li><li> Ernte der Zellen in kaltem Mikrozentrifugenröhrchen bei 2500 rpm für 5 min. Absaugen des Überstandes und resuspendieren Zellen in 120 ul Lysepuffer. Inkubieren auf Eis für 15 min. Klären Sie das Lysat in einem kalten Mikrozentrifuge bei 6.000 rpm für 3 min. Übertragen supernatant zu einem frischen kalten Röhre. Bei -80 ° C </li></ol></li><li> Immunpräzipitation <ol><li> Spin down Protein G Sepharose-Kügelchen in Mikrozentrifuge bei 1.000 rpm für 1 min. Überstand entfernen und waschen Perlen 2x mit 1 ml kaltem PBS. Hinzufügen eines gleichen Volumens an PBS, um eine 50% ige Aufschlämmung zu machen. In primären Antikörper und 20 ul 50% Protein G-Kügelchen zu jeder Probe. Inkubation für 2 Stunden - O / N bei 4 ° C auf einem Rotator. </li><li> Impuls nach unten Perlen in einem kalten Mikrozentrifuge bei 9.000 Umdrehungen pro Minute. Überstand entfernen und waschen Perlen 2x mit 150 ul kaltem Lysepuffer. Spin in kalten Mikrozentrifuge bei 1.000 Upm für 1 min. Überstand entfernen und Pellet erneut in 20 ul 2X SDS Probenpuffer mit 2-Mercaptoethanol (VORSICHT). Verwenden Sie sofort oder bei -80 ° C </li><li> Kochen Sie die Proben für 5 min und laufen auf einem SDS-PAGE-Tris-Glycin-Gel. Übertragen Sie die Proteine ​​auf eine Nitrocellulose-Membran und erkennen Phospho-Protein durch Western-Blot. </li><li> Spülen Blot mit Wasser und dann inkubieren in 2% SDS, 62,5 mM Tris (pH 6,8), 0.1 M β-Mercaptoethanol (VORSICHT) für 30 min bei 50 ° C. 2x Spülen mit Wasser und dann für 60-90 min waschen in 5-6 Änderungen der TBS-T-Lösung zu entfernen Strippen. </li><li> Erkennen Gesamt-Protein durch Western-Blot. </li></ol></li></ol> 2. Methylcellulose-Assay <ol><li> Aliquot 4 ml Methylcellulose menschlichen Basismedium in 50 ml konische Röhrchen mit einem sterilen große Bohrung stumpfen Ende Nadel. (Hinweis:. Methylcellulose kann aliquotiert und bei -20 ° C gelagert werden Tauwetter bei RT O / N vor der Verwendung) </li><li> Gib 500 ul 10x-TKI oder ein Fahrzeug in einem Wachstumsmedium zu 4 ml Methylcellulose und Wirbelmischung für 10 sek. </li><li> Ernte-und Zählerzellen. Vorbereitung einer Zellsuspension in Wachstumsmedium in einer Konzentration, die 10-fach höher als die endgültige Zellkonzentration ist. In 500 ul Zellsuspension auf Methylcellulose-Mischung. Vortex für 10 Sekunden und lassen Sie sich für 10 Minuten, um Luftblasen zu entfernen. </li><li> Zeichnen bis 4 ml Methylcellulose Mischung mit einer 5-ml-Spritze und sterile größe Bohrung stumpfen Ende Nadel. Vermeiden Sie die Erstellung Blasen. Verzichtet werden 1 ml der Methylcellulose-Gemisch in der Mitte von drei 35 mm-Gewebekulturplatten. Schwenken Sie die Gerichte, bis der Boden vollständig mit Methylcellulose bedeckt. </li><li> Für jede Platte Methylcellulose, bereiten ein 10 cm sterile Gewebekulturplatte mit zwei zusätzlichen 35-mm-Gewebekulturplatten mit sterilem Wasser gefüllt, um eine feuchte Umgebung zu gewährleisten. Ort Kulturen mit Wassermantel bei 37 º C in 5% CO 2 für 10-14 Tage. </li><li> Graf Kolonien nach 1-2 Wochen. Kolonien mehr als 20 Zellen und nicht überlappend sein. Kolonien können mit einem inversen Mikroskop mit einem Mikroskoptisch ausgestattet mit einem Gitter oder mit Hilfe eines automatisierten Kolonie gezählt werden. Änderungen der Kolonie-Morphologie oder in Reaktion auf die Behandlung mit TKI auch ausgewertet werden. Um der Entdeckung durch Koloniezähler, Fleck Kolonien verbessern, indem 60-100 ul (3 - (4,5-Dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-Diphenyl-2H-tetrazoliumbromid Solution (MTT, 5 mg / ml in H 2 O, Lagerung bei -20 ° C, vor Licht schützen, VORSICHT) tropfenweise über die Oberfläche jeder Platte und Inkubation für 8 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2. </li></ol> 3. Soft-Agar-Assay <ol><li> Bereiten 1% Agar für edle Bodenschicht, 0,7% Agar für edle Deckschicht und 2x Wachstumsmedium. Ins Gleichgewicht 2x Wachstumsmedium in einem 42 ° C Wasserbad. Heat 1% und 0,7% Agar edel in der Mikrowelle (ca. 1 min/100 ml) und ins Gleichgewicht in einem 42 ° C Wasserbad. Mix gleichen Teilen von 1% Agar und 2x mittel-und separat 0,7% Agar und 2x 50 ml Medium in Schrägen. Plan 10 ml Soft-Agar-Mischung / sechs-Well-Platte für jede Schicht. </li><li> Label 6-Well-Gewebekulturplatten. Füllen Sie jedes Well mit 1,5 ml 1% Soft-Agar-Mischung. Vermeiden Sie während der Beschichtung Blasen. Dry Platten mit Deckel weg in sterile Haube für 30 min. </li><li> Zählen von Zellen. Vorbereitung einer Zellsuspension in Wachstumsmedium in einer Konzentration, die 500-fache höher als die letzte Zelle ist concentratiauf. In Zellsuspension auf 0,7% Agar-Mischung, gut mischen und dosieren 1,5 ml des Agar Zellgemisch auf der Oberseite der 1%-Agar-Schicht. Lassen Sie die obere Schicht erstarren für 30 min. </li><li> Bereiten 1x Wachstumsmedium TKI-oder Fahrzeugsteuer enthält. 2 ml Medium mit der gewünschten Konzentration von TKI auf dem Top-Agar-Schicht. </li><li> Kulturen für 10 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2. Entfernen und die Überlagerung Medium ersetzen alle 3 Tage. </li><li> Wenn Kolonien mit bloßem Auge überlagert Medium absaugen und mit 200 ul Nitro-Tetrazolium-Blau-Lösung (1 mg / ml NBT in H 2 O, Lagerung bei 4 ° C, vor Licht schützen, VORSICHT). Zurück zum Inkubator für 24-48 Std. Bewegen, um 4 ° C für mindestens 2 Stunden vor dem Zählen. Gefärbten Platten können bei 4 º C für einen Monat gelagert werden. Graf Kolonien mit einem Mikroskop oder einem automatisierten Koloniezähler. </li></ol> 4. Auswertung der Phospho-Protein-Hemmung in vivo <ol><li> Sammeln cEllen wächst in der log-Phase durch Zentrifugation in einer Tischzentrifuge bei 1500 Upm für 5 min. Waschen der Zellen einmal mit sterilem PBS und Resuspendieren in PBS in einer geeigneten Konzentration (typischerweise 1-5 × 10 7 Zellen / ml). Transplantationszellen in einem Volumen von 100 ul in 6-12 Wochen alte NSG Mäusen durch intravenöse Injektion in die Schwanzvene unter Verwendung einer 28 G-Insulinspritze. Legen Sie das Tier in einem Restrainer, heizen den Schwanz in einen Becher mit warmem Wasser, um die Venen erweitern sich, und reinigen Sie den Schwanz mit einem Chlorhexidin-Tupfer vor der Injektion. Nach der Injektion Druck auf die Injektionsstelle mit steriler Gaze, bis die Blutung aufhört. Transplant mindestens 3 Tiere / Gruppe. Pflegen Sie die Mäuse auf dem Wasser mit 1 mg / ml Gentamycinsulfat. </li><li> Vierzehn Tage nach der Transplantation zu behandeln Tiere mit TKI oder Fahrzeug nur und Ernteproben für die Analyse von Ziel-Hemmung. Wiegen Tiere und behandeln mit einer angemessenen Dosis (mg / kg Körpergewicht) oder TKI Fahrzeugs. Verabreichen Behandlung in einem Volumen von 5 ml / kg Körpergewicht durch intraperitoneale (ip) Injektion oder 10 ml / kg Körpergewicht durch orale Sondenfütterung. Für ip-Injektion, zurückhalten mit der Maus manuell und injizieren in der rechten unteren Quadranten des Bauches mit einer 29 G-Nadel. Für orale Gabe, beschränken Sie die Maus manuell und halten das Tier aufrecht. Legen Sie die Magensonde Rohr in den Mund über die Zunge und in den hinteren Teil des Mundes. Drücken Sie leicht auf den Schlauch durch die Speiseröhre in den Magen passieren. Drücken Sie den Spritzenkolben, die Behandlung zu verabreichen. Wenn der Kolben nicht leicht drücken die Sondennadel sollte entfernt und neu positioniert werden. Bereiten TKI Formulierungen unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Wenn Pervanadat Behandlung gewünscht, bereiten PV-Lösung 20 min vor der Ernte, wie oben (Schritt 1.1.4) beschrieben und in Medium verdünnt mit 1 uM MgCl 2 und 100 U / ml DNase (120 ul PV + 880 ul Medium). Hinweis: PV für mindestens 1 h nach der Verdünnung stabil. </li><li> Sacrifice Tiere durch CO 2-Narkose an der apchenden Zeit (en) nach der Behandlung. Dissect Oberschenkelknochen durch Entfernen Fell, Haut und Muskeln aus dem gesamten Bein, so dass die Knochen vollständig ausgesetzt. Entfernen der Oberschenkelknochen von Clipping mit Dissektionsscheren knapp unter dem Hüftgelenk wieder oberhalb des Kniegelenks. Überweisung in eine Petrischale und bündig Knochenmark mit 1 ml kaltem PBS verdünnt oder PV-Lösung mit einer Spritze und einer 27 G-Nadel. Wenn die Behandlung mit PV, Inkubation bei RT im Dunkeln für 10 min. </li><li> Bereiten Lysaten und zu analysieren, Phospho-Protein-und Protein-Ebene-Gesamt wie oben (1.1.6-1.2.5 Schritte) angezeigt. </li><li> Quantifizieren relativ Phospho-Protein-und Protein-Ebene-Gesamt für jede Probe mit Densitometrie. Phospho-protein/total-protein relativ zu berechnen, um den durchschnittlichen Wert für phospho-protein/total-protein Vehikel-behandelten Tieren. </li></ol> 5. Evaluation der Anti-Leukämie-Aktivität von TKI in ALLEN Xenograft Modelle <ol><li> Falls notwendig, setzen Mäuse auf 200 cGy von Strahlung in einem RS-2000-Strahler Prio 1 Tagr zu verpflanzen. Transplant-Mäusen mit Leukämie-Zelllinien, wie oben (Schritt 4.1) beschrieben. Transplant mindestens 6 Mäuse pro Gruppe. Identifizieren von Ohrstanzmäuse. Alternativ kann eine schwarze Markierung verwendet, um Mäuse mit Hash-Zeichen auf ihren Schwänzen zu identifizieren. In Bereicherung in Käfige, um das Potenzial für Käfigkollegen Aggression während der Studie zu reduzieren. </li><li> Gönnen Mäuse mit einem TKI oder Fahrzeug nur wie oben (Schritt 4.2) beschrieben. Überwachung des Gesundheitsstatus der Mäuse täglich über körperliche Untersuchung und Gewichtsbestimmung. Erwartete Symptome der Leukämie (reduzierte Aktivität, Gewichtsverlust, Lähmung der hinteren Gliedmaßen und Augeninfektionen). Gewichtsverlust von mehr als 10% -15% wird in der Regel mit dem Tod der Maus innerhalb von zwei Tagen verbunden und ist typischerweise ein Surrogatendpunkt für Tod in Übereinstimmung mit der Norm IACUC Anforderungen. </li><li> Überwachung der Transplantation und die Entwicklung von Leukämie über eine in-vivo-Biolumineszenz-Imaging-System bis zu 2x wöchentlich. Bereiten Sie eine 200x-D-Luciferin-Stammlösung (30 mg / ml) in Sterile Wasser. Vorsichtig mischen durch Umdrehen, bis D-Luciferin vollständig gelöst ist. Verwenden Sie unverzüglich, aliquotieren und bei -20 ° C. Vor der Bilderzeugung unter Verwendung eines in vivo-Biolumineszenz-Bilderzeugungssystem, auftauen Aliquots von D-Luciferin bei RT und verdünnt 1:2 PBS auf eine Endkonzentration von durch einen 0,2 &amp;mgr; m-Filter 15 mg / ml und Filter-Sterilisieren. </li><li> Anesthetize die Mäuse vor der Bildgebung mit 1,5% Isofluran in Sauerstoff eingeatmet. Überwachen ausreichende Anästhesie, dadurch gekennzeichnet, Muskelentspannung, Bewegungsverlust und Verlust der Reaktion auf Zehenklemm Stimulation. </li><li> Unmittelbar vor der Bildgebung zu verabreichen 150 mg / kg Körpergewicht D-Luciferin durch ip-Injektion (10 ul 15 mg / ml Luciferin / g Körpergewicht). </li><li> Verwenden Sie eine in-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung System zu 2 Serie von Bildern mit sequentieller 30, 60 und 90 Sekunden Belichtungen und einer abschließenden Bild mit einem 120 Sekunden Belichtung fotografieren. Nach der Bebilderung zurück Mäuse in Käfige und Monitor für Erholung von der Narkose. Je nach derIntensität der Biolumineszenz können Belichtungszeiten variiert werden. Optimale Belichtungszeit sollte für ein bestimmtes Modell vorbestimmt und konsistent gehalten, so dass die Signalintensitäten für einzelne Zeitpunkte sind in der gesamten Studie vergleichbar. </li><li> Bestimmen Sie Biolumineszenz Intensität für jede Maus mit Wohnzimmer Bild 3.2 Erfassung und Analyse-Software. Bestimmen Sie, in Photonen / gemessene Gesamtflusswerte zweiten, indem Regionen von Interesse (ROI) gleicher Größe über jede Maus. </li><li> Opfern Mäuse durch CO 2-Exposition und zervikale Dislokation wenn moribund, aufweist Lähmung, bei mehr als 15% Gewichtsverlust, oder am Ende der Studie. Dissect Mäusen und Rekord Beobachtungen (z. B. Erweiterung der Milz, Leber oder Lymphknoten, blasse Knochenmark). Dissect Oberschenkelknochen und bündig Knochenmark mit kaltem PBS mit einer 27 G-Nadel. </li><li> Sammeln Zellen in einer Mikrozentrifuge bei 2.500 Upm für 5 min. Die Zellen in PBS, enthaltend 2% FBS und Inkubation für 5 min bei RT.Zellen sammeln und Fleck mit 20 mg / ml DAPI (4,6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid, 1:1000) und FITC-konjugiertem α-hCD45 (1:100) oder Maus-IgG 1-Isotyp-Kontroll-Antikörper (1:100) . Bewerten Leukämie Transplantation mit Durchflusszytometrie. Tor auf der lebensfähige Population (DAPI negativ) und bestimmen Prozentsatz der CD45 +-Zellen (% Blasten im Knochenmark). </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Diese Handschrift beschreibt eine wirksame Strategie zur Evaluierung neuer Tyrosinkinase-Inhibitoren bei der Behandlung von akuter Leukämie. Mit diesem Ansatz, biochemischen und Anti-Leukämie-Aktivitäten werden zunächst in zellbasierten Assays in vitro Xenotransplantat-Modelle in vivo ausgewertet und dann. Immunoblot-Analyse wurde erfolgreich verwendet, um die Hemmung der Ziel Tyrosinkinase in Leukämiezellen nach der Behandlung mit TKI demonstrieren und direkt vergleichen die Wirksamkeit von mehre...

Akute lymphatische Leukämie (ALL) ist die häufigste Krebserkrankung bei Kindern 1,2. Die Gesamtüberlebensrate für Kinder-B-Zelllinien-ALL (B-ALL) ist etwa 85%, aber spezifische biologische Subtypen, darunter T-Zelllinien-ALL (T-ALL), haben immer noch schlechtere Prognose auch mit den aktuellen Therapieprotokolle. Die weitere Behandlung des rezidivierten ALL bleibt eine Herausforderung 3. Obwohl die Mehrheit der erwachsenen Patienten mit akuter Leukämie eine Remission zu erreichen mit Up-Front-Chemotherapie leiden viele Patienten immer noch 4 Rückfall. Strom Chemotherapien bei der Behandlung von akuter Leukämie bekannt, um Toxizität assoziierten kurz-und langfristige Nebenwirkungen verursachen. Daher werden weniger toxische Therapien, die spezifisch auf Krebszellen mit minimaler Wirkung auf normales Gewebe stark benötigt. In den letzten Jahren wurde der Schwerpunkt auf der Entwicklung von neuen, molekular gezielte Wirkstoffe mit Spezifität für Krebszellen oft unter Verwendung von iterativen Chemie platziertmehrere Wirkstoffe, die dann verglichen und priorisiert werden müssen 5 zu erzeugen. Dieses Manuskript beschreibt eine effiziente Strategie für die präklinische Evaluierung der TKI für die Behandlung von akuter Leukämie, die für die Bewertung einer einzigen Verbindung oder zur direkten Vergleich mehrerer Verbindungen, um die Medikamentenentwicklung zu erleichtern verwendet werden kann. Die hier vorgestellten Verfahren besteht aus vier Schritten. Die erste biochemische (1) und Anti-Leukämie-(2)-Aktivitäten der Verbindung (en) sind in der Zellkultur untersucht, dann die Hemmung des Targets in Tiermodellen (3) bestätigt, und schließlich therapeutische Wirksamkeit des TKI (en) (4) in orthotopen Leukämie Xenotransplantatmodellen bestimmt. Für diese Untersuchungen ist es wichtig, relevante Zelllinien, die Vertreter der häufigsten biologischen Subtypen wählen. Zelllinien gewählt werden, die beide, ausdrücklich das Ziel, Interesse und fehlt das Ziel von Interesse, zu untersuchen, ob biologische Wirkungen med. sinddurch Hemmung der Ziel iated. Dies ist für die Entwicklung von kleinen Molekül-Inhibitoren, die Nebeneffekte, die für Anti-Tumor-Aktivität können besonders relevant. Es ist auch notwendig, um eine Zelllinie, die von der Ziel-zur funktionellen Wirkungen wie Proliferation oder Überleben zu wählen. Vorläufige Zielvalidierungsstudien (außerhalb des Umfangs dieses Artikels) mittels RNA-Interferenz-oder anderen spezifischen Mittel, um das Ziel zu hemmen, kann verwendet werden, um zielabhängigen Zelllinien zu identifizieren. Es ist auch wünschenswert, um Zelllinien, Maus-Xenotransplantaten, so daß Zellkulturergebnisse können mehr direkt übersetzt in in vivo Experimenten bilden können wählen. Zur Bewertung der biochemischen Aktivität von TKIs in Leukämie-Zellen vermittelt wird, kann eine Abnahme der Rezeptor-Phosphorylierung als Indikator der Hemmung Ziel verwendet werden. Western-Blot-Analyse oder ELISA-Assays können verwendet werden, abhängig von der Verfügbarkeit und Spezifität von Antikörpern.Wenn Antikörper mit ausreichender Spezifität für das Ziel verfügbar sind, sind ELISA-Assays bevorzugt, da sie mehr quantitative und effizient sind. In Fällen, in denen Antikörper mit ausreichender Spezifität für ELISA nicht verfügbar sind, können Western-Blot-Analyse erforderlich sein. In diesem Fall kann die Immunpräzipitation von einer großen Menge an Lysat nützlich für die Detektion von Zielen, die in geringer Menge sind sein. Dieser Ansatz ist für die Messung von Phospho-Proteine, die eine kurze Halbwertszeit haben können, für schnelle Änderungen in der Signal in Reaktion auf Umweltreize ermöglichen besonders relevant. Einige phosphorylierte Proteine ​​sind extrem labil, wahrscheinlich als Ergebnis der Komplexbildung mit Phosphatasen. Für robuste und konsistente Detektion dieser phosphorylierten Proteine ​​kann es auch möglich sein, Zellen mit Pervanadat eine irreversible Protein-Tyrosin-Phosphatase-Inhibitor 6 behandelt, um das Phospho-Protein vor der Herstellung ganzer Zellysate stabilisieren. Zubestimmen, ob biochemische Aktivität ergibt Antitumorwirkungen können zielabhängigen biologischen Prozesse in Zell-basierten Experimenten beobachtet werden. Für Leukämie-Zelllinien, kann Anti-Leukämie-Aktivität durch TKI vermittelt mit Koloniebildungstests in Methylcellulose oder Soft-Agar-7 durchgeführt beurteilt werden. Weichagar kann bevorzugt sein, da dies ein festes Medium, das eher für die Manipulation wenn wiederholte Behandlung mit TKI erforderlich ist. Während viele akute myloid Leukämie (AML) Zelllinien Kolonien in Soft-Agar zu bilden, werden die meisten ALLE Zelllinien nur bilden Kolonien in Methylcellulose, die ein halbfestes Medium ist. Obwohl es möglich ist, mittel-und / oder Methylcellulose in TKIs Kulturen zu aktualisieren, kann nur kleine Mengen verwendet und mit begrenzten Frequenz werden. Ebenso ist es schwieriger, in Methylcellulose-Kolonien ohne Unterbrechung färben. Vorläufige Studien sollte die Fähigkeit von geeigneten Zelllinien, Kolonien in Methylcellulose und / oder Soft-Agar-und T-Form zu definierener optimale Dichte von Zellen in Kultur, so dass Kolonien sich nicht überlappen und in ausreichender Anzahl, um statistisch (üblicherweise 50-200 Kolonien pro 35 mm-Platte) erhalten relevanten Daten. Während in-vitro-Assays sind robust und kostengünstig, und haben weniger ethischen Implikationen als ganze Tierversuche, Weiterentwicklung der therapeutischen Verbindungen erfordert Nachweis der Wirksamkeit und Sicherheit in Tiermodellen. Für die in vivo-Studien können menschliche akuten Leukämie-Zelllinien in orthotop NOD.Cg-Prkdc SCID transplantiert werden ich l2rg tm1Wjl / SZJ (NSG) Mäuse und TKI kann leicht durch Injektion oder orale Gabe verabreicht werden. Einige Zelllinien kann die Exposition von Mäusen NSG auf eine niedrige Zelllinie abhängige Dosis der Strahlung, um festzustellen, für Heterotransplantate erfordern, und in diesem Fall Mäuse können nicht tolerieren, ohne orale Gabe 5-10 Tage Erholungszeit nach der Bestrahlung. Dieses Manuskript beschreibt Generation der B-ALL und T-ALL-Heterotransplantate mitspezifische Zelllinien (697 und Jurkat) als Beispiele aber Xenotransplantaten in Mäusen NSG Verwendung einer großen Vielzahl von Zelllinien etabliert werden. In dem Fall, dass andere Zelllinien sind falls die Anforderung für die Bestrahlung, die optimale Anzahl von Zellen zu verpflanzen, und den Zeitpunkt der Entstehung und Progression Krankheit sollte experimentell bestimmt werden. Im Idealfall werden diese Modelle vollständiger Penetranz (jedes Tier transplantiert entwickelt Leukämie), konsistente Kinetik (Leukämie schreitet ähnlich bei allen Tieren) und eine angemessene Behandlungsfenster (idealerweise 20 bis 30 Tage zwischen Beginn der Behandlung und Entfernung aus der Studie aufgrund von Krankheit) haben . Die Anzahl der Zellen transplantiert erhöht werden, um kinetische Penetranz und Konsistenz zu verbessern oder verringert, um das Behandlungsfenster bei Bedarf zu verbessern. Zu bestimmen, ob TKI vermitteln Ziel-Hemmung in vivo werden die Proben von Mäusen mit Leukämie Xenotransplantaten nach der Behandlung mit TKI oder nur Fahrzeug gesammelt. Idealerweise sollte die Dosis eind Zeitplan der Verwaltung für diese Experimente werden von pharmakokinetischen Studien, die oft von kommerziellen Labors durchgeführt und sind nicht in den Anwendungsbereich dieses Artikels geführt werden kann. Wenn pharmakokinetischen Daten verfügbar sind, kann die Konzentration der Verbindung für eine effektive Ziel Hemmung in der Zellkultur und die maximale Konzentration im Serum nach einer Einzeldosis von TKI erforderlich verwendet, um eine Anfangsdosis für Tierversuche zu definieren. Pharmakokinetischen Studien können auch den Zeitpunkt der Probenentnahme nach der Behandlung informieren pharmakokinetische Studien und die Art der Verabreichung. Inhibition des Ziels in jeder betroffenen Organs bewertet werden, aber die meisten Gewebe, die leicht erhoben und verarbeitet werden, sind bevorzugt. Die meisten akuten Leukämie-Zelllinien zu etablieren in der Leber, Knochenmark, der Milz, dem peripheren Blut und dem Zentralnervensystem, obwohl die spezifischen Organe betroffen und das Ausmaß der Transplantation dieser Organe variiert zwischen den Modellen. Die hier vorgestellte Protokoll beurteilt phospho-Protein-Hemmung im Knochenmark mittels Western Blot-Analyse, aber soliden Organen kann einfacher sein, konsequent ernten und benötigen nur minimale oder keine Verarbeitung vor dem Einfrieren, so dass weniger Gelegenheit für den Abbau von Phosphor-Proteine ​​während der Probensammlung und-verarbeitung. Immunhistochemie kann auch verwendet werden, um solide Tumoren oder Organe von Leukämie betroffen bewerten. Schließlich wird die therapeutische Wirksamkeit des TKI (s) in orthotopen Leukämie-Xenograft-Modellen bestimmt. Aus diesen Untersuchungen kann der Zeitpunkt der Einleitung der Behandlung variiert werden, so dass Krankheit mehr oder weniger festgelegt. Die Behandlung kann unmittelbar nach der Transplantation für die ersten Studien beginnen und dann in nachfolgenden Studien verzögert, bis erhebliche Krankheitslast erkannt wird, um eine Diagnosebehandlungsmodell genauer anzunähern. Idealerweise haben diese Tiermodellen auch die Fähigkeit zur nicht-invasiven Messung der Krankheitsbelastung. Wir haben Verfahren für die Einführung der Firefly Lucifer optimiertase-Gen in Leukämie-Zelllinien mit Virus-ähnlichen Partikeln, so dass für nicht-invasive, Längsschnittanalyse der Krankheitsbeginn und Verlauf und Beurteilung der Krankheitslast im Knochenmark und soliden Organen. Entscheidend für diesen Ansatz ist die Verwendung von Luciferase-markierte monoklonale Zelllinien, um die Variabilität in der Entwicklung von Luciferase-exprimierenden Leukämie mit der Verwendung von polyklonalen Zellinien assoziiert zu verhindern, und ist nicht abhängig von der Behandlung mit einem TKI 8. Zusammengenommen können diese Schritte für die Bewertung eines einzelnen TKI oder zum direkten Vergleich und Einstufung der mehreren TKIs verwendet werden. Während die Protokolle hier vorgestellt werden, zielen auf die Entwicklung von TKI, können diese Methoden, um andere Ziele angepasst werden und Überlegungen für die Assay-Entwicklung beschrieben. Somit kann diese Strategie im weiteren Sinne der präklinischen Bewertung von molekular gezielte Wirkstoffe anwendbar zur Behandlung von akuter Leukämie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1064">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:167px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:233px;">#02194057</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS07, H302-H318</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Sodium Orthovanadate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#S6508</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302+ H312+H332 </td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:443px;">2-Mercaptoethanol </td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M7522</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ColonyGel Human Base Medium </td>
			<td style="width:167px;">ReachBio</td>
			<td style="width:233px;">#1101</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M5655</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Difco Noble Agar </td>
			<td style="width:167px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:233px;">#214883</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrotetrazolium Blue Chloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#N6639</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">D-Luciferin Firefly, Potassium Salt</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#122796</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">4&#39;,6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D9542</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC CD45 </td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#347463</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC Mouse IgG1 Isotype control</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#51-35404X-2</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Gentamycin Sulfate</td>
			<td style="width:167px;">Sparhawk</td>
			<td style="width:233px;">#NDC58005-633-04</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitors </td>
			<td style="width:167px;">Roche </td>
			<td style="width:233px;">#11836153001</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">DNase</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D4263 </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protein G Beads</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:233px;">#10-1242</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Isofluran</td>
			<td style="width:167px;">VETONE</td>
			<td style="width:233px;">#NDC13985-030-60</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 35 mm &#215; H 10 mm</td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D7804-500EA</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm </td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D8429-1CS</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6-well plates</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#353046</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">14 gauge x 4 inch blunt-end needles</td>
			<td style="width:167px;">Cadence science</td>
			<td style="width:233px;">#7956</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">5 ml syringe with luer-lok</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309646</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">GelCount automated colony counter</td>
			<td style="width:167px;">Oxford Optronix</td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">In vivo bioluminescence imaging system</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#IVIS200</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scout pro portable balances, scale</td>
			<td style="width:167px;">Ohaus</td>
			<td style="width:233px;">#SP202</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:443px;">Broome style rodent restrainer</td>
			<td style="width:167px;">Plas-labs</td>
			<td style="width:233px;">#551-BSRR</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ear punch, punch diameter: 2 mm</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#24210-02</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Chlorhexidine swabs, Prevantics</td>
			<td style="width:167px;">PDI</td>
			<td style="width:233px;">#B10800</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2</td>
			<td style="width:167px;">Monoject </td>
			<td style="width:233px;">#8881500042</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile</td>
			<td style="width:167px;">Instech</td>
			<td style="width:233px;">#FTP-20-38</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">1 mL Luer-Lok disposable syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309628</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x &#189;, permanently attached needle</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#329465</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine bonn scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#14084-08</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Student fine scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#91460-11</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Moria ultra fine forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11370-40</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine graefe forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11150-10</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10003-12</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10011-00</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for treatment of acute leukemia

Rezeptortyrosinkinasen sind bei der Entwicklung und Progression von vielen Krebsarten, einschließlich Leukämie und soliden Tumoren in Verbindung gebracht und sind attraktiv druggable therapeutische Ziele. Hier beschreiben wir eine effiziente Vier-Schritte-Strategie für die präklinische Bewertung von Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKI) in der Behandlung der akuten Leukämie. Zunächst wird Western-Blot-Analyse verwendet, um die Ziel Inhibition in kultivierten Leukämiezellen zu bestätigen. Die funktionelle Aktivität wird dann unter Verwendung klonogene Assays in Methylcellulose oder Soft-Agar-Kulturen untersucht. Experimentelle Verbindungen, die Aktivität in Zellkulturassays zeigen, werden in vivo mit NOD-SCID-gamma (NSG) orthotop Mäusen mit menschlichen Leukämie-Zelllinien transplantiert ausgewertet. Erste In-vivo-Studien bewerten pharmakodynamische Zielhemmung in leukämischen Blasten aus dem Knochenmark isoliert. Dieser Ansatz wird verwendet, um die Dosis und Verabreichungsschema für eine effektive Zielsperre notwendig festzustellen,ion. Nachfolgende Studien bewerten die Wirksamkeit der TKI in vivo unter Verwendung von Luciferase exprimierenden Leukämiezellen, wodurch eine nicht-invasive Überwachung des Biolumineszenz Leukämie Belastung und Beurteilung der therapeutischen Reaktion unter Verwendung eines in vivo-Biolumineszenz-Bilderzeugungssystem. Diese Strategie wurde in vitro und in vivo wirksam war zur Bewertung der TKI und kann zur Identifizierung von molekular gezielte Wirkstoffe mit therapeutischem Potential oder zum direkten Vergleich und Priorisierung von mehreren Verbindungen eingesetzt werden.

Die hier vorgestellten Untersuchungen bewertet die biochemischen und funktionellen Wirkungen von TKI vermittelt und kann verwendet werden, um neue Verbindungen, basierend auf dem Grad der Ziel Inhibierung in vitro und in vivo werden einstuft, Reduktion der Koloniebildung und Verzögerung Leukämogenese NSG in Mäusen mit Luciferase-transplantierten getaggt Leukämiezellen. Immunoblot-Analyse wurde verwendet, um die Hemmung der aktiven phosphorylierten Form des Zielproteins ...

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Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Rezeptortyrosinkinasen sind bei vielen Krebs ektopisch exprimiert und sind als therapeutische Ziele bei akuter Leukämie identifiziert. Dieses Manuskript beschreibt eine effiziente Strategie für die präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung der akuten Leukämie.

Präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung von akuter Leukämie

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

pre-clinical-evaluation-tyrosine-kinase-inhibitors-for-treatment

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Medicine

Unit 1

Signaling Networks of Kinase Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

18.0K Aufrufe.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  Rezeptortyrosinkinasen sind bei vielen Krebs ektopisch exprimiert und sind als therapeutische Ziele bei akuter Leukämie identifiziert. Dieses Manuskript beschreibt eine effiziente Strategie für die präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung der akuten Leukämie. 

Serie: Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel underlying neurobiological mechanisms behind drug action and neurotransmitter-related disorders, such as depression and ADHD. Like most of the imaging methods (PET, SPECT, CT) it represents a progress in the investigation of brain disorders and the related function of neurotransmitter pathways in a non-invasive way with respect of the overall neuronal connectivity. Moreover it also provides the ideal tool for translation to clinical investigations. MRI, while still behind in molecular imaging strategies compared to PET and SPECT, has the great advantage to have a high spatial resolution and no need for the injection of a contrast-agent or radio-labeled molecules, thereby avoiding the repetitive exposure to ionizing radiations. Functional MRI (fMRI) is extensively used in research and clinical setting, where it is generally combined with a psycho-motor task. phMRI is an adaptation of fMRI enabling the investigation of a specific neurotransmitter system, such as serotonin (5-HT), under physiological or pathological conditions following activation via administration of a specific challenging drug.
The aim of the method described here is to assess brain 5-HT function in free-breathing animals. By challenging the 5-HT system while simultaneously acquiring functional MR images over time, the response of the brain to this challenge can be visualized. Several studies in animals have already demonstrated that drug-induced increases in extracellular levels of e.g. 5-HT (releasing agents, selective re-uptake blockers, etc) evoke region-specific changes in blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signals (signal due to a change of the oxygenated/deoxygenated hemoglobin levels occurring during brain activation through an increase of the blood supply to supply the oxygen and glucose to the demanding neurons) providing an index of neurotransmitter function. It has also been shown that these effects can be reversed by treatments that decrease 5-HT availability16,13,18,7. In adult rats, BOLD signal changes following acute SSRI administration have been described in several 5-HT related brain regions, i.e. cortical areas, hippocampus, hypothalamus and thalamus9,16,15. Stimulation of the 5-HT system and its response to this challenge can be thus used as a measure of its function in both animals and humans2,11.

The goal of this technique is to assess serotonin (5-HT) neurotransmitter function in the live and free-breathing animal with pharmacological magnetic resonance imaging (phMRI) and an intravenous challenge with a selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI), fluoxetine.

Die Verwendung von pharmakologischen fMRT-Herausforderung in der präklinischen Forschung: Anwendung auf die 5-HT-System

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel ...

Forschung

Medizin

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Einem orthotopen Blasentumor Modell und der Auswertung der intravesikalen Behandlung SÄRNA

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that participate in regenerating tissue, tumor formation, or vasculogenesis, we devised a multi-colored cellular transplant model of tumor development in which cell populations originate from different fluorescently colored reporter gene mice and are transplanted, engrafted or injected in and around a developing tumor. These colored cells are then recruited and incorporated into the tumor stroma. In order to quantitatively assess bone marrow derived tumor stromal cells, we transplanted GFP expressing transgenic whole bone marrow into lethally irradiated RFP expressing mice as approved by IACUC. 0ovarian tumors that were orthotopically injected into the transplanted mice were excised 6-8 weeks post engraftment and analyzed for bone marrow marker of origin (GFP) as well as antibody markers to detect tumor associated stroma using multispectral imaging techniques. We then adapted a methodology we call MIMicc- Multispectral Interrogation of Multiplexed cellular compositions, using multispectral unmixing of fluoroprobes to quantitatively assess which labeled cell came from which starting populations (based on original reporter gene labels), and as our ability to unmix 4, 5, 6 or more spectra per slide increases, we&#39;ve added additional immunohistochemistry associated with cell lineages or differentiation to increase precision. Utilizing software to detect co-localized multiplexed-fluorescent signals, tumor stromal populations can be traced, enumerated and characterized based on marker staining.1

Complex tissue masses, from organs to tumors, are composed of various cellular elements. We elucidated the contribution of cellular phenotypes within a tissue utilizing multi-labeled fluorescent transgenic mice in combination with multiparameter immunofluorescent staining followed by spectral unmixing to decipher cell origin as well as cell characteristics based on protein expression.

Quantitative Multispektrale Fluoreszenz-Analyse Nach Gewebetransplantation zur Visualisierung von Zell Origins, Typen und Wechselwirkungen

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Die Handhabung der Baumwolle Ratte in Studien für die präklinische Bewertung onkolytischer Viren

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

Präklinische Orthotopische Mausmodell der menschlichen Prostata-Krebs

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers utilize a syringe pump to directly administer volatile anesthetics into a gas stream. Unlike a traditional vaporizer, it can be used at very low flow rates, making it ideal for use on mice and rats. 
The equipment's capability to use low flow rates could result in a substantial cost savings due to the reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal scavenging filters1. A lower flow rate means less waste of anesthetic gas and likely reduces the risk of anesthetic exposure to laboratory personnel. Thus, the high levels of precision and safety associated with direct injection vaporizers, along with a reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal filters are beneficial for research requiring small animal anesthesia. 
The goal of this protocol is to demonstrate the use of a syringe-driven direct injection vaporizer as part of a digital, low-flow anesthesia system. The direct injection vaporizer is capable of accurately delivering anesthesia at very low flow rates compared to a traditional vaporizer, making it a promising alternative for controlled gas anesthetic delivery to rodents.

Here, we present a protocol to more safely and efficiently administer anesthetic gas to mice using a digital, low flow anesthesia system utilizing a syringe-driven direct injection vaporizer.

Die Verwendung eines Low-Flow-Digital-Anästhesiesystem für Mäuse und Ratten

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

Eine akute Retinal Modell zur Bewertung von Blut Retinal Barrier Breach und potenzielle Medikamente für die Behandlung

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

A Pre-Clinical Porcine Model of Orthotopic Heart Transplantation

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart failure. Multiple small-animal models of heart transplantation have been used to study the acute and long-term effects of novel therapies. However, few are tested and demonstrated success in clinical trials. It is of critical importance to evaluate new therapies in a clinically relevant large-animal model for efficient and reliable translation of basic studies&#39;&#160;findings. Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and previously used to investigate novel cardioprotective strategies. This procedure focuses on acute ischemia-reperfusion injury and is a reliable method to investigate novel interventions which have been tested and validated in smaller experimental models, such as the murine model. We demonstrate its usefulness in assessing cardiac performance during the early post-transplantation period and other potential possibilities enabled by the model.

Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and utilized to investigate novel cardioprotective strategies.

Ein präklinisches Porcine-Modell der orthotopischen Herztransplantation

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart ...

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after circulatory death (DCD) is a solution to address this limited availability, but due to a period of prolonged warm ischemia and the risk of tissue injury, its routine use in cardiac transplantation is seldom seen. In this manuscript we provide a detailed protocol closely mimicking current clinical practices in the context of DCD with continuous monitoring of heart function, allowing for the evaluation of novel cardioprotective strategies and interventions to decrease ischemia-reperfusion injury.
In this model, the DCD protocol is initiated in anesthetized Lewis rats by stopping ventilation to induce circulatory death. When systolic blood pressure drops below 30 mmHg, the warm ischemic time is initiated. After a pre-set warm ischemic period, hearts are flushed with a normothermic cardioplegic solution, procured, and mounted onto a Langendorff ex vivo heart perfusion system. Following 10 min of initial reperfusion and stabilization, cardiac reconditioning is continuously evaluated for 60 min using intraventricular pressure monitoring. A heart injury is assessed by measuring cardiac troponin T and the infarct size is quantified by histological staining. The warm ischemic time can be modulated and tailored to develop the desired amount of structural and functional damage. This simple protocol allows for the evaluation of different cardioprotective conditioning strategies introduced at the moment of cardioplegia, initial reperfusion and/or during ex vivo perfusion. Findings obtained from this protocol can be reproduced in large models, facilitating clinical translation.

This protocol shows a simple and flexible approach for the evaluation of new conditioning agents or strategies to increase the feasibility of cardiac donation after circulatory death.

Präklinisches Modell der Herzspende nach Kreislauftod

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. However, the evaluation of right ventricular pressure (RVP) and pulmonary artery pressure (PAP) remains technically challenging in mice. RVP and PAP are more difficult to measure than left ventricular pressure because of the anatomical differences between the left and right heart systems. In this paper, we describe a stable right heart hemodynamic measurement method and its validation using healthy and PAH mice. This method is based on open-chest surgery and mechanical ventilation support. It is a complicated procedure compared to closed chest procedures. While a well-trained surgeon is required for this surgery, the advantage of this procedure is that it can generate both RVP and PAP parameters at the same time, so it is a preferable procedure for the evaluation of PAH models.

Here, we present a protocol to perform an invasive hemodynamic assessment of the right ventricle and pulmonary artery in mice using an open-chest surgery approach.

Invasive hämodynamische Beurteilung des rechten ventrikulären Systems und Hypoxie-induzierte pulmonale arterielle Hypertonie bei Mäusen

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...