Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung und Verfolgung von interspezies bakteriellen Wechselwirkungen auf der Ebene der einzelnen Zellen im Laufe der Zeit. Dieser Hauptvorteil dieser Techniken ist seine Anwendbarkeit auf die Untersuchung bakterieller Wechselwirkungen, einschließlich Zellverfolgung, Genexpression und Lebensfähigkeitsfärbung. Zusätzlich können die Bedingungen geändert werden, um verschiedene Organismen zu untersuchen.
Zu Beginn bereiten Sie Agarose-Pads vor, indem Sie 2%niedrige Schmelzagarose in 10 Milliliter bakteriellen Wachstumsmedien in einem sauberen 50 Milliliter Erlenmeyer Kolben schmelzen. Mikrowelle den Kolben in kurzen Intervallen, bis die Agarose in Lösung ist, dann lassen Sie es in einem 50 Grad Celsius Wasserbad für mindestens 15 Minuten abkühlen. Richten Sie ein Mitgummi aus, das mit der Öffnung in einer 35-Millimeter-Schale ausgeschnitten ist, drehen Sie dann die Schale um und tippen Sie leicht auf das mit einem Spachtel ausgeschnittene Silizium, um es an der Schale zu befestigen und Luftblasen zu entfernen.
Sobald die Agarose abgekühlt ist, Pipette 915 Mikroliter geschmolzener Agarose in die Form und lassen Sie das Pad trocknen. Erwärmen Sie die Mikroskop-Umgebungskammer mindestens zwei Stunden vor dem Versuch auf die Versuchstemperatur. Bereiten Sie Feuchtigkeitstücher vor, indem Sie ein fusselfreies Tuch fest aufrollen.
Legen Sie das gerollte Tuch in eine sterile Petrischale und fügen Sie 500 Mikroliter steriles Wasser direkt zu den Tüchern hinzu. Die Tücher, Pads und eine sterile 35-Millimeter-Schale auf die Versuchstemperatur erwärmen, um alle Materialien auszuhalten. Sobald die Pads trocken sind, Pipette einen Mikroliter Co-Kultur gleichmäßig über den Boden einer vorgewärmten sterilen 35 Millimeter Glas Abdeckung Schale.
Entfernen Sie das aus der Agaroseform ausgeschnittene Silikon mit einer sterilen Pinzette, neigen Sie es zur Seite und schieben Sie einen leicht gebogenen Spachtel unter den Rand des Agarose-Pads, um es auf einen sterilen Petriplattendeckel zu fallen. Übertragen Sie das Pad auf die Schale mit den Bakterienzellen unten nach unten, indem Sie einen 90 Grad abgewinkelten Spachtel unter das Pad schieben und es auf den geimpften Deckelschlupf legen. Verwenden Sie den Spachtel, um das Pad bündig gegen die Abdeckung rutschen und drücken Sie vorsichtig alle Luftblasen.
Entfernen Sie überschüssige Feuchtigkeit aus dem feuchten Wischen und legen Sie es um den Rand der Schale, um sicherzustellen, dass es das Pad nicht berührt. Die Probe ist nun zur Bildgebung bereit. Richten Sie vor der inokulierten Pads das Mikroskop ein, indem Sie Farbbeleuchtung durchführen, um alle Bildrahmen auszurichten.
Sobald die geimpfte Schale fertig ist, sehen Sie sich die Schale mit 100X Objektiv und konzentrieren Sie sich auf die bakteriellen Ergebnisse. Klicken Sie auf die Phasenoption in der Bildverarbeitungssoftware, und passen Sie den Prozentsatz der dia LED-Lichtemitat an, indem Sie die Lichtquelle auswählen und die Leiste auf der Lichtprozentskala verschieben. Alternativ können Sie manuell eine Belichtungszeit eingeben.
Speichern Sie die Einstellungen für den Phasenkanal, indem Sie mit der rechten Maustaste auf den Phasenkanal klicken und die Option Aktuelles Mikroskop einstellen zuweisen auswählen. Wenn Sie Fluoreszenz verwenden, wählen Sie den Fluoreszenzkanal aus, und legen Sie den Prozentsatz des emittierten Fluoreszenzlichts fest, und passen Sie dann die Belichtungszeit wie zuvor beschrieben an. Alternativ können Sie die Gebotstiefe ändern, um den Dynamikbereich anzupassen, indem Sie eine der anderen Optionen im Dropdown-Menü auswählen.
Speichern Sie die Einstellungen für den Fluoreszenzkanal, indem Sie mit der rechten Maustaste auf den Fluoreszenzkanal klicken und die Option Aktuelles Mikroskop einstellen zuweisen auswählen. Klicken Sie auf der Registerkarte XY auf das Feld in der Spalte Punktname, um die ausgewählte XY-Position zu speichern. Klicken Sie dann auf das PFS-Feld am unteren Rand der Registerkarte, um das perfekte Fokussystem einzuschalten.
Fokussieren Sie die Zellen, und klicken Sie auf den Pfeil in der SPALTE PFS, um den Fokus der XY-Position zu speichern. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle anderen XY-Positionen. Speichern Sie die Einstellungen für die XY-Positionen unter der Registerkarte Phase, wie zuvor gezeigt.
Klicken Sie auf die Registerkarte Zeit, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen, um das Erfassungsintervall, die Häufigkeit und die Bildgebungsdauer auszuwählen. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Wellenlänge und aktivieren Sie das Kontrollkästchen, um Kanäle auszuwählen, die in der Bildgebung und kanalintervallfrequenz verwendet werden sollen. Wenn Sie mit den Einstellungen gefischt werden, klicken Sie auf Jetzt ausführen, um die Zeitraffer-Bildgebung zu initiieren.
Vergleichen Sie mit den P.aeruginosa Zellen in Monokultur, die in Flößen gruppiert bleiben, wenn in Co-Kultur mit S.aureus, P.aeruginosa hat die einzellige Beweglichkeit gegenüber S.aureus Kolonien erhöht. P.aeruginosa einzelne Zellen werden umgeben und schließlich in S.aureus Kolonien eindringen. Zu viel oder zu wenig Feuchtigkeit während des Experiments und falsch getrocknete Pads sind zwei häufige Probleme, die zu Driften führen, da das Pad die Zellen aus dem Sichtfeld verschiebt und herauszieht.
Fotobleichen und Fototoxizität können dazu führen, dass Zellen zuerst ihre Fluoreszenz verlieren, dann aufhören zu teilen und schließlich in nachfolgenden Frames sterben. Zellen, die sich zunächst zu nahe in der Nähe befinden, haben möglicherweise nicht genügend Zeit, um einen Gradienten von sezernierten Signalen zu ermitteln, auf die andere Arten reagieren können. Die bakterielle Zelllebensfähigkeit kann durch Zugabe von Propidiumjodid zu den Agarose-Pads visualisiert werden.
Grüne Zellen zeigen lebende Zellen an, die aktiv GFP exzessizipieren, während rote Zellen tote Propidiumjod-gefärbte Zellen anzeigen, nachdem sie mit P.aeruginosa Zellfreier Überstand behandelt wurden. Die Bewegung einzelner P.aeruginosa-Zellen wird aus dem Rahmen verfolgt, in dem eine Zelle das Floß durch den Rahmen verlässt, in dem die Zellen den S.aureus-Cluster erreichen. Der Abstand zwischen dem P.aeruginosa Floß und dem S.aureus-Cluster bietet die euklidische Entfernung, während die gesamten Streckenlängen die akkumulierte Entfernung bereitstellen.
Die Richtung jeder Zelle wird als Verhältnis der euklidischen Entfernung zur akkumulierten Entfernung berechnet. Wildtyp P.aeruginosa bewegt sich in Richtung Wildtyp S.aureus mit deutlich höherer Richtung als in Richtung S.Aureus ohne agr-regulierte sekretionierte Faktoren, die für die Richtungsmotilität notwendig sind. Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig zu bedenken, dass jeder Prüfer die Bedingungen für die Trocknung von Agarose-Pads in Live-Bildgebung basierend auf der geografischen Lage, der Laborumgebung und ihrem speziellen Experiment optimieren muss.
Diese Technik zeigt Wechselwirkungen zwischen Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus, die zuvor während unserer Untersuchungen ihres Verhaltens in der Massenkultur verschleiert wurden, was uns dem Verständnis, wie diese Organismen während Infektionen interagieren, näher bringt.
