Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium von der University of British Columbia (BV) und Zuschüsse von Mukoviszidose Kanada und Canadian Institutes of Health Research (DPS) unterstützt. Wir danken Jacqueline Chung für die erste Erstellung von Protokollen.

1. Kultur Growth (Tage 1 +2) <ol><li> Wachsen Sie ein Starter-Kultur: 3 ml Luria Bertani (LB)-Brühe in einem Snap Top-15-ml-Tube, bei 37 ° C über Nacht Rotator. Verdünnte Wachstum über Nacht bis zu einer OD 600 von 0,6. 1 ml dieser Verdünnung auf 100 ml LB-Brühe in einem 250 ml Erlenmeyerkolben. Bei 37 ° C bei 250 rpm für 16 Stunden in die stationäre Phase (SP) Schütteln, um eine bessere Näherungswerte, in Batch-Kultur, Infektionsbedingungen und die bakterielle Virulenzfaktoren unter der Kontrolle der stationären Phase Signalfaktoren wie rpoS und Beschlussfähigkeit sichern Sensor, ausgedrückt werden. Alternativ können Bakterien in einem frühen oder mittleren SP-oder späten logarithmischen Phase gezüchtet, um Informationen auf dem bakteriellen Adaptionsphase zu gewinnen. </li><li> Nach 16 h gemessen, und die OD 600 der Kultur gewährleisten SP durch Vergleich mit einer zuvor konstruierten Wachstumskurve unter identischen Bedingungen erreicht. </li></ol> 2. Proteinextraktion (Tag 3) <ol><li&gt; Kühlen Sie alle Medien und Lösungen vorher im Kühlschrank über Nacht. Alle Schritte sind mit Rohren in einem Eimer Eis durchgeführt werden. Vorkühlung einen Mikro und Beckman Coulter Hochleistungszentrifuge (oder gleichwertig) auf 4 ° C und der Rotor innen (= Rotor JA-20, = Zentrifuge J2-HS). </li><li> Bereiten Sie frischen 0,1 M Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF, 174.19 g / mol)-Lösung in Aceton durch Auflösen von 0,0174 g PMSF (&quot;VORSICHT&quot; PMSF ist giftig und ätzend, Verwendung Masken und Handschuhen) in 1 ml Aceton (&quot;VORSICHT&quot; Aceton toxischen und brennbaren, verwenden Sie Schutzmasken und Handschuhen). </li><li> Bilden eine PBS / EDTA / PMSF-Lösung: 0,1 ml 0,1 M PMSF, 0,1 ml 0,5 M EDTA und 9,8 ml PBS. Überprüfen die OD der 16-Stunden-Kultur ist ungefähr dort, wo es sein sollte SP. </li><li> Nehmen 35 ml der Bakterienkultur und Transfer auf ein Oakridge-Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge die Kultur bei 4500 × g für 20 min bei 4 ° C </li><li> Überstand entfernen, um einen Abfallbehälter und35 ml gekühlte PBS und Resuspendieren des Pellets. Zentrifugieren bei 4.500 × g für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand entfernen und Resuspension in 1 ml kaltem PBS gewaschen. Übertragen, um sterile 2 ml Eppendorf-Zentrifuge 1 min auf hoch in der Mikrozentrifuge bei 14.000 × g bei 4 ° C. Stand entfernen und entsorgen. </li><li> 1 ml PBS / EDTA / PMSF-Lösung, das Pellet und Transfer zu einem 2 ml Schraubdeckel Rohr (mit O-Ring) mit ~ 0,5 ml Glasperlen (vorsterilisierten). Fügen Sie den resuspendierten Pellets in die Röhrchen mit den Glasperlen und Perlen bash sie bei 4 ° C für 1 min im Kühlraum. Tun Sie dies 3x, indem die Probe auf Eis nach jedem bash. </li><li> Zentrifugieren bei 14000 × g für 1 min in der Mikrozentrifuge. Entfernen Sie den Überstand und steckte es in eine sterile 5 ml Polystyrolröhrchen. </li><li> Um die Ausbeute zu erhöhen 1 ml PBS / EDTA / PMSF Lösung derselben Röhre enthalten Glasperlen wieder. Wulst schlag die Röhrchen bei 4 ° C für 1 min. Tun Sie dies, indem 2x die Probe auf Eis after bash. Zentrifuge bei 14.000 xg für eine Minute auf der Zentrifuge und den Überstand und in den Überstand aus Schritt 2.8. Verwenden eine 1 ml Spritze und einer 0,20 um Filterüberstand vom Polystyrolröhrchen zu einem neuen sterilen 2 ml-Eppendorf-Röhrchen. </li><li> An diesem Punkt sollten die Proben für die Proteinmenge untersucht werden, unter Verwendung des Pierce MicroBCA Protein-Extraktions-Kits und Aliquots von 200 &amp;mgr; sollte eingefroren werden, bis -80 ° C erforderlich. </li></ol> 3. Probenvorbereitung (Tag 4) <ol><li> Bereiten Sie 25 ml Rehydrierung Stammlösung (8 M Harnstoff, 2% CHAPS, 2% IPG-Puffer, 0,002% Bromphenolblau) und Speicher in 2,5 ml Aliquots bei -20 ° C. In 7 mg Dithiothreitol (DTT, 154,2 g / mol) gerade vor auf eine 2,5 ml Aliquot Rehydrierung Stammlösung zu verwenden. </li><li> Prozess aufgetauten Proben aus Schritt 2.10 mit einer 2-D-Kit mit Abgleich letzten Resuspension in 450 ul Rehydrierung Stammlösung in Schritt 3.1 vorbereitet. </li></ol> 4. ErsteDimension-Isoelektrische Fokussierung (IEF) (Tag 4) Alle Schritte in diesem Abschnitt werden mit dem Ettan IGPhor IEF-System. <ol><li> Bis die erste Dimension IPG-Streifen Set: saubere Bandhalter mit Bandreinigungslösung und dann waschen mit Milli-Q-Wasser, lassen Sie den Kopf, um zu trocknen. Weisen Sie jede Probe zu einem Gel Streifenhalter Nummer. </li><li> Legen Sie die Probe aus Rehydratisierungsschritt in der zweiten größeren Bereich von der (-)-Ende. Verwenden Sie saubere Pinzette Gel-Streifen aus der Verpackung ziehen. Nehmen Sie Schutzschicht aus Gel-Streifen. Linienstreifen raue Seite nach unten in einer langsamen, gleitenden Bewegung, um die Streifen nass auf dem Weg von zu bekommen (-) Ende (+)-Ende. </li><li> Setzen feuchten Löschpapier mit sterilisiertem Wasser auf der Oberseite der Elektrode und unter den Gel-Streifen, um Burnout zu verhindern. Pinzette Spülen in-zwischen den Runden mit gereinigtem Wasser und Ethanol. Entfernen Sie alle Luftblasen, überlagern dünn mit Mineralöl zu trockenen outs zu verhindern. Richten Sie die Gel-Streifenhalter auf der Maschine. </li><li> Führen Sie 12 Stunden bei 20 ° C für rehydRation, 1 h bei 200 V, 1 h bei 500 V, 1 h bei 1000 V, 0,5 Stunden bei 4000 V, 12 h bei 8000 V, 24 h Halten bei 300 V und kann zu diesem Zeitpunkt eingenommen werden. </li><li> Nach IEF beendet ist, wird empfohlen, die zweite Dimension SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchzuführen, es sei denn, die IPG-Streifen werden bei -80 ° C in Saran Wrap für zukünftige Analysen mit Mineralöl beschichtet froren. Alternativ, um Streifenbildung auf Grund Punkt DTT Zugriff zu vermeiden ist es möglich, einen zweiten Schritt der Äquilibrierung der IPG-Streifen vor dem zweiten Dimension mit einem Puffer, Iodacetamid enthält umfassen. </li></ol> 5. Zweiten Dimension SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Tag 5) Alle Schritte in diesem Abschnitt werden mit dem Ettan DALTsix Elektrophorese-Vorrichtung. <ol><li> Um das Gel Zaubergerät zu montieren, gründlich reinigen und alle Komponenten sicher, dass Gel-Caster ist eben und die graue Gummi-Bindung ist mit Silikon-Gel geschmiert. Setzen Sie die schwarze reibengliedsdreieckigen Anschlag auf der Unterseite. Dann abwechselnd legen Sie das Trennzeichen und die Glasplatten mit der kürzeren Glasplatte nach vorne. Stellen Sie sicher, die Separatoren sind auf der Rückseite und der Vorderseite. Füllen Sie den verbleibenden Platz mit den Füllstoffen (ca. 5 Blatt), so dass die Oberseite ist flach. Setzen Sie die Frontplatte auf die rote Spitze auf der Außenseite. Verwenden Schellen, jede Seite festziehen und die unteren Schrauben festziehen. </li><li> Vorbereitung des Gels: Fügen 297,3 ml Duracryl, (ist &quot;Vorsicht&quot; Duracryl giftig Verwendung Masken und Handschuhen), 147 ml Tris-Puffer 1,5 M pH 8,8 und 143,3 ml Milli-Q-Wasser in einen Kolben mit Vakuum-Spitze enthält eine Rührstab. Setzen Sie Deckel auf und mischen Lösung bei mäßiger Geschwindigkeit mit dem Vakuum für 20 min. Das Vakuum wird verwendet, um de-Gas die Lösung. Stellen Sie eine frische 10% Ammoniumpersulfat-Lösung (APS, 218,8 g / mol): 0,2 g APS bis 2 ml Milli-Q-Wasser. </li><li> Zugabe des Gemisches zu dem Gel Gel Nachlauf: Wenn Vakuum getan 6 ml 10% Natriumdodecylsulfat (SDS, 228.38 g / mol)auf der Seite des Kolbens zu vermeiden, dass Luftblasen mehr in der Lösung. APS hinzufügen, umrühren, 0,25 ml N, N, N &#39;, N&#39;-Tetramethylethylendiamin (TEMED, 116.20 g / mol) (&quot;VORSICHT&quot; TEMED ist brennbar Verwendung Masken und Handschuhen) und umrühren. </li><li> Gießen Gel-Mischung in ein Gel Nachlauf durch einen Trichter an der Rückseite der Vorrichtung eingesetzt ist. Gießen Sie bis zu einem Zoll unter der Kurzschild. 1,5 ml wassergesättigtes Butanol an die Spitze des Gels und wickeln Sie oben mit Frischhaltefolie um Austrocknung zu vermeiden. Warten Sie 1 Stunde voll Polymerisation zu gewährleisten. </li><li> Überprüfen Sie das Gel: Wenn das Gel durchgeführt (die Flasche zu prüfen), zerlegen das Gel Caster von einem Waschbecken. Überprüfen Sie für Gel-Integrität beim Spülen der Glasplatten mit warmem Wasser, kein Wasser auf die Platte geben. Gießen Sie das Butanol und spülen Sie die Top-Gel zweimal mit Wasser ab, um Butanol zu bekommen. Füllen Sie den oben wieder mit Wasser und lassen Sie sich, wenn die Gele nicht sofort verwendet werden. </li><li> Vorbereitung der Streifen: Bereiten Äquilibrierungspufferlösung aus derGefrierfach (6 M Harnstoff, 75 mM Tris-HCl pH 8,8, 29,9% SDS, 0,002% Bromphenolblau). Dies kann bei -20 ° C vorbereiteten und in 10 ml Aliquots gelagert werden Man löst 0,1 g DTT auf eine 10 ml Äquilibrierungspuffer Lösung. Ein Rohr für zwei IPG-Streifen verwendet werden. Legen Sie die Gele des Streifens Gesicht nach unten auf den Puffer und lassen Sie sich für 30 min. Denken Sie daran, welche Seite welche ist. </li><li> Herstellung des Elektrophorese-Einheit (2-D-Trennvorrichtung): In 4,5 l 1x Elektrophorese-Puffer (25 mM Tris-Base [121,1 g / mol], 192 mM Glycin [288,38 g / mol] und 0,1% w / v SDS [288,38 g / mol]) in den Tank läuft. Dieser Puffer kann bis zu 3-fach verwendet werden. Drehen Sie den Elektrophorese-Einheit auf. Wasserstand im Wasserkühlmaschine und füllen es mit Wasser, wenn sie niedrig ist. Schalten Sie das Gerät, drücken Sie Modus, um die bestimmte Temperatur, die 10 ° C sein sollten überprüfen </li><li> Stellen Sie 1 l 2x Laufpuffer und 1 l 1x Laufpuffer und speichert sie bei 4 ° C Machen Agarose-Dichtungslösung: Gewicht 0,25 g agarose und in 50 ml 1x Laufpuffer auflösen. Impuls für jede 15 Sekunden. </li><li> Einrichten der Elektrophorese-Einheit: mit einer Pinzette herausnehmen jeden Streifen und entfernen Sie das überschüssige Puffer auf beiden Seiten mit sauberen Papiertuch. Berühren Sie NICHT die Streifen. Gießen Sie das Wasser auf dem Gel und säumen den Gel-Top mit 1x Laufpuffer. Verwenden Sie saubere Pinzette und legen die Streifen auf der Oberseite des langen Platte, mit der Gel-Seite gegen Sie vor. In 1x Puffer zu den Streifen, um es zu schmieren. Slide-Streifen weiter nach Verwendung von Kunststoffstreifen. Entferne alle Luftblasen zwischen dem Band und dem Gel. </li><li> Hinzufügen Agarose-Versiegelungslösung auf die Oberseite des Bandes, um es abzudichten. Wiederholen, für den Rest der Streifen. Legen Sie die Glasplatten mit den Gelen in Gel-und Unterschale in das Gel Tank. Sicherstellen, dass der Puffer 1x Ebene in der äußeren Kammer ist auf der unteren Zeile bezeichnet, bevor die obere Kammer auf. </li><li> Legen Sie den Rahmen für die obere Pufferkammer auf der Oberseite der Glasplatten und gewährleisten, dass sie alle way nach unten, indem Sie den Boden nach unten. Verwenden Sie einen Trichter und fügen Sie die 2x Laufpuffer in die obere Kammer bis zur Mittellinie. Verwenden Sie einen Trichter und hinzufügen 1x Laufpuffer in die äußere Kammer, bis er die obere Linie erreicht. Zeigen Deckel auf und schalten Sie die Elektrophorese-Einheit und dem Netzteil. </li><li> Führen Sie über Nacht bei 52 V, 96 mA, 5 W. Prüfen Sie, ob der Strom geht durch die Suche nach Blasen auf dem Silberdraht in der Nähe der Spitze. Führen Sie das Gel, bis die führende Linie ist 1 cm von der Unterseite. </li><li> Proteine ​​können auch mit Hilfe von Geräten und Reagenzien von anderen Unternehmen wie BIORAD oder Hoefer analysiert werden, gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 6. Silberfärbung der Gele für Gel-Visualisierung (Tag 5-6) <ol><li> Bereiten Sie eine Lösung Lösung 1 (800 ml Ethanol, 200 ml Essigsäure und 1000 ml Milli-Q-Wasser in Abzug in einem Plastikeimer). Lösung ist gut für 6 Gele. Schalten Sie alle Maschinen aus und nehmen Sie das gesamte Mittelteil des Elektrophorese-Einheit und puwerde es in der Wanne. Auch die weiße Stand in der Spüle. Ziehen Sie den Ober Fach mit dem 2x-Laufpuffer. </li><li> Demontieren Sie das Gerät und entfernen Sie die Gele von den Glasplatten in ein fix Lösung. Gele können durch Abschneiden Ecken, wenn sie von den Glasplatten entfernt werden, identifiziert werden, die Anzahl der Ecken schneiden, die dem Gel, um in den Zaubernden. </li><li> Das Gefäß mit der Fixierlösung und die Gele auf einem Schüttler für mindestens 1 h bis über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Übertragen der Gele zu Lösung 2 zu fixieren (20 ml 50% Glutaraldehyd, 600 ml Ethanol, 5 g Kaliumtetrathionat (302.46 g / mol), 136 g Natriumacetat (82.03 g / mol) und Milli-Q-Wasser auf 2.000 ml) und auf einer Wippe für 1 Stunde. </li><li> Waschen Sie die Gele 4x 15 Minuten jeder in Milli-Q-Wasser. </li><li> Färben die Gele in Silbernitratlösung (4 g Silbernitrat (169,87 g / mol), 500 &amp;mgr; l Formaldehyd und Milli-Q-Wasser auf 2000 ml) für 30 min oder bis zu 48 Stunden. </li><li> Waschen Gel 1min in Milli-Q-Wasser. </li><li> Übertragen, um Entwicklerlösung (60 g Natriumcarbonat (105.99 g / mol), 300 ul Formaldehyd, 15 mg Natriumthiosulfat (158.11 g / mol) und Milli-Q-Wasser auf 2000 ml) für 5-30 min, bis die Gel gefärbt. </li><li> Stellen die Gele in Stopplösung (100 g Tris-Base (121,14 g / mol), 40 ml Essigsäure und Milli-Q-Wasser auf 2000 ml) für 10 min. </li><li> Für die Lagerung, übertragen Sie die Gele auf Glycerin-Lösung (40 ml Glycerin oder 400 ml, wenn langfristige Lagerung erwünscht ist, und 1.600 ml Milli-Q-Wasser) für 10 min und dann trocknen Sie sie mit einem Gel-Trockner. </li><li> Gele können nach Färbung mit bildgebenden Systemen wie einem Scanner / Densitometer, fotografiert mit Licht-Transilluminator oder Gel-Imager sichtbar gemacht werden. Bildanalyse-Software wie PDQuest 2-D-Analyse von BIORAD können dann verwendet werden, um quantitative und qualitative Informationen aus Proteine ​​in einer Probe zu erhalten. </li></ol> 7. Gel Silberfärbung für Massenspektrometrie-Analyse </p&gt; <ol><li> Beheben die Gele in 50% Methanol und 5% Essigsäure für 1 Stunde. </li><li> In 50% Methanol und für mindestens 10 min bis über Nacht. </li><li> In destilliertem Wasser 3x Waschen für 10 min. </li><li> Sensibilisierung mit 0,02% Natriumthiosulfat (158.11 g / mol) 2x 15 min. </li><li> 3x Waschen in destilliertem Wasser CHILLED 3x für 10 min. </li><li> Gel tauchen in gekühltes 1% Silbernitrat-Lösung (169.87 g / mol) für mindestens 20 min bis 1 h bei 4 ° C </li><li> Wash 2x für 1 min mit destilliertem Wasser. Ändern Fach / Eimer. </li><li> Entwickeln Sie in 0,04% Formaldehyd in 2% Natriumcarbonat wasserfrei (105.99 g / mol) und entsorgen, wenn es gelb wird ziemlich schnell, haben drei Chargen und bereit sein, alle 5 min. </li><li> In 5% Essigsäure waschen speichern dann in 1% Essigsäure. </li><li> Spülen Sie 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen (zum Halten bekommen Stelle Ausschnitte) mit USP-Qualität Ethanol und Luft trocknen vor der Verwendung. </li><li> Sauberen Pinzette, Rasierklingen und Flächen mit 100% Methanol. </li><li> Spray Handschuhe und Oberflächen mit Ethanol. </li><li> Verbrauchstellen in einem Flow-Haube oder saubere Luft Bereich. Spots können auch mit Hilfe eines automatisierten Spot Cutter ausgeschnitten werden. </li><li> Setzen Sie sie in Eppendorf-Röhrchen und Schiff auf Eis oder im Kühlschrank aufbewahren. </li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+and+characterization+of+bacterial+factors+associated+with+Burkholderia+cenocepacia+survival+in+a+murine+host.">Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host.</a> Microbiology. 153, 206-214 (2007).</li><li>Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Public+health+assessment+of+potential+biological+terrorism+agents.">Public health assessment of potential biological terrorism agents.</a> Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).</li><li>Thon, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteomic+analysis+of+protein+changes+during+platelet+storage+requires+complementary+proteomic+approaches.">Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches.</a> Transfusion. 48, 425-435 (2008).</li><li>Wu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+New+and+Emerging+Proteomic+Techniques.">In New and Emerging Proteomic Techniques.</a> Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).</li><li>Lopez, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+silver+stain+and+SYPRO+Ruby+Protein+Gel+Stain+with+respect+to+protein+detection+in+two-dimensional+gels+and+identification+by+peptide+mass+profiling.">A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling.</a> Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Verfahren zur Herstellung Proteinen wurde beschrieben, dass die Mehrzahl von Burkholderia Proteine ​​mit guter Reproduzierbarkeit zu extrahieren. Dies wird durch Erhalten der gleichen Proteinprofil von zwei unabhängigen Präparaten in unterschiedlichen Tagen unter Verwendung des gleichen Bakterienkultur in LB-Brühe oder YEM wie in Fig. 1 gezeigt, durchgeführt gezeigt. Extraktion war effizient für Bakterien in Flüssigmedien gewachsen, allerdings haben wir diese Methode nicht getestet f?...

Die Gattung Burkholderia umfasst mehr als 62 Arten, Gram-negative Organismen aus einer Vielzahl von Nischen isoliert, und es ist in zwei Hauptcluster 1,2 unterteilt ist. Der erste Cluster umfasst menschliche, tierische und phytotrophic Organismen, und die meisten Studien haben sich auf die pathogenen Arten dieser Gruppe aufgrund ihrer klinischen Bedeutung konzentriert. Die meisten Mitglieder sind pathogene B. pseudomallei und B. mallei (die Melioidose Rotz und bewirkt, dass jeweils) 3,4 und opportunistische Infektionen (die 17 Arten der Burkholderia cepacia-Komplex, BCC) 5, die Krankheit bei zystischer Fibrose (CF) und chronische Granulomatose (CGD) führen ein. Der zweite Cluster mit mehr als 30 nicht-pathogenen Spezies enthält Bakterien mit Pflanzen oder mit der Umgebung verbunden und werden als potentiell nützlich, um den Host-2. Zahlreiche Komplikationen entstehen from bakterielle Infektion mit dem pathogenen Mitgliedern der Gattung Burkholderia, wie die Übertragung des Erregers zwischen Patienten, Ausbreitung der Krankheit und Therapieversagen wegen der intrinsischen oder erworbene Resistenz gegenüber Antibiotika schwer zu machen in den meisten Fällen 6-9 beseitigen. Daher gewinnt ein besseres Verständnis der Grundlagen zur Erstellung von bakteriellen Infektion ist entscheidend für die Behandlung von Krankheiten, die durch diese Organismen verursacht werden. Um Einblick in die Etablierung der Infektion zu gewinnen, sind umfangreiche Untersuchungen der bakteriellen Komponenten mit Pathogenese verbunden nötig. Studien mit Schwerpunkt auf der Proteom-Analyse von Burkholderia Organismen unter Verwendung Proteom-Ansätzen beschriebenen Proteine, die in bakteriellen Pathogenese impliziert worden sind sowie Veränderungen in ihrem Proteom-Profile 10-16. Protein-Extraktionsverfahren mit Ultraschall und gefrieraufgetaut Zyklen in Lyse-Puffer mit hoher konzentration Harnstoff, Thioharnstoff ist in Kombination mit Reinigungsmittel und Ampholyte in Burkholderia proteomische Studien 10-13 angewendet. Obwohl Harnstoff ist sehr effizient für die Denaturierung von Proteinen, kann es ein Gleichgewicht in wässriger Lösung mit Ammonium Isocyanat, die mit Amino-Gruppen reagieren können, zu schaffen, wodurch Artefakte (Carbamylierung Reaktion) 17. Daher ist es empfehlenswert, Trägerampholyten, die als Radikalfänger wirken, umfassen Cyanat und vermeiden Sie Temperaturen über 37 ° C 17. Weiterhin jede chemische Störungen Lysepuffer mit Proteinquantifizierung zu verhindern, können die gleichen Lyse-Puffer verwendet, um die Standardkurve zu erzeugen, so dass die Proben und die Standards, die gleiche Hintergrund 10 werden. Andere Methoden beinhalten die Verwendung von alkalischen Puffer-und Reinigungsmittel mit Wärme Inkubationszeiten 17,18, aber diese Bedingungen könnten Veränderungen im Proteom induzieren und einige Reinigungsmittel sind nicht kompatibel mit proteomics Anwendung, es sei denn anschließenden Reinigungsausbauschritte enthalten 17,18. Nach ausreichender Extraktion und Quantifizierung können globale Proteinexpression jedes einzelnen Proteins unter Verwendung Proteomics wie zweidimensionale (2-D) Gelelektrophorese untersucht werden. Diese Technik wurde zuerst von O&#39;Farell 19 beschrieben und besteht in der Trennung von Proteinen entsprechend ihrem isoelektrischen Punktes durch isoelektrische Fokussierung in der ersten Dimension, und dann nach ihrem Molekulargewicht durch Acrylamid-Gel-Elektrophorese in der zweiten Dimension. Aufgrund der Auflösung und Empfindlichkeit, ist diese Technik ein mächtiges Werkzeug für die Analyse und Detektion von Proteinen aus komplexen biologischen Quellen 19,20. Dieses Trennverfahren ist in Protein-zentrierte Ansätze mit dem großen Vorteil zur Lösung von Protein-Isoformen durch posttranskriptionelle Modifikationen oder proteolytische Verarbeitung verursacht verfügbar. Quantitative Veränderungenkann durch Vergleich der Intensität des entsprechenden Punkt nach Färbung des Gels 20 detektiert werden. Jedoch ist diese Technik nicht für die Ermittlung von sehr großen Proteine, Membranproteine ​​extrem basischen und sauren oder hydrophoben Proteine ​​geeignet, und ist etwas mühsam und zeitaufwendige Technik 20. Neue Peptid-zentrierten Ansätzen (nicht Gel-Basis), die robuster und Ziel sind verfügbar und können zur quantitativen Vergleich von Differential stabilen Isotopenmarkierungsmethoden wie Cystein Kennzeichnung von isotopencodierten Affinität Tagging (ICAT) 21, und Amino-Gruppe verwendet werden Kennzeichnung von Isotop-Tagging für relative und absolute Quantifizierung (iTRAQ) 22. Die Verwendung eines einzigen Proteom Technik könnte nicht genügend Informationen erhalten, so dass die Verwendung von zwei komplementären Proteomics notwendig ist für die meisten vollständig Beurteilung von Veränderungen im Proteom. Dennoch ist 2-D-Gelelektrophorese verbreiteten und routinemäßig für Mengen angewendet werdentive Expression mehrerer Proteine ​​in verschiedenen Organismen. Hier beschreiben wir eine Ganzzellproteinextraktion und 2-D-Gelelektrophorese Verfahren für Burkholderia Spezies, die angepasst und optimiert wurden aus den GE Healthcare 2-D-Elektrophorese-Grundlagen und Methoden-Handbuch 80-6429 60AC-2004 ( <a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a> ). Die Proteingewinnung wurde mit einer Kugelmühle mit Glasperlen in Gegenwart von PBS mit 5 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) und 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) durchgeführt. Dieses Verfahren ermöglicht die Quantifizierung von Proteinen mit minimalen Abbau und änderbare für proteomische Ansätze wie bereits berichtet 15,23,24. 2-D-Gelelektrophorese wurde unter Verwendung von 24 cm immobilisierte pH-Gradienten von 4-7 und Proteinen durchgeführt wurden entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt abgetrennt. Proteine ​​wurden dann entsprechend ihrer Mole getrenntdere Gewicht durch SDS-Polyacrylamid-Gel. Außerdem beschrieben wir eine Silberfärbung Verfahren zur Visualisierung von Punkt Proteinen und einer Silberfärbung Methode, die für die Massenspektrometrie-Analyse kompatibel ist. Zusammen können diese Verfahren die Identifizierung von wichtigen Proteinen aus Burkholderia-Arten, die in der Pathogenese beteiligt sein könnten ermöglichen.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7626</td>
 <td>Toxic, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A18-1</td>
 <td>Flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS Buffer</td>
 <td>Bioscience</td>
 <td>R028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP118-500 </td>
 <td>toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass beads (0.1 mm)</td>
 <td>BioSpec Products</td>
 <td>11079101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21009-342</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroBCA protein extraction kit</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>23235</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>02-681-375</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-D Clean-Up kit</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6484-51</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Urea</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15505-050</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>Amersham Biosciences</td>
 <td>17-1314-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol (DTT)</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>856126</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm</td>
 <td>Amersham Biosciences</td>
 <td>176002-46</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Duracryl</td>
 <td>Proteomic Solutions</td>
 <td>80-0148</td>
 <td>Very toxic, carcinogen</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium persulfate</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP179-100</td>
 <td>Flammable, toxic, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15524-010</td>
 <td>Flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP166-500</td>
 <td>Acute toxicity, flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15510-027</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>HC1100-1GL</td>
 <td>Flammable, toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A491-212</td>
 <td>Flammable, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutaraldehyde</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>G151-1</td>
 <td>Very toxic, corrosive, dangerous for the environment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium tetrathionate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2926</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium acetate</td>
 <td>EM Science</td>
 <td>7510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silver nitrate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>209139</td>
 <td>Corrosive, dangerous for the environment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>252549</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium thiosulfate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S7026</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>EMD</td>
 <td>9230</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycine</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>808831</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>800688</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A412-4</td>
 <td>Flammable, toxic, health hazard</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium carbonate anhydrous</td>
 <td>EMD</td>
 <td>SX0400-3</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mineral oil</td>
 <td>ACROS</td>
 <td>415080010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JA-20 ultracentrifuge rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>334831</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini Beadbeater</td>
 <td>Biospec Products</td>
 <td>3110BX</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6505-03</td>
 <td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6485-27</td>
 <td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

total protein extraction and 2-d gel electrophoresis methods for burkholderia species

Die Untersuchung der intrazellulären Proteinspiegel von Bakterienarten von Bedeutung für das Verständnis der pathogenen Mechanismen von Krankheiten, die durch diese Organismen verursacht werden. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die Proteinextraktion aus Burkholderia-Arten, basierend auf mechanischen Lysis mit Glaskügelchen in Gegenwart von Ethylendiamintetraessigsäure und Phenylmethylsulfonylfluorid in phosphatgepufferter Salzlösung. Dieses Verfahren kann für verschiedene Burkholderia-Arten verwendet werden, für die verschiedenen Wachstumsbedingungen, und es ist wahrscheinlich für die Verwendung in proteomischen Untersuchungen von anderen Bakterien. Nach Proteinextraktion wird eine zweidimensionale (2-D) Gelelektrophorese Proteom Technik beschrieben, um globale Veränderungen im Proteom dieser Organismen zu studieren. Dieses Verfahren besteht aus der Trennung von Proteinen entsprechend ihrem isoelektrischen Punktes durch isoelektrische Fokussierung in der ersten Dimension, gefolgt von der Trennung auf der Basis des Molekulargewichtsdurch Acrylamid-Gel-Elektrophorese in der zweiten Dimension. Visualisierung der getrennten Proteine ​​wird durch Silberfärbung durchgeführt.

Vergleichende Analyse der Proteinprofile von der gleichen Bakterienkultur bei zwei verschiedenen Gelegenheiten extrahiert zeigten ähnliche Muster Streifenbildung, die einen erfolgreichen Protein-Extraktionen. Molekulargewicht Proteine ​​extrahiert reichten von 10 bis 150 kDa. Abbildung 1 zeigt, Vertreter Coomassie-Blau-Färbung Gel der Ganzzellproteinextraktion aus Burkholderia multivorans (Mitglied des BCC) klinische Isolate in LB oder Hefe / Mannit (YEM) Brühe und gewachsen aus der stat...

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Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Mitglieder der Gattung Burkholderia sind Erreger von klinischer Bedeutung. Wir beschreiben ein Verfahren zur bakteriellen Gesamtproteinextraktion unter Verwendung mechanischer Aufbruch-und 2-D-Gelelektrophorese für nachfolgende Proteomanalyse.

Gesamtproteinextraktion und 2-D Gelelektrophorese-Methoden für<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arten

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

total-protein-extraction-2-d-gel-electrophoresis-methods-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

28.9K Aufrufe.  University of British Columbia.  Mitglieder der Gattung Burkholderia sind Erreger von klinischer Bedeutung. Wir beschreiben ein Verfahren zur bakteriellen Gesamtproteinextraktion unter Verwendung mechanischer Aufbruch-und 2-D-Gelelektrophorese für nachfolgende Proteomanalyse. 

Serie: Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium. Because resistance to ampicillin and vancomycin in E. faecalis is still uncommon compared to resistance in E. faecium, the development of rapid tests allowing differentiation between enterococcal species is important for appropriate therapy and resistance surveillance. The E. faecalis OE PNA FISH assay (AdvanDx, Woburn, MA) uses species-specific peptide nucleic acid (PNA) probes in a fluorescence in situ hybridization format and offers a time to results of 1.5 hours and the potential of providing important information for species-specific treatment. Multicenter studies were performed to assess the performance of the 1.5 hour E. faecalis/OE PNA FISH procedure compared to the original 2.5 hour assay procedure and to standard bacteriology methods for the identification of enterococci directly from a positive blood culture bottle.

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A rapid protocol for the direct identification of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species from a positive blood culture using a Peptide Nucleic Acid fluorescent in situ hybridization assay (PNA FISH).

Ein 1,5 Stunden-Verfahren für die Identifizierung von Enterococcus Spezies direkt aus Blutkulturen

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

Avian Influenza Surveillance mit FTA-Karten: Field Methods, Biosafety-und Transportprobleme gelöst

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

A Simple Chelex Protokoll zur DNA-Extraktion aus<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Zwei Methoden der Heterokaryon Formation zu entdecken HCV Restriktionsfaktoren

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

Verfahren zur Identifizierung von Infektions Prionen Nach Passage durch das Verdauungssystem von eine Vogelart

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Aufbau und Optimierung eines Hochdurchsatz-Setup zum Studium<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Und<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infektion als Modell für Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Proteomik von Makrophagen durch 2D-Elektrophorese

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Loop-vermittelte isothermen Amplifikation (LAMP) Assays für die artspezifischen Nachweis von<em&gt; Eimeria</em&gt;, Die Hühner infizieren

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the goal of this protocol is to develop a method to visualize the pathogen invasion in a specific immune compartment of flies, namely hemocytes. Using the method presented here, up to 3 &#215; 106 live hemocytes can be obtained from 200 Drosophila 3rd instar larvae in 30 min for ex vivo infection. Alternatively, hemocytes can be infected in vivo through injection of 3rd instar larvae followed by hemocyte extraction up to 24 h post-infection. These infected primary cells were fixed, stained, and imaged using confocal microscopy. Then, 3D representations were generated from the images to definitively show pathogen invasion. Additionally, high-quality RNA for qRT-PCR can be obtained for the detection of pathogen mRNA following infection, and sufficient protein can be extracted from these cells for Western blot analysis. Taken together, we present a method for definite reconciliation of pathogen invasion and confirmation of infection using bacterial and viral pathogen types and an efficient method for hemocyte extraction to obtain enough live hemocytes from Drosophila larvae for ex vivo and in vivo infection experiments.

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

This method demonstrates how to visualize pathogen invasion into insect cells with three-dimensional (3D) models. Hemocytes from Drosophila larvae were infected with viral or bacterial pathogens, either ex vivo or in vivo. Infected hemocytes were then fixed and stained for imaging with a confocal microscope and subsequent 3D cellular reconstruction.

Extraktion von Hemocytes aus Drosophila Melanogaster Larven für mikrobielle Infektionen und Analyse

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

Sezieren Signalisierung Multi-Protein-komplexe durch eine Bimolekulare Ergänzung Affinitätsreinigung (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Gesamtproteinextraktion und 2-D Gelelektrophorese-Methoden für

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