Das übergeordnete Ziel des folgenden Videos ist es, die Verwendung der gepoolten epigenetischen shRNA-Bibliothek zur Durchführung eines negativen Selektionsscreenings zu demonstrieren. Dieses Screening ermöglicht es, spezifische epigenetische Ziele durch Sequenzierung zu identifizieren. Dieses Verfahren könnte helfen, die epigenetischen Faktoren zu identifizieren, die für die Vermittlung der erworbenen Cytarabin-Resistenz bei AML verantwortlich sind Die Schritte sind wie folgt.
Auswahl des potentesten Promotors, um eine persistente und verlängerte Expression der shRNAs zu erhalten. Das aktuelle Protokoll konzentriert sich auf das RNAi-Screening unter Verwendung der epigenetischen Faktor-shRNA-Bibliothek in der Cytarabin-resistenten MV4-11-Zelllinie. Die zu diesem Zweck verwendeten Promotoren sind humanes EF-1 alpha, humanes CMV und SFFV, Promotoren, die grünes Fluoreszenzprotein exprimieren.
Nehmen Sie die Zellzahl mit der Trypan-Blue-Ausschlussmethode an. Suspendieren Sie die Zellen in 10% RPMI-Medium, das 8 Mikrogramm pro ml Polybren enthält. Samen Sie 1 Million Zellen in 1,5 ml Medium pro Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen in Verdreifachungen.
Fügen Sie verschiedene Volumina konzentrierter Lentiviren hinzu. Zum Beispiel Lentiviren, zum Beispiel 10, 20 und 40 Mikroliter, abhängig vom Titer der Lentiviren zu jedem Well. Schwenken Sie den Teller vorsichtig, um den Inhalt zu mischen.
Führen Sie eine Spinfektion durch Zentrifugation bei 920 g bei 37 Grad Celsius für 90 Minuten durch. Inkubieren Sie die Platten sofort in einem Kohlendioxid-Inkubator. Beobachten Sie das GFP am Ende von 48 Stunden und quantifizieren Sie es am Ende von 72 Stunden.
Führen Sie als Nächstes die im Flussdiagramm dargestellten Schritte aus, um den Promotor auszuwählen, der einen konsistenten GFP-Ausdruck in der gesamten Kultur anzeigt. Vorbereitung der gepoolten lentiviralen humanen epigenetischen Faktor-shRNA-Bibliothek. Kultur 293T-Zellen mit einer niedrigen Passagezahl mit einer guten Proliferationsrate in drei 10-Zentimeter-Zellkulturschalen mit 8 ml 10% DMFM-Medium in jeder Platte.
Sobald die Zellen eine Konfluenz von 60% erreicht haben, ersetzen Sie sie vollständig durch frisches Medium. Bereiten Sie die Transfektionsmischung wie beschrieben vor, die serumfreies Medium, das lentivirale Verpackungsplasmid PAX2 und das Hüllplasmid pMD2 enthält. G, gepoolte Bibliotheksplasmide und schließlich das Transfektionsreagenz.
Klopfen Sie auf die Mischung, um sie gut zu mischen, und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Fügen Sie die Transfektionsmischung zu den 293T-Zellen hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Wirbeln der Platten. Inkubieren Sie die Platten in einem Kohlendioxid-Inkubator.
Wechseln Sie das Medium nach 24 Stunden. Überprüfen Sie nach 48 Stunden die GFP-Expression unter einem Fluoreszenzmikroskop, um eine hohe Transfektionseffizienz in 293T-Zellen sicherzustellen. Sammeln Sie die Virusüberstände nach 48, 60 und 72 Stunden und lagern Sie sie bei 4 Grad und fügen Sie zu jedem Zeitpunkt nach dem Sammeln des Virus frisches Medium, 8ml, hinzu.
Filtern Sie die gepoolten Viren mit einem 0,4-Mikron-Filter. Um einen hohen Titer von Viren zu erhalten, konzentrieren Sie die gepoolten Viren durch Ultrazentrifugation. Die gefilterten Virusüberstände werden auf 70 Ti-Röhrchen übertragen und 2 Stunden lang mit 18.000 g zentrifugiert.
Verwenden Sie vorgekühlten Rotor und Zentrifuge bei 4 Grad. Nehmen Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge und entfernen Sie den Überstand vollständig. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig in 400 Mikroliter DMEM ohne FBS und Antibiotika mit einer Mikropipette, inkubieren Sie auf Eis für 1 Stunde.
Aliquot die Viren und frieren bei minus 80 Grad ein. Berechnen Sie die Konzentration des Virus wie gezeigt. Abschätzung der Transduktionseffizienz von Lentiviren.
Transduzieren Sie 293T-Zellen mit einem konzentrierten Virus in verschiedenen Volumina, 2, 4 und 8, um die erfolgreiche Präparation des Lentivirus zu bestätigen. Bewerten Sie das konzentrierte Virus auf 100X, um ein Titrationsexperiment in der Zielzelllinie durchzuführen. Samen Sie 1 Million Zielzelllinie in 1,5 ml 10% RPMI-Medium, das 8 Mikrogramm pro ml Polybren in einer Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen enthält.
Fügen Sie vier verschiedene Volumina hinzu, 1, 1,5, 2, 2,5 Mikroliter 100X-Viren. Führen Sie eine Spinfektion durch Zentrifugation der Platte bei 920 g für 90 Minuten bei 37 Grad Celsius durch. Messen Sie nach 72 Stunden den Prozentsatz der GFP-positiven Zellen durch Durchflusszytometrie.
Bestimmen Sie das Volumen der Viren, um eine Transduktionseffizienz von 30 % zu erhalten. Diese geringe Transduktionseffizienz soll eine einzelne shRNA-Integration pro Zelle gewährleisten. Transduktion der gepoolten epigenetischen shRNA-Bibliothek in der arzneimittelresistenten Zelllinie.
Berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die für das Experiment genommen werden sollen, wie unten basierend auf der Anzahl der viralen Integrantien. Resuspendieren Sie 11 Millionen Zellen in 16 ML von 10% RPMI-Medium. Fügen Sie Polybren hinzu, acht Mikrogramm pro ml und mischen Sie gut, und fügen Sie dann das erforderliche Volumen an Viren hinzu, um eine Transduktionseffizienz von 30% zu erhalten, wie zuvor berechnet.
Samen Sie alle Zellen auf einer Sechs-Well-Platte mit einer Dichte von 1 Million Zellen pro 1,5 ml pro Well. Zentrifugieren Sie die Platte für 90 Minuten bei 920 g bei 37 Grad Celsius. Inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem Kohlendioxid-Inkubator.
Wechseln Sie nach 24 Stunden das Medium und übertragen Sie die transduzierten Zellen in einen T-75-Kolben. Überprüfen Sie das GFP nach 48 Stunden unter einem Fluoreszenzmikroskop, um eine erfolgreiche Transduktion sicherzustellen. Nach 72 Stunden quantifizieren Sie das GFP durch Durchflusszytometrie.
Anreicherung der GFP-positiven Zellen. Erweitern Sie die transduzierten Zellen, indem Sie sie 5 bis 7 Tage lang mit einer Dichte von 0,5 Millionen pro ml kultivieren, und führen Sie eine Flusssortierung mit der als hohe Reinheit und geringe Ausbeute festgelegten Flusssortiereinstellung durch. Kultivieren Sie die sortierten Zellen in einem 10%RPMI-Medium.
Führen Sie nach 72 Stunden die Schätzung des Prozentsatzes der GFP-positiven Zellen nach der Sortierung durch, um eine Sortiereffizienz von mehr als 95 % sicherzustellen. Dropout-Screening zur Identifizierung epigenetischer Faktoren, die eine Arzneimittelresistenz vermitteln. Kultivieren Sie die shRNA-Bibliotheks-transduzierten Zellen in 10% RPMI für bis zu 5 Tage.
Zentrifugieren Sie 10 Millionen Zellen in Duplikaten. Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie die Pellets bei minus 80 Grad. Diese Proben dienen als Basisreferenz für die epigenetische shRNA-Bibliothek.
Kultivieren Sie die verbleibenden transduzierten Zellen als Duplikate, R1 und R2, die jeweils mit einer Zellzahl beibehalten werden, die eine 500-fache Darstellung der Bibliothek bietet. Behandeln Sie eines der Duplikate mit dem Medikament, 10 mikromolares Cytarabin, und das andere ohne die medikamentöse Behandlung. Wechseln Sie das Medium für die Flaschen mit und ohne das Medikament alle 72 Stunden.
Wiederholen Sie den Mediumswechsel dreimal für eine kumulative Arzneimittelexposition von 9 Tagen. Überprüfen Sie nach dem 9. Tag der medikamentösen Behandlung die Lebensfähigkeit der Zellen mit der Trypan-Blue-Ausschlussmethode. Die verbleibenden lebensfähigen Zellen ausfahren, mit sterilem PBS waschen und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang bei 280 g zentrifugieren.
Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie die Pellets bei minus 80 für die DNA-Extraktion. Amplifikation der integrierten shRNAs durch PCR. Extrahieren Sie DNA aus den transduzierten Baseline-Zellen, behandelten und unbehandelten Zellen, gefolgt von der Überprüfung der Konzentration mittels Fluorometer, berechnen Sie die Menge an DNA, die wie gezeigt benötigt wird, und unterziehen Sie die Proben der ersten Runde der PCR.
Das PCR-Reaktionsgemisch ist in Tabelle 2 mit den thermischen Cyclerbedingungen dargestellt. Richten Sie mehrere Reaktionen mit 850 Nanogramm DNA pro Röhrchen für insgesamt 43 Reaktionen ein. Die PCR-Produkte bündeln und reinigen.
Elutieren Sie die Produkte in 50 Mikroliter Puffer und quantifizieren Sie sie, und schließlich lagern Sie bei minus 20. Für die PCR der zweiten Runde verwenden Sie Reverse-Index-Primer, und die Reagenzien sind in Tabelle 4 tabellarisch dargestellt. Richten Sie vier Reaktionen mit 500 Nanogramm des primären PCR-Produkts in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 Mikrolitern für jede Probe zusammen mit der Negativkontrolle ein.
Laden Sie das gesamte Produkt für die Elektrophorese mit 2% TBE-Agarosegel und bestätigen Sie die Bandengröße mit einer KB-Molekülleiter. Visualisieren Sie die PCR-Produkte auf dem Gel-Dokumentationssystem. Entfernen Sie das spezifische Band und reinigen Sie es mit einem Gelreinigungskit.
Berechnungen für die Reinigung mit dem Kit sind in Tabelle 3 enthalten. Elute in einem Endvolumen von 30 Mikrolitern Elutionspuffer mit der ungefähren Konzentration jedes Elutionsmittels um 80 bis 90 Nanogramm pro Mikroliter. Next-Generation-Sequencing und Datenanalyse.
Die gelgereinigten Produkte werden einer Next-Generation-Sequenzierung unterzogen, um Lesezahlen für den erschöpften shRNA-Bedarf zu erhalten. Kürzen Sie die Adaptersequenzen, richten Sie die gefilterten Lesevorgänge an den Referenzsequenzen aus, laden Sie die Dateien mit SAMtools, um eine Ausrichtungszusammenfassung zu erhalten. Laden Sie die beschnittenen fastQ-Dateien in CRISPRCloud2 und führen Sie die Analyse gemäß den Anweisungen durch.
Klicken Sie auf den Link für den CRISPRCloud2. Wählen Sie den Bildschirmtyp als Überlebens- und Ausstiegsbildschirme aus. Legen Sie die Anzahl der Gruppen fest und geben Sie den Namen für jede Gruppe ein.
Laden Sie die Referenzbibliothek im FASTA-Dateiformat hoch. Die hochgeladenen Daten werden verarbeitet und die Ergebnisse sind in der angegebenen URL verfügbar. Repräsentative Daten.
Diese Abbildung zeigt MV4-11 elterliche und resistente Zellen, die mit steigender Cytarabinkonzentration, 0,1 Mikromolar bis 1.000 Mikromolar und Viabilitätsbewertung durch MTT-Assay behandelt wurden. Diese Abbildung zeigt repräsentative Flussdiagramme des GFP, quantifiziert durch Durchflusszytometrie am Ende von 72 Stunden für humane EF-1 alpha, humane CMV und SFFV-Promotoren. Humanes CMV zeigt unseren heterogenen Peak, während humanes EF-1 alpha und SFFV einen einzigen homogenen Peak zeigen.
Diese Abbildung zeigt das Balkendiagramm für die drei verschiedenen Promotorwirkungsgrade in MV4-11. SFFV-gesteuertes GFP zeigte das Schweigen des GFP in längerer Kultur. hEF-1 alpha-getriebene GFP-Zellen zeigten eine anhaltende Expression nach der Sortierung dieser Zellen.
Das linke Feld zeigt die Transfektionseffizienz der gepoolten shRNA-Bibliothek, die am Ende von 48 Stunden unter Fluoreszenzmikroskopie in 293T transfiziert wurde. Das rechte Bild zeigt die Transduktionseffizienz des Poolvirus in 293T-Zellen mit unterschiedlichen Virusvolumina, 2, 4 und 8 Mikrolitern. Diese Zahl stellt die Transduktionseffizienz in MV4-11-resistenten Zelllinien mit unterschiedlichen Volumina von Viren wie 1, 1,5, 2, 2,5 Mikrolitern dar, um eine Transduktionseffizienz von 30% zu erreichen.
Diese Abbildung zeigt die Sortierung der GFP-positiven Zellen mit 30% Transduktionseffizienz bei hoher Reinheit und geringer Ausbeute. Die Abbildung zeigt eine schematische Darstellung der medikamentösen Behandlung der GFP-positiv sortierten Zellen für eine längere Cytarabin-Exposition von 9 Tagen, gefolgt von der Überprüfung der Lebensfähigkeit und dem Sammeln der Zellen für DNA. Diese Abbildung zeigt die Bindungsbereiche des Primers, der in der ersten und zweiten Runde der PCR verwendet wird.
Diese Abbildung veranschaulicht die Bandgröße des PCR-Produkts am Ende der ersten Runde PCR, 397 Basenpaar, und des zweiten Runde PCR-Produkt 399 Basenpaares, das gel-elutiert, gereinigt und für NGS gegeben wurde. Diese Abbildung veranschaulicht die Darstellung der angereicherten oder erschöpften shRNAs, die auf die epigenetischen Faktoren abzielen, die die Cytarabinresistenz bei AML vermitteln könnten. Schlussfolgerung. Dieses Protokoll unterstreicht die Bedeutung eines gezielten Knockdown-Screenings, um sowohl essentielle als auch nicht-essentielle Gene systematisch zu befragen, und demonstriert die Verwendung dieses Ansatzes als funktionelle Plattform, die die Identifizierung von Zielen ermöglicht, die für die Arzneimittelresistenz verantwortlich sind.
