Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus La Fondation Yves Cotrel de l&#39;Institut de France, Paris, Frankreich (Dr. Moreau) unterstützt wird, die kanadischen Institutes of Health Research (Grant PP2-99466 Dr. Moreau) und Fourth Dimension Spine LLC , New York, USA (Forschungsstipendium an Dr. Moreau).

Das gesamte Verfahren wird unter sterilen der biologischen Haube ausgeführt und alle Lösungen und Geräte in Kontakt mit Zellen müssen steril sein. 1. Vorbereitung wichtiger Lösungen <ol><li> Werden die Lösungen gemäß Tabelle 1. </li><li> Halten ausgewogene Salzlösung (BSS) bei Raumtemperatur und allen anderen Lösungen bei 4 ° C bis zum Zeitpunkt der Verwendung. </li><li> Warm kalt Medien auf 37 º C im Wasserbad für einige Minuten vor der Verwendung. </li></ol> 2. Vorbereitung und Lagerung von PBMCs <ol><li> Sammeln Sie 10 ml Vollblut in EDTA-behandelten Sammelröhrchen zu zwei Teilmengen von PBMCs vorbereiten mit 5 ml für jedes Aliquot. </li><li> Übertragungs 5 ​​ml Vollblut aus der EDTA-behandelte Sammelröhrchen in ein 50 ml Röhrchen. </li><li> Gleiches Volumen von BSS und mischen Probe durch vorsichtiges Pipettieren auf und ab. </li><li> Platz 3 ml Ficoll in zwei 15 ml Falcon-Röhrchen. </li><li> Vorsichtig Schicht 4,5 mlvon Blut-Gemisch verdünnt über den Ficoll in jeder Röhre. </li><li> Lassen Sie die Röhrchen Ruhe für bis zu 5 min, um eine klare Trennung von Blut und Ficoll begünstigen. </li><li> Zentrifugieren der Röhrchen bei 400 × g für 30 min bei Raumtemperatur ohne Bremse. </li><li> Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge zu entfernen, um die Schichtung nicht stören. Die PBMCs sind an der BSS / Ficoll-Schnittstelle sichtbar. </li><li> Ernten Sie die trübe Schicht von PBMCs an der Schnittstelle der beiden Rohre mit einer Pipette und übertragen auf ein neues 50-ml-Tube. </li><li> 20 ml Vollmedium. </li><li> Das Röhrchen bei 288 x g für 7 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration. </li><li> Zellpellet in 500 ul zusätzlichen Medien. </li><li> Gleiches Volumen des Einfrierens Medien. </li><li> Übertragen der Zellsuspension auf eine Kryoröhrchen. </li><li> Legen Sie die Kryoröhrchen in ein cryofreezing Behälter mit Isopropanol. </li><li> Lagern Sie den Gefrierbehälter bei -80 ° C über Nacht. </li><li> Transfer die gefrorenen PBMC Aliquot von flüssigem Stickstoff zur Langzeitlagerung. </li></ol> 3. Functional Test 1. Tag 1 <ol><li> Platzieren Aliquot von flüssigem Stickstoff in einem Wasserbad bei 37 ° C für eine Minute oder bis abgetaut. </li><li> Übertragen der Zellsuspension in ein 50 ml-Röhrchen mit einer sterilen Pipette. </li><li> 15 ml komplette Medien-und Spin die Zellen nach unten bei 200 xg für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration. </li><li> Leicht suspendieren Zellpellet in 1 ml PHA Medien. </li><li> Füllen Sie das Volumen auf 20 ml mit der gleichen Medien. </li><li> Das Röhrchen locker, damit die Luft gelangen. </li><li> Verlassen das Rohr über Nacht bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator, damit Ruhe Lymphozyten in schnell proliferierenden Lymphoblasten zu transformieren. </li></ol> 2. Tag 2 <ol><li> Nehmen Sie die Röhre aus dem Inkubator, die Verschlüsse vollständig und drehen Sie die Zellen nach unten bei 200 xg für 5 minbei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration. </li><li> Sanft auszusetzen Zellpellet in 1 ml Vollmedium. </li><li> Füllen Sie das Volumen auf 20 ml mit der gleichen Medien. </li><li> Das Röhrchen locker, damit die Luft gelangen. </li><li> Verlassen das Rohr über Nacht bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator, um die Zellzahlen zu erweitern. </li></ol> 3. Tag 3 <ol><li> Holen Sie sich das Rohr aus dem Inkubator, die Verschlüsse vollständig und drehen Sie die Zellen nach unten bei 200 xg für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration. </li><li> Waschen der Zellen zweimal mit 10 ml RPMI-1640 durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Resuspendieren vorsichtig das Zellpellet in 600 ul RPMI-1640. </li><li> Messen Sie die Zellkonzentration und Lebensfähigkeit, mit einem automatisierten Zellzähler und Lebensfähigkeit-Analysator. </li><li> Hinzufügen geeigneten Volumen RPMI-1640 zu einer Zellkonzentration von 1,5 × 10 5 Zellen/20 &amp;mgr; l einzustellen. </li&gt; <li> Gönnen Zellen mit rekombinanten OPN (rOPN) oder Vehikel (PBS) in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. <ol><li> Transfer von 100 &amp;mgr; l der Zellsuspension in zwei sterile 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Hinzufügen rOPN in ein Rohr bis zu einer Endkonzentration von 0,5 ug / ml. </li><li> Ein gleiches Volumen PBS in der zweiten Röhre. </li><li> Vorsichtig mischen jede Bedingung, die durch Auf-und Abpipettieren zweimal mit einer sterilen Pipette eingestellt auf 100 ul. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die kleine Probe 96-Well-Mikroplatten. <ol><li> In 5 ul RPMI-1640 in jede Vertiefung. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 g für 3 min, um Luftblasen zu entfernen. </li></ol></li><li> Samen der unbehandelten Zellen als auch Zellen mit rOPN oder PBS behandelt. <ol><li> Vor der Übertragung der Zellen von Rohr zu Mikro sanft auf und ab pipettieren einmal, um eine gleichmäßige Suspension der Zellen zu gewährleisten. </li><li> In 40 ul Zellsuspension pro Well in vierfacher Ausfertigung für die unbehandelten Zellen, in zweifacher Ausfertigung für rOPN oder PBS behandelten Zellen. ReFER für den Entwurf 1. Diese Konstruktion ermöglicht es 12 Patienten auf der Mikrotiterplatte getestet werden. </li><li> Lassen Sie die Zelle Platte unter dem sterilen Abzug für 5 Minuten, sodass die Zellen, um sich auszuruhen und, bevor sie in den Inkubator absetzen gleichmäßig auf den Boden der Mulde. </li></ol></li><li> Inkubiere die Platte für 18 Stunden bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator, um die Wirkung von OPN zu optimieren. </li></ol> 4. Tag 4 <ol><li> Führen Sie die Platte mit Verbindungen. <ol><li> Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und lassen Sie es bei Raumtemperatur für etwa 30 min. </li><li> Bereiten 1 ml 100 uM Somatostatin und Isoproterenol in RPMI-1640 durch Zugabe von 10 ul der Stammlösung (10 mM) in 990 ul RPMI-1640. </li><li> Füllen Sie die Verbindung Platte durch den Verzicht auf 20 ul in entsprechenden Vertiefungen, wie in Abbildung 2 angegeben. </li><li> Decken Sie die Verbindung mit einem vorgeschnittenen Platte Stechdichtung, Veränderungen in Verbindung Konzentration vor durch Verdunstung zu vermeidenoder während der Inkubation in der CDS-basierten System. </li><li> Wägezelle Platte, Pipettenspitzen, und die Verbindung Platte in den CDS-basierten System. </li><li> Nennen Sie die Platte in der CDS-basierten Gerätesoftware. </li><li> Wählen Sie das entsprechende Protokoll. Die für die Klassifizierung mit PBMCs bearbeitet Protokoll &quot;Agonist Non-adhärenten Zellen Kleine Probenplatte RT 15 min&quot; genannt. Gehen Sie auf die Protokoll-Box und wählen Sie dieses Protokoll in der Liste der Protokolle </li><li> Starten Sie das Protokoll, indem Sie auf &quot;Start&quot;. </li><li> Die integrierten Flüssigkeitssystem gleichzeitig addiert die Verbindungen zu allen Vertiefungen durch Injizieren 5 ul pro Vertiefung in einer Endkonzentration von 10 &amp;mgr; M in einem Gesamtvolumen von 50 &amp;mgr; l zu erreichen. </li><li> Die CDS-basierten System sammelt automatisch die Daten für 15 min nach Zugabe der Verbindung. </li></ol></li><li> Datenanalyse <ol><li> Wählen niedrigen und hohen Frequenzbereiche bei der Berechnung der extrahierten Werte für die nicht zu benutzenadhärenten Zellen. </li><li> Wählen Driftkorrektur, um die lineare Veränderung der Ausgangsimpedanzmessungen über die Zeit zu korrigieren. </li><li> Wählen Sie die Datenfilterung, um Variationen in der kinetischen Gangmessung durch elektronische Rauschen und Verbindung zusätzlich zu reduzieren. </li><li> Wählen Sie die Max-Min-Methode für das Gesamtanalysezeit. </li><li> Exportieren von Daten in Excel unter der Option Plattenformat. </li><li> Berechnen delta G (&amp;Dgr; G) durch Subtrahieren der durchschnittlichen Größe der Reaktion auf Stimulation Gi (RMGI) aus dem Mittelwert der Antwort Größenordnung Gs Stimulation (RMG) unter Verwendung der folgenden Formel: &amp;Dgr; G = RMGI - RMGs </li><li> Der prozentuale Anteil der fache Wirkung (Fe) von OPN auf Gi-vermittelte Reaktion durch Division der durchschnittlichen Größe der Antwort auf Gi Stimulation in Gegenwart von OPN (RmGiOPN) mit der mittleren Größe der Reaktion auf die Stimulation in Anwesenheit von PBS (GI RmGiPBS) unter Verwendung der folgenden Formel: Fe = 100 x (RmGiOPN / RmGiPBS) </li><li> Siehe TLage 2, um Patienten zu klassifizieren. </li></ol></li></ol>

<ol>
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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays.">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8 (2), 219-227 (2010).</li><li>Akoume, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+Gi-coupled+receptor+signaling+occurs+in+adolescent+idiopathic+scoliosis.">Disrupted Gi-coupled receptor signaling occurs in adolescent idiopathic scoliosis.</a> J. Clin. Invest. , (2013).</li></ol>

Diese Arbeit führte zu mehreren Patenten halten von Sainte-Justine University Hospital und viele andere sind in mehreren Ländern angemeldet. Fourth Dimension Spine LLC ist exklusiver Lizenznehmer von Sainte-Justine University Hospital.

Wir haben eine detaillierte Prozedur eines zellbasierten Prognosetest für idiopathische Skoliose, die für mononukleare periphere Blutzellen (PBMCs) wurden frisch isolierte oder konservierte für bis zu einem Jahr in flüssigem Stickstoff eingefroren beschrieben. Da mit frisch isolierten PBMCs ist umständlich beim Testen große Anzahl von Personen wurde das Verfahren mit gefrorenen PBMCs, die eine praktische Alternative in der klinischen Einstellung bieten vorgestellt. Doch Probleme mit Zellverklumpung nach dem Auftauen wurden die auftreten, wenn gefrorene PBMCs wurden ursprünglich verwendet, was manchmal zu Inter-Assay-Variabilität. Um Assay-Reproduzierbarkeit zu maximieren, empfehlen wir, die Vermeidung von Frost-Tau-Zyklus und mit der gefrorenen Probe nur einmal. Das Verfahren ist sehr einfach und ermöglicht eine genaue Erfassung von defekten Gi-Protein-Funktion in einer kurzen Zeit. Mit diesem Verfahren können asymptomatisch und skoliotischen Kinder leicht eingestuft werden, ihre klinischen Ergebnisse besser vorherzusagen, ohne Gefahr für ihre Gesundheit. HoWever, bei der Durchführung Einstufung nach dem Grad der maximalen Reaktion auf Gi-Stimulation im Vergleich zu den gesunden Kontrollpersonen 12, mehrere Anforderungen für die Kontrollpersonen sollten erfüllt werden. In der Tat, um einen angemessenen Vergleich Kohorte haben, die Kontrollpersonen müssen Alter und Geschlecht abgestimmt sein, nicht auf jede Art von Medikamenten zu sein, und bieten privaten Informationen wie Vergangenheit einzelne / familiäre Krankengeschichte. Diese Anforderungen können ein wichtiges Hindernis für die Einstellung von Kontrollpersonen darstellen. Daher Klassifikation durch Ausführen der Grad der Ungleichheit zwischen Ansprechen auf Gi und G-Protein-Stimulation bei demselben Individuum ist ideal, um die Notwendigkeit der Verwendung von Steuersubjekten zu beseitigen. Die Verwendung der CDS-basierten System, um dieses Prognosetest durchzuführen ist im Hinblick auf gleichzeitig eine Gi-und Gs-vermittelte Zellreaktionen im gleichen Assay signifikant. Obwohl viele Patienten ohne Uhr klassifiziert werdenbiguity mit der für diesen Test festDynamikBereich, eine kleine Anzahl von Patienten werden Werte an der Grenze der Bereiche zeigen, wie die Ergebnisse des vorliegenden Berichts dargestellt. Diese Personen zu unterscheiden, haben wir die Bewertung der Wirkung von OPN auf Gi Reaktion auf Stimulation durch den Nachweis, dass OPN induziert eine differentielle Wirkung auf Gi-vermittelte zelluläre Antwort auf die drei funktionellen Gruppen eingeführt. Tatsächlich haben wir festgestellt, dass in Gegenwart von OPN, Gi Antwort auf Erhöhungen der Stimulations FG1, FG2, während es in und FG3 abnimmt, in einem höheren Ausmaß in FG2. Trotz der hohen Kosten von OPN ist die Verwendung dieses Chemokin wichtig, eindeutigen Fällen zu unterscheiden, und somit die Genauigkeit der Klassifizierung Assay. Hat dieser Test jedoch den Nachteil, daß ein Minimum von 1,5 × 10 5 Zellen pro Vertiefung erforderlich ist, um die zelluläre Antwort mit der CDS-basierten System unter unseren experimentellen Bedingungen beobachtet. Bestimmte Patientenproben nicht eine ausreichende Anzahl von habenZellen getestet werden. In diesem Fall ist es notwendig, die Patienten für weitere Blutentnahme, die für die Medizin-und Laborpersonal besorgniserregend für Familien und frustrierend sein kann zu erinnern. Prospektive Studien werden in unserem Labor geplant, um dieses Problem anzugehen. Dennoch setzt das aktuelle Protokoll auf einfache und bewährte Methoden, um Zellen herzustellen, während der Tests mit einem validierten markierungsfreie System 13, 14, um Antworten der Zellen zu überwachen automatisiert. Die Testplattform ist relativ preiswert, wenn sie mit genetischen Plattform für die Prognose von anderen Krankheiten verfügbar verglichen. Auch die Kosten für alle Einwegmaterialien, einschließlich der Blutsammelröhrchen, Tipps, die besondere Elektroden Mikrotiterplatten, sowie konische und Eppendorf-Röhrchen, nicht sehr teuer ist und bei weniger als 3.000 $ geschätzt, um eine Prüfung auf etwa tausend Patienten abzuschließen. Obwohl diese Schätzung nicht enthalten vor allem Kosten für die Vorbereitung von Probenund die Durchführung der Prüfung, bleibt dieser Test deutlich günstiger als Next-Generation-Sequencing-Plattformen. Bemerkenswert ist nicht nur die Kosten gegenüber genetischen Plattformen, aber insbesondere auf dem Gebiet der AIS verwandt ist, ist die Kosten für radiologische Bildgebung verbunden. Heute sind mehr als eine Million Kinder in den USA etwa 100.000 Kinder in Kanada mit idiopathischen Skoliose diagnostiziert, und die Gesamtkosten der Diagnose und Überwachung von Kindern, die von der Skolioseröntgenaufnahme als 2,5 Milliarden Dollar pro Jahr in Nordamerika. Somit wäre zu erwarten zellbasierten Assay-Verfahren für Routineuntersuchungen und Überwachung von Kindern mit idiopathischen Skoliose ohne Gesundheitsrisiko und kostengünstiger zu sein.

Idiopathische Skoliose ist eine Fehlstellung der Wirbelsäule unbekannter Ursache in der Regel als eine seitliche Krümmung größer als 10 Grad begleitet von einer Wirbelrotation 1 definiert. Die Krankheit betrifft 4% der pädiatrischen Population und wird am häufigsten im Alter zwischen 9 und 13 Jahren zwischen 2,3,4 diagnostiziert. Die Diagnose ist in erster Linie der Ausgrenzung und erst nach Ausschluss anderer Ursachen von Wirbelsäulenverformung, wie etwa Wirbelfehlbildung, neuromuskuläre Erkrankungen oder syndromale gemacht. Traditionell wird die trunkal Asymmetrie von Adams Vorbeugen Test ergab, und mit Skoliometer während der körperlichen Prüfung 5 gemessen. Die Diagnose kann dann durch radiologische Beobachtung der Kurve und der Winkelmessung unter Verwendung des Cobb-Methode 6 bestätigt werden. Einmal diagnostiziert, ist das Hauptanliegen für Ärzte in der Verwaltung skoliotischen Kinder, ob die Kurve weiter voran. Tatsächlich ist der Kurvenverlauf oft unvorhersehbar undist häufiger bei Mädchen als bei Jungen beobachtet, 7. Wenn unbehandelt, kann die Kurve dramatisch fortschreiten, wodurch erhebliche körperliche Missbildung und sogar Herz-Lungen-Probleme. Diese Manifestationen lebensbedrohlich werden, wenn die Kurve 70 ° 8,9 übersteigt. Die aktuellen Behandlungsmöglichkeiten zu verhindern oder zu stoppen Kurvenverlauf sind Verstrebungen und Chirurgie. In der Regel ist für die Reizkurven zwischen 25-40 ° empfohlen, während der Operation ist für Kurven größer als 45 ° oder reagieren nicht auf Verstrebungen vorbehalten. Ungefähr 10% der Kinder mit idiopathischer Skoliose diagnostiziert Kurvenverlauf erfordern korrigierende Eingriffe 10. Derzeit gibt es keine bewährte Methode oder Test zur Verfügung, um diese Kategorie von Patienten zu identifizieren. Dementsprechend werden alle Kinder diagnostiziert, mehrere Röntgenaufnahmen über mehrere Jahre unterzogen, in der Regel, bis sie Skelettreife zu erreichen. Es wird geschätzt, dass die typischen Patienten mit Skoliose wirdetwa 22 radiologischen Untersuchungen über einen Zeitraum von 3 Jahren 11. Wegen der möglichen Gefahr der Mehrfachröntgenuntersuchungen, die alternative Ansätze, durch die Durchführung der Prognose der idiopathischen Skoliose ohne dass Kinder auf ionisierende Strahlung sind stark erwünscht. Mit der Absicht, diesen Bedarf haben wir vorher eine zellbasierte Screening-Test entwickelt als prognostischer Test, um die asymptomatischen Kindern früher erkennen die Gefahr der Entwicklung idiopathischen Skoliose. Der Test sagt die klinischen Ergebnisse in beiden betroffenen Kinder asymptomatisch und durch Untersuchung der Funktionszustand der Gi-Proteine ​​und Klassifizieren von Kindern in drei Funktionsgruppen (FG1, FG2 und FG3) entsprechend dem Grad der maximalen Reaktion auf Stimulation 12 Gi-Protein, wie durch CDS gemessen -basierten System. Dieses System wird weitgehend verwendet, um die Signaltransduktion durch G-Proteine ​​in verschiedenen Zelltypen 13,14,15,16 beurteilen. Es liefert Informationen über dieGesamt integriert Reaktion der Zellen auf die Außenreize durch Messen von Änderungen in der Impedanz nach der Aktivierung von Zelloberflächenrezeptoren. Zellen werden in Mikrotiterplatten ausgesät, die Elektroden enthalten, am Boden der Vertiefungen und das System legt eine kleine Spannung, die extrazelluläre und trans Ströme induzieren. Nach Injektion der Verbindung in den Brunnen, sind Zelloberflächenrezeptoren stimuliert und Signaltransduktion Ereignisse eintreten, die zu zellulären Veränderungen, die den Fluss von extrazellulären und transzellulären Ströme beeinflussen und damit die gemessene Größe beeinflussen. Mit diesem Ansatz werden die Skoliosepatienten und Kinder ein höheres Risiko der Entwicklung von Skoliose sind weniger auf Gi-Protein Stimulation, wenn sie mit gesunden Kontrollpersonen verglichen und die Einstufung auf dem Prozentsatz der Reduktionsgrad relativ zur Kontrollgruppe basiert. Die Klassifizierungsbereiche sind zwischen 10 und 40% für FG3, 40 und 60% für FG2, und 60 und 90% für FG1 12 befestigt. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; In jüngerer Zeit haben wir diesen Ansatz zeigt, dass die drei funktionellen Gruppen eindeutig entsprechend dem Profil des Ungleichgewichts zwischen Abhängigkeit und Gi Gs Stimulation unterschieden werden modifiziert. Tatsächlich fanden wir, dass als Reaktion auf Stimulation Gi überwog in FG3, während keine offensichtliche Ungleichgewicht in FG2 beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten FG1 Vorherrschaft für die Reaktion auf Gs Stimulation. Darüber hinaus haben wir den Beweis, dass die Patienten FG2 gehören, sind mehr an der Gefahr der fortschreit bis zur Operation benötigen 17 vorgesehen. Die Präzision dieser Einstufungstest weiter durch den Nachweis einer Differenz Wirkung von Osteopontin (OPN) auf Gi Reaktion auf Stimulation unter funktionellen Gruppen verbessert. Hier dokumentieren wir die einzelnen Schritte der experimentellen und analytischen Verfahren dieser Funktionsprüfung, wie sie derzeit in unserem Labor durchgeführt.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>350-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Therno Scientific Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Plaque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohemagglutinin</td>
			<td>Invitrogen (Gibco)</td>
			<td>10576-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Osteopontin</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc</td>
			<td>1433-OP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somatostatin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>301-06-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Eppendorf tubes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>24-MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey small sample 96W microplate</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1026496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey tips</td>
			<td>Cybio</td>
			<td>OL3800-25-559N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut pierceable seals</td>
			<td>Excel Scientific, Inc</td>
			<td>XP-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicell XR</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>1284</td>
			<td>Class II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CY5093570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89032-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMIL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51019557</td>
			<td>5% CO2 at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1019185</td>
			<td>CDS-based instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-based assay protocol for the prognostic prediction of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy

Dieses Protokoll beschreibt die experimentelle und analytische Verfahren für einen Assay auf Zellbasis in unserem Labor als Funktionstest zur Vorhersage der idiopathischen Skoliose bei asymptomatischen betroffenen Kinder und vorauszusagen. Der Test besteht aus der Bewertung der Funktionszustand und Gi Gs-Proteine ​​in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), die durch Mobil dielektrischen Spektroskopie (CD), unter Verwendung eines automatisierten CDS-basierten Instrument und die Klassifizierung von Kindern in drei Funktionsgruppen (FG1 , FG2, FG3) in Bezug auf das Profil des Ungleichgewichts zwischen dem Grad der Reaktion auf und Gi Gs-Proteine ​​Stimulation. Die Klassifizierung wird durch die unterschiedliche Wirkung von Osteopontin (OPN) auf Reaktion auf Stimulation Gi zwischen Gruppen und die starke Progression der Krankheit wird durch FG2 verwiesen bestätigt. Ungefähr wird ein Volumen von 10 ml Blut benötigt, um PBMCs durch Ficoll-Gradienten und Zellen extrahiert werden dann in flüssigem Stickstoff gelagert. Die ausreichende Anzahl von PBMC zur Durchführung des Assays nach zwei Tagen Zellkultur erhalten. Im Wesentlichen werden die Zellen zunächst mit phytohemmaglutinin (PHA) inkubiert. Nach 24 h Inkubation wird das Medium durch eine PHA-freien Kulturmedium für zusätzliche 24 Stunden vor der Zellaussaat und OPN-Behandlung ersetzt. Zellen werden dann spektroskopisch ihre Reaktionen auf Somatostatin und Isoproterenol, die jeweils zu aktivieren und Gi Gs-Proteine ​​durch ihre verwandten Rezeptoren gescreent. Sowohl Somatostatin und Isoproterenol gleichzeitig mit integrierter Fluidik-System injiziert und die Reaktionen der Zellen werden für 15 min überwacht. Der Assay kann mit frischem oder gefrorenem PBMCs durchgeführt werden und das Verfahren wird in 4 Tagen abgeschlossen.

Lebensfähigkeit der Zellen war bei allen Proben mit Werten konsistent in dem Bereich von 86 und 96% vergleichbar. Im Gegensatz dazu wurden große Schwankungen bei den Zellzahlen unter den Proben (Tabelle 3) beobachtet. Von den 32 Proben, zwei hatten unzureichende Anzahl von Zellen und nicht klassifiziert. Ein Beispiel der Ergebnisse der Funktionsklasse nach dem Grad des Ungleichgewichts zwischen Gs und Gi-Signalisierung ist in Fig. 3 gezeigt. Die vertikale Achse dieser Figur ist in drei Abschnitte Abgrenzung der funktionellen Gruppen mit dynamischen Bereiche als&gt; +10 FG3 fest zwischen +10 und -10 für FG2 &lt;-10 für FG1 unterteilt, und schließlich. Unter 30 Patienten hier getestet wurden 14, 6, und 5 Patienten deutlich in FG3 klassifiziert, FG2, FG1 und jeweils während fünf Patienten, insbesondere 345, 353, 370, 371 und 382 wurden bei der Grenzbereiche. Die Bewertung der Auswirkungen auf die OPN Reaktion auf Stimulation Gi hatte ergeben, dass OPN erhöht die Antwort in pa353 und 371 Patienten. Im Gegensatz dazu war die Antwort von mehr als 50% der Patienten 345 und 382 und von weniger als 50% der Patienten 370 folgenden rOPN Behandlung reduziert. Also, nach unseren Einstufungskriterien (Tabelle 2), waren wir in der Lage, Patienten, 353 und 371 in FG1 kategorisieren, 345 und 382 Patienten in FG2 und Patienten 370 in FG3. Parallel dazu wurden alle Patienten für ihre Reaktion auf Gi-Protein Stimulation gezeigt und im Vergleich zu Kontrollpersonen. Wie erwartet, waren alle Patienten weniger auf als Kontrollpersonen und Patienten in der gleichen funktionellen Gruppe durch unser neues Verfahren klassifiziert zeigten ähnliche Niveaus der maximalen Reaktion (Abbildung 5). Darüber hinaus Unterschiede zwischen den Patienten der einzelnen funktionellen Gruppe war im Einklang mit unseren klassischen Bereich der Klassifikation 12, Validierung unserer neuen Verfahren. Die Klassifizierung einer großen Kohorte von Patienten skoliotischen regelmäßig in unserem Spezialklinik in Sainte-Justine-Krankenhaus verfolgt hat, ergab, dass die dreifunktionellen Gruppen wurden in ähnlicher Weise bei den mittelschweren Fällen verteilt, während der FG2 vorherrschend war unter schweren Fällen (Abbildung 6), Identifizierung von Patienten in diese funktionelle Gruppe kategorisiert wie ein höheres Risiko für schwere Fortschreiten der Krankheit und darauf hinweist, dass diese Klassifizierung Test sinnvoll sein, in der Prognose der idiopathischen Skoliose. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="5"> Lösung A </td><td> Wasserfreie D-Glucose </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> 0,05 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0,98 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5,4 mM </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 145 mM </td></tr><tr><td> Lösung B </td><td> NaCl </td><td> 140 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> Balanced Salt Solution (BSS) </td><td> Lösung A </td><td> 1 Volumen </td></tr><tr><td> Lösung B </td><td> 9 Volumen </td></tr><tr><tdrowspan = &quot;3&quot;&gt; Komplette Medien </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-Antimykotikum </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td rowspan="3"> Ergänzende Medien </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-Antimykotikum </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td rowspan="4"> Einfrieren Medien </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-Antimykotikum </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 20% </td></tr><tr><td rowspan="4"> PHA Medien </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibiotika-Antimykotikum </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Phytohämaglutinin </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. WesentlicheLösungen. <table border="1"><tbody><tr><td> Dynamische Bereiche mit &amp;Dgr; G </td><td> Funktionelle Gruppen </td><td> Dynamische Bereiche mit Fe </td></tr><tr><td> &amp;Dgr; G &lt;-10 </td><td> FG1 </td><td> Fe&gt; 100% </td></tr><tr><td> -10 &lt;&amp;Dgr; G &lt;10 </td><td> FG2 </td><td> Fe &lt;50% </td></tr><tr><td> &amp;Dgr; G&gt; 10 </td><td> FG3 </td><td> 50% &lt;Fe &lt;95% </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Kategorisierung von funktionellen Gruppen nach mit &amp;Dgr; G und Fe etablierten dynamischen Bereichen. <table border="1"><tbody><tr><td> Patienten </td><td> Die Lebensfähigkeit (%) </td><td> Zellkonzentration (× 10 6 / ml) </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 343 </td><td> 88,7 </td><td> 11,64 </td><td></td></tr><tr><td> 344 </td><td> 90,5</td><td> 13,6 </td><td></td></tr><tr><td> 345 </td><td> 94,4 </td><td> 8,54 </td><td></td></tr><tr><td> 346 </td><td> 94,3 </td><td> 25.79 </td><td></td></tr><tr><td> 347 </td><td> 94,2 </td><td> 27.36 </td><td></td></tr><tr><td> 348 </td><td> 94,6 </td><td> 8,52 </td><td></td></tr><tr><td> 349 </td><td> 91,2 </td><td> 0,82 </td><td> Unzureichende Anzahl von Zellen </td></tr><tr><td> 350 </td><td> 90,3 </td><td> 8,92 </td><td></td></tr><tr><td> 352 </td><td> 92,6 </td><td> 8,28 </td><td></td></tr><tr><td> 353 </td><td> 91,3 </td><td> 12.75 </td><td></td></tr><tr><td> 354 </td><td> 86,9 </td><td> 7,62 </td><td></td></tr><tr><td> 355 </td><td> 91,2 </td><td> 7,51 </td><td></td></tr><tr><td> 356 </td><td> 90,3 </td><td> 9,36 </td><td></td></tr><tr><td> 358 </td><td> 95,1 </td><td> 16.94 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> 359 </td><td> 92,3 </td><td> 13.89 </td><td></td></tr><tr><td> 360 </td><td> 89,4 </td><td> 7,67 </td><td></td></tr><tr><td> 361 </td><td> 93,5 </td><td> 7,84 </td><td></td></tr><tr><td> 365 </td><td> 86,5 </td><td> 2.2 </td><td> Unzureichende Anzahl von Zellen </td></tr><tr><td> 368 </td><td> 92,6 </td><td> 15.69 </td><td></td></tr><tr><td> 369 </td><td> 93,4 </td><td> 10,9 </td><td></td></tr><tr><td> 370 </td><td> 92,5 </td><td> 19.93 </td><td></td></tr><tr><td> 371 </td><td> 88,8 </td><td> 10.68 </td><td></td></tr><tr><td> 374 </td><td> 93,9 </td><td> 16.86 </td><td></td></tr><tr><td> 376 </td><td> 92,9 </td><td> 15,67 </td><td></td></tr><tr><td> 377 </td><td> 93,1 </td><td> 9,99 </td><td></td></tr><tr><td> 378 </td><td> 93,6 </td><td> 13.57 </td><td></td></tr><tr><td> 379 &lt;/ Td&gt; <td> 92,6 </td><td> 19,86 </td><td></td></tr><tr><td> 380 </td><td> 91,1 </td><td> 8,46 </td><td></td></tr><tr><td> 381 </td><td> 93,9 </td><td> 14,82 </td><td></td></tr><tr><td> 382 </td><td> 92,1 </td><td> 23.06 </td><td></td></tr><tr><td> 383 </td><td> 92,9 </td><td> 11.82 </td><td></td></tr><tr><td> 384 </td><td> 89,1 </td><td> 7,73 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Prozent Lebensfähigkeit und Zellkonzentration als mit einem automatisierten Zellzähler und Lebensfähigkeit Analysator bestimmt. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig1.jpg" /> Abbildung 1. Entwurf für Zellaussaat. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig2.jpg" /> 2.Entwerfen Sie für die Abgabe Verbindungen. <img alt="Fig. 3" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig3.jpg" /> Abbildung 3. Dynamischer Bereich der funktionellen Klassifikation mit der CDS-basierten System. Graph zeigt Werte für den Grad des Ungleichgewichts zwischen Reaktionen auf Gs und Gi Stimulation in PBMCs von Patienten mit idiopathischer Skoliose erhalten. -Werte wurden durch die CDS-basiertes System in Antwort auf 10 uM Somatostatin und Isoproterenol gemessen. Jeder Punkt stellt den &amp;Dgr; G der beiden Reaktionen in zweifacher Ausfertigung. <img alt="Fig. 4" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig4.jpg" /> Abbildung 4. Wirkung von rOPN auf Antwort auf Gi Stimulation in PBMCs. 18 h wurden die Zellen unter Serummangel in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,5 ug / ml rOPN und dann mit 10 angeregt<html> 56, M von Somatostatin-Gi-vermittelte zelluläre Antwort auslösen. Daten im Diagramm wurden vom Maximum-Minimum-Impedanz erzeugt und entsprechen dem Mittelwert der Reaktion im Duplikat. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig5.jpg" /> Abbildung 5. Funktionszustand von Gi-Protein in PBMCs von Kontrolle und scoliostic Themen. PBMCs von Probanden und Patienten wurden skoliotischen steigenden Konzentrationen von Somatostatin an Gi-Proteine ​​über endogene Somatostatin-Rezeptor stimulieren ausgesetzt. Die zelluläre Reaktion wurde durch CDS-basiertes System, wie in dem Abschnitt Verfahren beschrieben, gemessen. Kurven wurden von Maximum-Minimum-Impedanz erzeugt. Jede Kurve stellt die nichtlineare Regression. Daten wurden auf maximale Antwort in Zellen aus der Kontrollgruppe normalisiert und jeder Punkt entspricht dem Mittelwert der Reaktion im Duplikat./ 50768/50768fig5large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen. <img alt="Fig. 6" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig6.jpg" /> 6. Verteilung funktioneller Gruppen unter den verschiedenen Phasen der Skoliose. Eine große Kohorte von 794 Patienten mit Skoliose moderat (Krümmungen zwischen 10-44 ° C) und 162 schwere (Krümmung größer als 45 °) Fällen regelmäßig in Sainte-Justine-Krankenhaus folgte, wurden nach dem Grad des Ungleichgewichts zwischen Reaktion auf Gi und Gs klassifiziert Stimulation. Reaktionen wurden durch die CDS-basiertes System in Antwort auf 10 uM Somatostatin und Isoproterenol gemessen.

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Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

Eine strukturierte Protokoll für ein Assay auf Zellbasis als Funktionstest zur Vorhersage der idiopathischen Skoliose vorher mit Mobil dielektrischen Spektroskopie (CDS) dargestellt. Der Assay kann mit frischem oder gefrorenem peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) durchgeführt werden und das Verfahren wird in 4 Tagen abgeschlossen.

Zellbasierte Assay-Protokoll für die prognostische Prognose der idiopathischen Skoliose Mit Cellular dielektrischer Spektroskopie

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

10.5K Aufrufe.  Sainte-Justine University Hospital Research Center.  Eine strukturierte Protokoll für ein Assay auf Zellbasis als Funktionstest zur Vorhersage der idiopathischen Skoliose vorher mit Mobil dielektrischen Spektroskopie (CDS) dargestellt. Der Assay kann mit frischem oder gefrorenem peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) durchgeführt werden und das Verfahren wird in 4 Tagen abgeschlossen. 

Serie: Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain (PPOP)

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative short-term and long-term effects on the mother. Prior to women undergoing surgery, can we predict who is at risk for developing significant postoperative pain and potentially prevent or minimize its negative consequences? These are the fundamental questions that a team from the University of Washington, Stanford University, the Catholic University in Brussels, Belgium, Santa Joana Women's Hospital in S&atilde;o Paulo, Brazil, and Rambam Medical Center in Israel is currently evaluating in an international research collaboration. The ultimate goal of this project is to provide optimal pain relief during and after cesarean section by offering individualized anesthetic care to women who appear to be more 'susceptible' to pain after surgery.
A significant number of women experience moderate or severe acute post-partum pain after vaginal and cesarean deliveries. 1 Furthermore, 10-15% of women suffer chronic persistent pain after cesarean section. 2 With constant increase in cesarean rates in the US 3 and the already high rate in Brazil, this is bound to create a significant public health problem. When questioning women's fears and expectations from cesarean section, pain during and after it is their greatest concern. 4 Individual variability in severity of pain after vaginal or operative delivery is influenced by multiple factors including sensitivity to pain, psychological factors, age, and genetics. The unique birth experience leads to unpredictable requirements for analgesics, from 'none at all' to 'very high' doses of pain medication. Pain after cesarean section is an excellent model to study post-operative pain because it is performed on otherwise young and healthy women. Therefore, it is recommended to attenuate the pain during the acute phase because this may lead to chronic pain disorders. The impact of developing persistent pain is immense, since it may impair not only the ability of women to care for their child in the immediate postpartum period, but also their own well being for a long period of time.
In a series of projects, an international research network is currently investigating the effect of pregnancy on pain modulation and ways to predict who will suffer acute severe pain and potentially chronic pain, by using simple pain tests and questionnaires in combination with genetic analysis. A relatively recent approach to investigate pain modulation is via the psychophysical measure of Diffuse Noxious Inhibitory Control (DNIC). This pain-modulating process is the neurophysiological basis for the well-known phenomenon of 'pain inhibits pain' from remote areas of the body. The DNIC paradigm has evolved recently into a clinical tool and simple test and has been shown to be a predictor of post-operative pain.5 Since pregnancy is associated with decreased pain sensitivity and/or enhanced processes of pain modulation, using tests that investigate pain modulation should provide a better understanding of the pathways involved with pregnancy-induced analgesia and may help predict pain outcomes during labor and delivery. For those women delivering by cesarean section, a DNIC test performed prior to surgery along with psychosocial questionnaires and genetic tests should enable one to identify women prone to suffer severe post-cesarean pain and persistent pain. These clinical tests should allow anesthesiologists to offer not only personalized medicine to women with the promise to improve well-being and satisfaction, but also a reduction in the overall cost of perioperative and long term care due to pain and suffering. On a larger scale, these tests that explore pain modulation may become bedside screening tests to predict the development of pain disorders following surgery.

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain PPOP

Diffuse noxious inhibitory control, temporal summation and wound hyperalgesia testing are demonstrated in the obstetric patient. These tests evaluate inhibitory and excitatory mechanisms of pain processing and are here utilized to evaluate endogenous analgesia at different time-points during pregnancy and the peripartum period to help reveal individual s risk for persistent pain.

Ein experimentelles Paradigma für die Vorhersage der postoperativen Schmerzen (PPOP)

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative ...

Forschung

Medizin

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Eine Methode zur Murine Islet Isolation und subkapsulären Nierentransplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

Fokus Formation: Ein Assay auf Zellbasis, um das onkogene Potential eines Gens zu bestimmen

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and negatively impact patient quality of life and long term survival. Advances in the understanding of the biological pathways associated with normal tissue toxicities have allowed for the development of interventional drugs, however, current response studies are limited by a lack of quantitative metrics for assessing the severity of skin reactions. Here we present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe the instrumentation design of the DOS system as well as the inversion algorithm for extracting the optical parameters. Finally, to demonstrate clinical utility, we present representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema and compare the results with a commonly employed visual scoring. The described DOS method offers an objective, high through-put evaluation of skin toxicity via functional response that is translatable to the clinical setting.

We present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe DOS instrumentation design, optical parameters extraction algorithms and the animal handling procedures required to yield representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema.

Diffuse Optische Spektroskopie zur quantitativen Beurteilung Akute ionisierender Strahlung induzierte Hauttoxizität Mit einem Maus-Modell

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently inhibit viral replication, they have no direct effect on the expression of viral proteins transcribed from a viral covalently closed circular DNA (cccDNA). As high viral antigen load may play a role in this chronic and HBV-related carcinogenesis, the goal of HBV treatment is to eradicate viral proteins. HBV regulatory protein X (HBx) binds to the host DNA damage-binding protein 1 (DDB1) protein to degrade structural maintenance of chromosomes 5/6 (Smc5/6), resulting in activation of viral transcription from cccDNA. Here, using a split luciferase complementation assay system, we present a comprehensive compound screening system to identify inhibitors of the HBx-DDB1 interaction. Our protocol enables easy detection of interaction dynamics in real time within living cells. This technique may become a key assay to discover novel therapeutic agents for treatment of HBV infection.

Here, we present a method for screening anti-hepatitis B viral agents that inhibit the HBx-DDB1 interaction using a split luciferase assay system. This system allows easy detection of protein-protein interactions and is suitable for identifying inhibitors of such interactions.

Identifizieren von Inhibitoren der HBx-DDB1-Wechselwirkung mit einem Split Luciferase Assay System

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

Quantification of Optic Nerve Cross Sectional Area on MRI: A Novel Protocol using Fiji Software

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic nerve cross-sectional assessment and quantification using 3 T MRI for image acquisition and ImageJ's Fiji software for image processing quantification. Image acquisition was performed using 3 T MRI, with proper instructions for the patient to ensure straight fixation during imaging. A T2-weighted fat suppressed sequence was used. A coronal cut taken 3 mm behind the globe and perpendicular to the optic nerve axis should be uploaded to the software. Using the threshold function, the white matter area of the optic nerve is selected and quantified, thus, eliminating inter-individual measurement bias. We also described the normal limits for the optic nerve cross-sectional area according to age, based on previously published literature. We used the described protocol to assess optic nerve of a suspected glaucoma patient. The optic nerve cross-sectional area was found to be within the normal limits, a finding further confirmed via optical coherence tomography of the optic nerve.

We provided a detailed protocol for a standardized method of optic nerve assessment and quantification using MRI, utilizing a widely available imaging sequence, and open access software for image analysis. Following this standardized protocol would provide meaningful data for comparison between different patients and different studies.

Quantifizierung der Querschnittsfläche des Sehnervs in der MRT: Ein neuartiges Protokoll mit Fidschi-Software

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic ...

A Real-World High-Intensity Interval Training Protocol for Cardiorespiratory Fitness Improvement

High-Intensity Interval Training (HIIT) has emerged as an interesting time-efficient approach to increase exercise adherence and improve health. However, few studies have tested the efficiency of HIIT protocols in a &#34;real world&#34; setting, e.g., HIIT protocols designed for outdoor spaces without specialized equipment. This study presents a &#34;real world&#34; training protocol, named &#34;beep training&#34;, and compares the efficiency of a HIIT regiment versus a traditional long-duration Moderate-Intensity Continuous Training (MICT) regiment using this beep training protocol on VO2 max of overweight untrained men. Twenty-two subjects performed outdoor running with MICT (n = 11) or HIIT (n = 11). Cardiorespiratory fitness was assessed before and after training protocols using a metabolic analyzer. Both training protocols were performed 3 days a week for 8 weeks using the Beep Test results. The MICT group performed the exercise program at 60%-75% of the maximum speed of the 20 m shuttle test (Vmax) and with a progression of the distance of 3,500-5,000 m. The HIIT group performed the interval exercise with 7-10 bouts of 200 m at 85%-100% of the maximum speed of the 20 m shuttle test (Vmax), interspersed with 1 min of passive recovery. Although the HIIT group presented a significantly lower training volume than the MICT group (p &#60; 0.05) after 8 weeks of beep training, HIIT was superior to MICT in improving VO2 max (MICT: ~4.1%; HIIT: ~7.3%; p &#60; 0.05). The &#34;real world&#34; HIIT regiment based on beep training protocol is a time-efficient, low-cost, and easy-to-implement protocol for overweight untrained men.

This study presents a low-cost and easy-to-implement "real world" high-intensity interval training (HIIT) protocol for scientific research and discusses its efficiency for cardiorespiratory fitness.

Ein reales hochintensives Intervalltrainingsprotokoll zur Verbesserung der kardiorespiratorischen Fitness

High-Intensity Interval Training (HIIT) has emerged as an interesting time-efficient approach to increase exercise adherence and improve health. However, ...

Network Pharmacology Prediction and Metabolomics Validation of the Mechanism of Fructus Phyllanthi against Hyperlipidemia

Hyperlipidemia has become a leading risk factor for cardiovascular diseases and liver injury worldwide. Fructus Phyllanthi (FP) is an effective drug against hyperlipidemia in Traditional Chinese Medicine (TCM) and Indian Medicine theories, however the potential mechanism requires further exploration. The present research aims to reveal the mechanism of FP against hyperlipidemia based on an integrated strategy combining network pharmacology prediction with metabolomics validation. A high-fat diet (HFD)-induced mice model was established by evaluating the plasma lipid levels, including total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C). Network pharmacology was applied to find out the active ingredients of FP and potential targets against hyperlipidemia. Metabolomics of plasma and liver were performed to identify differential metabolites and their corresponding pathways among the normal group, model group, and intervention group. The relationship between network pharmacology and metabolomics was further constructed to obtain a comprehensive view of the process of FP against hyperlipidemia. The obtained key target proteins were verified by molecular docking. These results reflected that FP improved the plasma lipid levels and liver injury of hyperlipidemia induced by a HFD. Gallic acid, quercetin, and beta-sitosterol in FP were demonstrated as the key active compounds. A total of 16 and six potential differential metabolites in plasma and liver, respectively, were found to be involved in the therapeutic effects of FP against hyperlipidemia by metabolomics. Further, integration analysis indicated that the intervention effects were associated with CYP1A1, AChE, and MGAM, as well as the adjustment of L-kynurenine, corticosterone, acetylcholine, and raffinose, mainly involving tryptophan metabolism pathway. Molecular docking ensured that the above ingredients acting on hyperlipidemia-related protein targets played a key role in lowering lipids. In summary, this research provided a new possibility for preventing and treating hyperlipidemia.

The present protocol describes an integrated strategy for exploring the key targets and mechanisms of Fructus Phyllanthi against hyperlipidemia based on network pharmacology prediction and metabolomics verification.

Netzwerk Pharmakologische Vorhersage und metabolomische Validierung des Mechanismus von Fructus phyllanthi gegen Hyperlipidämie

Hyperlipidemia has become a leading risk factor for cardiovascular diseases and liver injury worldwide. Fructus Phyllanthi (FP) is an effective drug ...

Nicht-invasive Biomarker-Entdeckung für die Tränenproteomik mittels LC-MS

A Protein Suspension-Trapping Sample Preparation for Tear Proteomics by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for several ocular diseases and conditions. The suspension trapping column has been reported to be an efficient and user-friendly sample preparation workflow for the broad application of downstream proteomic analysis. Yet, this strategy has not been well-studied in the analysis of human tear proteome. The present protocol describes an integrated workflow from clinical human tear samples to purified peptides for non-invasive tear protein biomarker research using mass spectrometry, which provides insights into disease biomarkers and monitoring when combined with bioinformatics analysis. A protein suspension trapping sample preparation was applied and demonstrated the discovery of tear proteome with fast, reproducible, and user-friendly procedures, as a universal, optimized sample preparation for human tear fluid analysis. In particular, the suspension trapping procedure outperformed in-solution sample preparation in terms of peptide recovery, protein identification, and shorter sample preparation time.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung der Tränenflüssigkeitsanalyse unter Verwendung eines standardisierten Protokolls für die Proteomikforschung 

This protocol describes a method for collecting tear samples using Schirmer strips and an integrated quantitative workflow for discovering non-invasive tear protein biomarkers. The suspension trapping sample preparation workflow enables fast and robust tear sample preparation and mass spectrometric analysis, resulting in higher peptide recovery yields and protein identification than standard in-solution procedures.

Eine Proteinsuspensions-Trapping-Probenvorbereitung für die Tränenproteomik mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for ...