Die HBX-DDB1-Interaktion ist ein entscheidender Schritt zur Förderung der HPV-Transkription von cccDNA, so dass dieses Protokoll zu einem wichtigen Vorteil werden kann, um neue therapeutische Wirkstoffe für die HPV-Funktionshärtung zu entdecken. Unser Verfahren ist einfach und erfordert nur eine kurze Zeit zum Screenen. Die Interaktion, die ich mischen kann in Echtzeit erkannt werden, ohne dass eine Zelllyse erforderlich ist.
Darüber hinaus ist die Screening-Qualität mit einer hohen Z-Primzahl zufriedenstellend. Die Hemmung der HBX-DDB1-Wechselwirkung führt zur Wiederherstellung von Smc5/6, was zur Unterdrückung der HPV-Transkription, der Proteinexpression und der cccDNA-Produktion führt. Dieser neuartige Mechanismus der antiviralen Wirkung kann die Unzulänglichkeiten der aktuellen HPV-Therapien überwinden.
Protein-Protein-Wechselwirkungen sind eine wichtige Klasse von Wirkstoffzielen. Die hier beschriebene Split-Luciferase-basierte Säure, die auf die Wechselwirkungen zwischen viralen und HasS-Proteinen abzielt, kann eine neue Strategie zur Entwicklung von Heilmitteln für andere Infektionskrankheiten bieten. Obwohl unser Protokoll einfach und leicht verständlich ist, können einige Schritte ohne die visuelle Demonstration schwer reproduziert werden.
Daher wird die visuelle Demonstration eine große Hilfe sein, um unser Protokoll zu verstehen. Beginnen Sie damit, fünfmal 10 bis 5. HEK293T-Zellen in eine 100-Millimeter-Schale mit 10 Milliliter DMEM zu säen und sie über Nacht bei 37 Grad Celsius zu inkubieren. Verdünnen Sie am nächsten Tag jeweils ein Mikrogramm von HBx-LgBit und SmBit-DDB1, das DNA-Plasmide und DNA-Kondensationspuffer für ein Gesamtvolumen von 300 Mikrolitern ausdrückt.
Fügen Sie 16 Mikroliter Enhancer-Lösung hinzu und mischen Sie die Rohre durch Wirbeln für eine Sekunde. Inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für drei Minuten, dann fügen Sie 60 Mikroliter Transfektionreagenz. Wirbeln Sie die Röhre für 10 Sekunden, und inkubieren Sie die Probe für weitere acht Minuten.
In der Zwischenzeit das Medium aus der Schale mit den Zellen aspirieren und mit fünf MilliliterPVS waschen. Aspirieren Sie die PVS und fügen Sie sieben Milliliter DMEM hinzu. Fügen Sie drei Milliliter DMEM in das Rohr mit den Transfektionskomplexen, Pipette nach oben und unten, um zu mischen, und fügen Sie die Mischung zu den Zellen.
Dann inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid für 10 Stunden. Nach der Inkubation entfernen Sie das verbrauchte Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit fünf MilliliterpvS. Entfernen Sie die PVS bei einem Milliliter 0,25%Trypsin EDTA, und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, um sie zu lösen.
Fügen Sie als Nächstes vier Milliliter DMEM hinzu, und dispergieren Sie das Medium, indem Sie es mehrmals über die Oberfläche der Zellschicht pipetieren, und übertragen Sie die Suspension in ein Rohr. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 mal G für fünf Minuten, entsorgen Sie dann den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in einem Milliliter PVS wieder auf. Wiederholen Sie die Cetrifugation und entsorgen Sie den Überstand.
Dann, wieder aussetzen das Zellpellet mit gepufferten Zellkultur Medium ergänzt mit 10%FBS zu einer Saatdichte von einer Million Zellen pro Milliliter. 50 Mikroliter der Zellsuspension in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte geben und die Zellen für 10 Stunden in den 37-Grad-Celsius-Inkubator zurückbringen. Während die Zellen inkubieren, verdünnen Sie die Siebverbindungen und Lösungsmittel auf 13,5 X Konzentration.
Fügen Sie 12,5 Mikroliter Leuchtstoff substrat zu jedem Brunnen hinzu und brüten Sie die Platte für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Messen Sie die Grundbeleuchtung mit einem Luminometer, und fügen Sie fünf Mikroliter der Verbindungen und kontrollierte DMSO zu jedem Brunnen unmittelbar danach. Messen Sie die Lumineszenz alle 30 Minuten für zwei Stunden, und berechnen Sie dann die hemmende Wirkung der Verbindungen im Vergleich zur DMSO-Behandlung.
Die Signalliniensignale wurden gemessen, und das Signal-Hintergrund-Verhältnis wurde mit mehr als 80 berechnet. Die Z-Primzahl war größer als 0,5, was darauf hindeutet, dass dieses Assay-System für das Screening mit hohem Durchsatz akzeptabel ist. Durch die Festlegung der Schwelle auf mehr als 40% Hemmung im Vergleich zur DMSO-only-Kontrolle, Nitazoxanid wurde als Kandidatenmedikament identifiziert.
Zuvor haben wir Nitazoxanid als Inhibitor der HBX-DDB1-Wechselwirkung identifiziert, indem wir eine Reaktivitäts-Klein-Verbundbibliothek mit dieser Methode screening. Mit Nitazoxanid bestätigen wir, dass die Hemmung der HBX-DDB1-Wechselwirkung, die Reduktion der viralen Transkription und die nachfolgenden viralen Produktspiegel. Der optimale Teil der gespaltenen Luziferase, der zu einem Zielprotein verschmolzen wird, muss vorher bestimmt werden.
In diesem Fall lieferte HPX, das an der C-Endstation von HPX und DDB1 mit Small Bit am Endterminus von DDB1 verschmolz, die besten Ergebnisse.
