Wir danken Angela Kralemann-Köhler für hervorragende technische Unterstützung. Hier beschriebenen experimentellen Arbeiten wurde in unserem Labor durchgeführt und wurde durch Zuschüsse der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), um CK und BK und einem Zuschuss des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) an BK unterstützt.

Ethik-Erklärung Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Vorschriften der staatlichen Tierpflege und Verwendung Ausschuss LANUV des Landes Nordrhein-Westfalen, (Düsseldorf, Deutschland) durchgeführt. Alle Tierversuche wurden von LANUV, Düsseldorf unter der Lizenznummer 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV NRW) zugelassen. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um Not und die Anzahl der Tiere für die Studie zu minimieren. 1. Tierpflege-und Wohnungswesen <ol><li> Alle Tiere, die in den hier beschriebenen Protokolle verwendet werden, sollten unter bestimmten erregerfreien Bedingungen gehalten werden, wie von der Europäischen Föderation für Versuchstierkunde (FELASA) definiert. </li><li> Mäuse sollten in Standardkäfigen in einer Temperatur-und Feuchte-kontrollierten (22 ° C) Zimmer unter Tagesbedingungen (12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus) gehalten werden, mit HEPA-gefilterte Luft. </li><li> Standardisierte Nahrung und Wasser zur Verfügung gestellt werden sollte ad libitum. &lt;/ Li&gt; <li> Wenn IKB / tTA und IKB / - Kontroll-Mäusen verwendet werden, sollten PCR-basierte Genotypisierung für jedes Tier durchgeführt werden, wie in 7, 18 beschrieben. </li><li> Männliche Tiere mit einem Altersunterschied von weniger als vier Tage sollte verwendet werden, um individuelle Unterschiede zu verringern. </li><li> (Optional): Für die NF-kB-Reaktivierung Experimente, Doxycyclin muss im Trinkwasser (mit 2,5% Saccharose 2 mg / ml) für mindestens 14 Tage verabreicht werden. </li></ol> 2. Räumliche Muster-Trennung Barnes Maze (SPS-BM) <ol><li> Alle Verhaltenstests sollte nach den internationalen und lokalen Richtlinien durchgeführt werden. </li><li> WICHTIG! Verwenden Sie nur männliche Mäuse mit einem Alter von sechs Monaten oder älter. Der Altersunterschied zwischen den Tieren einer Versuchsreihe sollte weniger als vier Tage. Die Prüfung muss vom selben Betreiber für jede Reihe durchgeführt werden. Die Mäuse sollten eine Standard-Diät vor der Tests, die Motivation teilweise als angetriebene weiter steigernweet Futterbelohnung. </li><li> Eine weiße, runde Platte aus hartem Kunststoff Set (Durchmesser 120 cm, siehe Abbildung 5A) in einer feuchten und temperierten Raum (22 ° C), mit mindestens 4 x 80 W und 3 x 215 W Neon-Leuchtstofflampen beleuchtet . WICHTIG! Achten Sie darauf, die richtige Beleuchtung verwendet, wie die Motivation der Mäuse, die Lebensmittel Häuser geben wird teilweise durch ihre Abneigung gegen helle, exponierten Stellen angetrieben. </li><li> Stellen Sie den Video-Tracking-System. Die Kamera sollte 115 cm über dem Zentrum der Platte (siehe Fig. 5A) gespeichert. </li><li> Bringen bunten Extra-Labyrinth Cues (EMV) zu einem weiß-farbigen Tuch in den Positionen für die Tiere, ca. 100 cm von der Grenze der Platte (siehe Abbildung 5A) gut sichtbar. </li><li> Die Platte sorgfältig reinigen mit einem Schnelldesinfektionsmittel, die jeden Geruch aus dem Versuchsaufbau entfernen können. </li><li> Zeigen sieben identische gelbe Lebensmittelhäuser (12 cm x 7 cm x 8 cm, siehe Abbildung 5A </strong&gt;) auf der weißen Platte. Die Positionen sollten eindeutig gekennzeichnet (siehe Abbildung 5A). </li><li> Zeigen süße Speisen Pellet Belohnungen (ein Viertel Kellogs `s Froot Loop / Essen Haus) in allen Lebensmittelhäuser auf definierten Positionen (siehe Abbildung 5A) mit nur einem definierten Lebensmittel Haus frei zugänglich für das Tier (Standort F, siehe Abbildung 5A ). Schließen Sie die Nicht-Ziel-Lebensmittel Häuser mit transparenter Folie. </li><li> Vor dem Test, führen Gewöhnung (ein Tag vor dem Start der Aufgabe). Machen alle Lebensmittel Häuser frei zugänglich und ermöglichen die Mäuse, um das Labyrinth zu erkunden und frei, um eine Futterpellet Belohnung (10 min / Tier) abzurufen. </li><li> Schalten Sie den Computer und die Kamera ein und starten Sie das Video-Tracking-System-Software. </li><li> Starten Sie die Aufnahme. </li><li> Legen Sie das Tier an der definierten Startpunkt auf der kreisförmigen Platte (Abbildung 5A, S: Startposition) und lassen die Mäuse für die Ziellebensmittelhaus für 10 min suchen. </li><li> Stop das Video-Tracking-Systems. </li><li> WICHTIG! Reinigen Sie den kreisförmigen Platte und die Lebensmittel Häuser nach jedem Versuch mit Schnelldesinfektionsmittel. </li><li> Wiederholen Sie den Test täglich für sieben aufeinander folgende Tage (pro Tier). </li><li> Analysieren Sie die Ergebnisse (überdachte Wartezeit, Entfernung und Fehler) mit geeigneten Statistik-Software. Fehler definieren als Annäherung an die falsche Nahrung Haus und / oder Kontakt mit der richtigen Box ohne Eingabe und Abruf der Futterpellet Belohnung. Für gruppiert Analyse zu verwenden Zwei-Wege-ANOVA mit Bonferroni Post-hoc-Test. </li><li> (OPTION) opfere die Mäuse und analysieren die hippocampi wie unten beschrieben. </li></ol> 3. BrdU-Labeling <ol><li> Injizieren intraperitoneal 50 mg / kg ip BrdU einmal täglich über 3 Tage (Analyse der Differenzierung und Integration) oder 200 mg / kg ip eine einzige Injektion (Analyse der Proliferation). </li><li> Opfere die Tiere sezieren den Hippocampus und bereiten 40 um Abschnitte wie unten beschrieben. </li><li> Denaturieren dieAbschnitte mit 2 M HCl für 10 min inkubieren in 0,1 M Borat-Puffer für 10 min. </li><li> Label eine eins zu zwölf Reihen von 40 &amp;mgr; m-Schnitte (240 &amp;mgr; m Abstand) von jedem Tier immunhistochemisch, wie nachstehend unter Verwendung von Antikörpern gegen BrdU gerichtet beschrieben. </li><li> Quantifizierung der markierten Zellen durch konfokale Mikroskopie Analyse der gesamten rostrokaudalen Ausmaß der Körnerzellschicht und Subgranularzone. Multiplizieren Sie die daraus resultierenden Zahlen durch 12, um die geschätzte Gesamtzahl der BrdU-markierten Zellen pro Hippocampus und durch zwei teilen zu erhalten, um die Gesamtzahl der markierten Zellen pro DG erhalten. </li></ol> 4. Die Entfernung der Gehirne und Herstellung von Gefrierschnitte von nicht-perfundierte Tiere <ol><li> Beachten lokal zugelassene Verfahren für euthanizing Tiere. Mäuse können direkt durch zervikale Dislokation getötet werden. </li><li> (OPTION) Die Tiere können vor euthanization nach lokalen und internationalen Richtlinien betäubt werden, zB durch intraperitoneale injektion von 0,8 ml Avertin für eine 33 g-Maus (frisch durch Mischen von 150 ml Stammlösung von 2,2 mg 2,2,2-Tribromethanol in 1 ml Isoamylalkohol Ethanol mit 1,85 ml Kochsalzlösung oder physiologische Puffer gemacht). </li><li> Sterilisieren Sie den Kopf mit Betadine (10% PVP-Jod)-getränkten Gaze und anschließend mit Gaze-Tupfer in 70% Ethanol getränkt. </li><li> Enthaupten, das Tier mit Hilfe geeigneter chirurgische Scheren und ziehen Sie die Haut beiseite. </li><li> (OPTION) Fixateure kann angewendet werden, um zu vermeiden, Zurückklappen der Haut verzögert. </li><li> Machen Sie eine Mittellinienschnitt in den Schädel und die Schädelfragmente vorsichtig beiseite zu ziehen. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das gesamte Gehirn mit einem entsprechenden chirurgischen Instrument (zB Moria Löffel). </li><li> Vorkühlen 25 ml 2-Methyl in einem 50 ml-Becherglas (z. B. Schott Duran) auf -30 bis -40 ° C auf Trockeneis. Hinweis: Für die frei schwimmende Färbung der &quot;dicke&quot; Abschnitte, die sich ideal für die konfokale Laserscanning-Mikroskopie geeignet sind, entfernen Gehirn, waschen 3Mal in Puffer und bei 4 ° C in phosphatgepufferter 30% Saccharose-Lösung in 50-ml-Tube, bis Gehirn hat sich nach unten (in der Regel über Nacht) versenkt. </li><li> Vorsichtig Gehirn auf ein Stück Nescofilm (Parafilm) und decken mit reichliche Menge an TissueTek OCT-Verbindung, gefrier auf Nescofilm in 2-Methyl, Lagerung bei -80 ° C bis zur Verwendung. Hinweis: Für die Langzeitlagerung bei -20 ° C lagern in 9% Saccharose, 7 mM MgCl 2, 50 mM Phosphat-Puffer, 44% Glycerin. </li><li> Schneiden Sie das Gehirn in 10-12 um dicke Schnitte auf geeigneten Kryomikrotom. Hinweis: Für dicke, frei schwebenden Abschnitte, gefrier Gehirn auf Kryotom Stufe der entsprechenden Kryotom (z. B. Reichert Jung, Frigomobil.) Und schneiden 40 um horizontale Schnitte bei -20 ° bis - 25 ° C. Sammeln Schnitte von Messer mit feinem Pinsel und sammeln sich in Puffer oder halten Sie im Storage-Lösung (Schritt 4.9) bei -20 ° C für Langzeit-Lagerung. </li><li> Vorsichtig aufsetzen zwei Scheiben auf Einzelobjektträger. Die unse von Superfrost Objektträger Ultraplus ist sehr zu empfehlen, um die Haftung der Abschnitte zu maximieren. </li><li> Trocknen der Objektträger für 5 min bei Raumtemperatur. Objektträger können bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol> 5. Vorbereitung der Abschnitte aus perfundierten Tiere <ol><li> Anesthetize die Tiere, wie oben (Schritt 4.2) beschrieben. </li><li> Das Tier sorgfältig durchströmen transkardial mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend Heparin (0,025 g/100 ml PBS) und Procain (0,5 g/100 ml PBS) für 2-4 Minuten, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in PBS für 10-15 min . Die Perfusion wird optimal durch Perfusion über die linke Herzkammer und die Öffnung des rechten Vorhofs mit einem hydrostatischen Druck von ca. 1,2 bis 1,4 m oder Verwendung einer Schlauchpumpe auf ca. 15 ml / min durchgeführt. Optimale Durchblutung führt zu einem blassen weißen Gehirn mit keine roten Blutgefäße sichtbar sind. </li><li> Präparieren und Post-fix die Gehirne in 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C für 24 Stunden. </li><li> Cryoschützen die Gehirne in 30% Saccharose in PBS bei 4 ° C für mindestens 24 Stunden. </li><li> Frieren Sie die Gehirne auf der Kryotom Bühne. </li><li> Bereiten 40 um horizontale Abschnitte von gesamten Vorderhirn mit einem geeigneten Kryotom. </li><li> Die Folien können in Kälteschutzlösung (0,1 M Phosphat-Puffer, 50% Glycerin, 0,14% MgCl 2, 8,6% Saccharose) bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. </li></ol> 6. Immunhistochemie von Hirnschnitten von nicht-perfundierte Tiere <ol><li> Post-Fixierung der Gefrierschnitte, die wie oben beschrieben, mit -20 ° C kaltem Methanol für 10 min. </li><li> Blockieren mit 5% normalem Serum, enthaltend 0,3% Triton-X (aus der Art, die zum Anheben der sekundäre Antikörper verwendet wurde) über Nacht bei 4 ° C. </li><li> 3x Spülen mit 1x PBS und Inkubation mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 ° C </li><li> Spülen 3x mit 1x PBS und Inkubation mit sekundärem Antikörper bei Raumtemperatur für eine Stunde. </li><li> Mit 1x PBS spülen 3x </li><li> Counterstain Abschnitt für die DNA mit SYTOX grün oder DAPI (oder eine alternative DNA-Farbstoff). </li><li> Mit 1x PBS spülen 3x </li><li> Betten Sie die Abschnitte in einer wässrigen Einbettmedium. </li><li> Lassen Sie das Einbettungsmedium polymerisiert mindestens 48 Stunden. </li></ol> 7. Immunhistochemie von Hirnschnitten von perfundierten Tiere <ol><li> Sperren, wie in Schritt 6.2 beschrieben und anschließend bebrüten die feste Gehirnschnitte in der Primärantikörperlösung in PBS mit 0,3% Triton-X (frei schwebend) über Nacht bei 4 ° C </li><li> Dreimal mit 1x PBS spülen und Inkubation in sekundären Antikörperlösung in PBS mit 0,3% Triton-X (frei schwebend) bei Raumtemperatur für 3 h verdünnt. </li><li> Mit 1x PBS spülen 3x </li><li> Gegenfärbung der für die DNA-Abschnitt mit SYTOX grün oder DAPI (oder eine alternative DNA-Farbstoff). </li><li> Dreimal mit 1x PBS spülen </li><li> Betten Sie die Abschnitte in einer wässrigen Einbettmedium. </li><li> Lassen Sie den Einbettungsmedium polymerisieren für eint mindestens 48 Stunden. </li></ol> 8. Untersuchung der Moosfaser Projektionen <ol><li> Opfere die Tiere, bereiten 40 um koronalen Abschnitte wie oben beschrieben und Flecken auf der Hippocampus-Abschnitt unter Verwendung von Antikörper für Neurofilament M. </li><li> Scannen Sie die Abschnitte bei der geeigneten Wellenlänge mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Moosfasern und Zellkerne sichtbar zu machen. Starten Sie den Scan bei geringer Vergrößerung. </li><li> Verwenden Sie die Bilder mit geringer Vergrößerung für die Orientierung und Ziel der Hippocampus mit Moosfaser-Projektionen. </li><li> Scannen Sie die Abschnitte (z-Schnitte) mit hoher Auflösung und hoher Vergrößerung. </li><li> Analysieren Sie die morphologische Erscheinungsbild und Konnektivität der über Färbung für NF-M visualisiert Moosfasern. </li><li> (OPTION) Analysieren Sie die Größe und das Volumen der Hippocampus-Blades. Verwenden Sie die DNA-Signal für die Messungen. </li></ol> 9. Fluoro-Jade-C Gehalt (Neuronal Cell Death) <ol><li> Opfere die Tiere sezieren die hippocampus und bereiten 12 &amp;mgr; m-Schnitte, wie oben beschrieben. </li><li> Lassen die Abschnitte Trocknen für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Beheben die Abschnitte in 4% PFA für 40 min bei Raumtemperatur. </li><li> Kurz waschen die Schnitte 3x mit ddH 2 O. </li><li> 10 min Inkubation der Schnitte mit 0,06% Kaliumpermanganat (KMnO 4) unter ständigem, leichtem Schütteln. </li><li> Waschen Sie die Schnitte 3x mit ddH 2 O. </li><li> Inkubieren der Schnitte mit 0,002% Fluoro-Jade C-Lösung für 20 min bei Raumtemperatur. </li><li> (Optional) für die gleichzeitige Kernfärbungen, 0,002% Fluoro-Jade-C-Lösung mit 10 ug / ml DAPI ergänzt werden. </li><li> Kurz waschen die Schnitte 3x mit ddH 2 O. </li><li> Lassen die Abschnitte Trocknen für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren der Schnitte mit Xylol (1 min) </li><li> Montieren Sie die Teile mit einem Xylol-basierten Montagemedium (DPX). </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt.

Adulten Neurogenese und die Möglichkeit ihrer Manipulation über die Hemmung von NF-kappaB in Neuronen und ihre spätere Reaktivierung über Doxycyclin, bietet eine faszinierende System für Untersuchungen neugeborenen Nervenzellen im erwachsenen Gehirn, als auch in neuronalen De-und Re-Generation . Der Vorteil bei diesem System ist, dass NF-&amp;kgr; B-Signalwegs in Neuronen, Hemmung führt nicht nur zu Veränderungen in der neuronalen Zelltod Vorläufer Proliferation und Migration und schweren strukturellen und anato...

Ontologisch ist der Hippocampus eine der ältesten bekannten anatomischen Hirnstrukturen. Es ist für verschiedene komplexe Aufgaben, wie z. B. Schwenk Funktionen bei der Regulation des Langzeitgedächtnisses, die räumliche Orientierung und die Bildung und Verfestigung des jeweiligen Speicher. Anatomisch, der Hippocampus besteht aus Pyramidenzellschichten (Stratum pyramidale), einschließlich der Ammonshorn (CA1, CA2, CA3 und CA4) Regionen und Gyrus dentatus (Gyrus dentatus), die Körnerzellen und neuronalen Vorläuferzellen ein paar in seinem Subgranularzone enthält . Die Körnerzellen ragen in Richtung der CA3-Region über den so genannten Moosfasern (Axone der Körnerzellen). Bis zum Ende des letzten Jahrhunderts wurde die erwachsenen Gehirn von Säugetieren angenommen, dass ein statisches Organ fehlt zellulären Plastizität und Neurogenese sein. Doch in den letzten zwei Jahrzehnten eine wachsende Anzahl von Beweisen zeigt deutlich, adulte Neurogenese, die sich in mindestenszwei Gehirnregionen, die Subventrikularzone (SVZ) und der Subgranularzone des Hippocampus. Unsere früheren Untersuchungen, und die der anderen Gruppen haben gezeigt, dass der Transkriptionsfaktor NF-&amp;kgr; B ist eine der wichtigsten Regulatoren des Molekularneurogenese und daß seine Deregulierung führt zu schweren strukturellen Mängel hippocampalen und kognitiven Beeinträchtigungen 1-6. NF-&amp;kgr; B ist der generische Name eines induzierbaren Transkriptionsfaktor verschiedener dimerer Kombinationen von fünf DNA-bindenden Untereinheiten zusammengesetzt: p50, p52, c-Rel, RelB und p65 (RelA), letztere drei davon mit Transaktivierungsdomänen. Im Gehirn ist die häufigste Form im Zytoplasma ein Heterodimer von p50 und p65, die in einer inaktiven Form von Inhibitor-kappa-B (IkB)-Proteine ​​gehalten wird. Um zu studieren und direkt manipulieren NF-kB-driven Neurogenese, verwenden wir transgene Mausmodelle, um einfache Hemmung der alle der NF-kB subun ermöglichenseine, insbesondere im Vorderhirn 7 (siehe Fig. 1). Zu diesem Zweck haben wir rassige überqueren die folgenden transgenen Mauslinien, IKB / - und -/tTA. Die transgene IKB / - Linie wurde mit einem trans-dominant negative Mutante von NF-kB-Hemmer IκBa (Super-Repressor-IκBa-AA1) erzeugt 8. Im Gegensatz zu den Wildtyp-I &amp;kgr; B, hat I &amp;kgr; B-AA1 zwei Serin-Reste zu Alaninen (V32 und V36), das die Phosphorylierung und anschließenden proteasomalen Abbau des Inhibitors behindern mutiert. Für Vorderhirn Neuronen-spezifische Expression des IκBa-AA1-Transgen, IKB / - Mäuse mit Mäusen beherbergen eine Kalzium-Calmodulin-abhängige Kinase II &amp;agr; gekreuzt (CAMKIIα)-Promotor, der durch Tetracyclin trans-Aktivator (tTA) angesteuert werden können 9. p65-Knock-out-Mäuse haben einen embryonalen letalen Phänotyp, wegen der massiven Leber Apoptose 10, so dass die hier gezeigten Ansatz bietet eine elegante Methodefür die Untersuchung der Rolle von NF-kB in der postnatalen und adulten Neurogenese. Die klassische Verhaltenstest, um räumliche Lern-und Gedächtnis Studie wurde in den 1980er Jahren von Richard Morris, einem Test, wie der Morris-Wasserlabyrinth (MWM) 11 bekannt beschrieben. In diesem offenen Bereich Wasser-Labyrinth, Tiere lernen, von undurchsichtigen Wasser auf einer versteckten Plattform auf Basis von Orientierung und Extra-Labyrinth Hinweise zu entkommen. Eine trockene Variante MWM ist die sogenannte Barnes Labyrinth (BM) 12. Dieser Test nutzt eine kreisförmige Platte mit 20 an der Grenze einer Platte angeordneten kreisrunde Löcher, mit einem Loch definiert als Flucht-Box, und visuelle Extra-Labyrinth Hinweise zur Orientierung. Beide experimentellen Paradigmen beruhen auf der Flugverhalten von einem Nagetier `s Abneigung gegen Wasser, oder offen, hell beleuchteten Räumen induziert. Beide Tests erlauben eine Untersuchung der räumlichen Orientierung, und die damit verbundene Gedächtnisleistung. Obwohl der Hippocampus spielt eine allgemeine und wesentliche Rolle in der räumlichen Gedächtnisbildung, die Hippocampus-regionen beteiligt unterscheiden sich je nach Test angewendet. Der Speicher BM getestet entsteht aus neuronalen Aktivität zwischen enthorinal Cortex (EC) und der Pyramidenzellen in der CA1-Region des Hippocampus angeordnet, ohne einen Beitrag der GD 13-16. Insbesondere die klassischen BM stützt sich hauptsächlich auf die Navigation über die monosynaptischen temporo-Ammonium-Weg von EG III der CA1 EG V. Wichtig ist, dass die DG entscheidend an der sogenannten räumlichen Mustererkennung 17, die nicht nur die Verarbeitung impliziert beteiligt visuelle und räumliche Informationen, sondern auch die Umwandlung von ähnlichen Vorstellungen oder Erinnerungen in unterschiedlichen, nicht überlappenden Darstellungen. Diese Aufgabe erfordert eine funktionale Tri-Synapsenschaltung von EC II DG CA3 zu CA1-und EC-VI, die nicht in der BM 15 getestet werden können. Um diese Herausforderungen anzugehen, haben wir SPS-BM als Verhaltenstest entwickelt, um speziell zu testen Gyrus dentatus abhängige kognitive Leistung in Zusammenarbeitntrol Tiere, und in der IKB / tTA Super-Repressor-Modell folgende NF-KB-Hemmung. Wichtig ist, dass im Gegensatz zu der MWM oder der BM, die SPS-BM können subtile Verhaltensdefizite aus Wertminderungen der Neurogenese resultierenden offenbaren. Seit räumlich-Muster-Trennung ist strikt von einer Funktionsschaltung zwischen der EG und DG II und CA3 und CA1-und EC-VI, dieser Test ist sehr empfindlich auf mögliche Veränderungen in der Neurogenese, Modifikationen der Moosfaser-Weg oder Veränderungen der Gewebe-Homöostase innerhalb der DG. Technisch gesehen ist der Aufbau der Test auf die Studie von Clelland et al., Wobei die räumliche Trennung Muster wurde unter Verwendung eines Holz 8-Arm-Radiallabyrinth (RAM) 19 geprüft. In unserer modifizierten Set-up wurden die acht Arme von sieben identische gelbe Lebensmittelhäuser ersetzt. Zusammenfassend hier gezeigten Methoden, einschließlich der Analyse der Double-exprimierenden (DCX +) Zellen im Hippocampus, die Moosfaser-Projektionen, neuronale Zell death und insbesondere die SPS-BM hier vorgestellten, können die Untersuchungen auf andere Modelle mit Transgene Maus, die einen Einfluss auf die adulte Neurogenese haben, angewendet werden. Weitere Anwendungen können die Studie von pharmakologischen Mitteln und die Messung ihrer Auswirkungen auf DG und räumliche Muster Trennung gehören.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Moria MC17 Perforated Spoon&#160;</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td style="width:132px;">10370-18</td>
			<td style="width:167px;">removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi SV8</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical scissors&#160;</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td>14084-08</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical scissors&#160;</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td>14381-43</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td style="width:127px;">FST</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>removal of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">SuperFrost Slides</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td align="right">1879</td>
			<td>slides for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>fixative</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">TissueTek OCT compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td style="width:132px;">1004200018</td>
			<td>embedding of the brains</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:447px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:127px;">Jackson Immunolabs</td>
			<td style="width:132px;">005-000-001</td>
			<td>blocking in IHC</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:447px;">Normal Rabbit Serum</td>
			<td style="width:127px;">Jackson Immunolabs</td>
			<td style="width:132px;">011-000-001</td>
			<td>blocking in IHC</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td style="width:127px;">Jackson Immunolabs</td>
			<td style="width:132px;">017-000-001</td>
			<td>blocking in IHC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-Neurofilament-M antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>2H3</td>
			<td>IHC, Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-doublecortin&#160;antibody</td>
			<td>sc-8066</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>IHC, Dilution 1:800</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">anti-GFP antibody</td>
			<td>ab290</td>
			<td>abcam</td>
			<td>IHC, Dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">anti-BrdU antibody</td>
			<td>OBT0030G</td>
			<td>Accurate Chemicals</td>
			<td>IHC, Dilution 1:2000&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Fluoro Jade-C</td>
			<td>FJ-C</td>
			<td>HistoChem</td>
			<td>Determination of neuronal cell death</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Betadine</td>
			<td style="width:127px;">&#160;MUNDIPHARMA</td>
			<td>D08AG02&#160;</td>
			<td>disinfectant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cryomicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td>preparation of brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">H3393</td>
			<td>perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm)</td>
			<td style="width:127px;">lab made</td>
			<td style="width:132px;">none</td>
			<td>plate for SPS-BM, diameter 120cm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buraton rapid disinfectant&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Sch&#252;lke &#38; Mayr</td>
			<td style="width:132px;">113 911</td>
			<td>disinfectant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2</td>
			<td>tse systems</td>
			<td style="width:132px;">302050-SW-KIT</td>
			<td>tracking and analysis of SPS-BM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>permeabilisation/IHC</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:447px;">cryotome</td>
			<td style="width:127px;">Reichert&#160; Jung/Leica</td>
			<td style="width:132px;">Frigomobil 1206</td>
			<td>preparation of 40&#181;m brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Mowiol 4-88</td>
			<td style="width:127px;">Carl Roth&#160;</td>
			<td>Art.-Nr. 0713</td>
			<td>embedding of the slides</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">SYTOX green</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td>S7020</td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Food pellets (Kellog`s Froot Loops)</td>
			<td>Kellog`s</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>SPS-BM</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:447px;">Prism, Version 3.0</td>
			<td style="width:127px;">Graph Pad Software, San Diego, USA&#160;</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>Statistical evaluation of SPS-BM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">Zen 2008 or Zen 2011 Software</td>
			<td style="width:127px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td>Software (Confocal microscope)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:447px;">D.P.X</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:132px;">317616</td>
			<td>mounting medium for Fluoro Jade C staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for the modulation and analysis of nf-&#954;b-dependent adult neurogenesis

Der Hippocampus spielt eine zentrale Rolle bei der Bildung und Konsolidierung des episodischen Erinnerungen und der räumlichen Orientierung. Historisch ist der Hippocampus als sehr statisch anatomischen Bereich des Gehirns von Säugetieren angesehen. Allerdings haben die jüngsten Ergebnisse zeigten, dass der Gyrus dentatus des Hippocampus ist ein Bereich von enormer Plastizität bei Erwachsenen, die nicht nur Änderungen der bestehenden neuronalen Schaltkreisen, sondern auch adulte Neurogenese. Diese Plastizität ist von komplexen Transkriptionsnetz reguliert, wobei der Transkriptionsfaktor NF-&amp;kgr; B spielt eine herausragende Rolle. Um zu untersuchen und zu manipulieren, adulte Neurogenese, ein transgenes Mausmodell für Vorderhirn-spezifische neuronale Hemmung von NF-kappaB-Aktivität verwendet werden. In dieser Studie werden Verfahren zur Analyse von NF-&amp;kgr; B-abhängigen Neurogenese, einschließlich der strukturellen Aspekte, die neuronale Apoptose und Proliferation Vorläufer und kognitive Bedeutung whic beschriebenh wurde speziell über eine Gyrus dentatus (DG)-abhängigen Verhaltenstest, das räumliche Muster Trennung Barnes-Labyrinth (SPS-BM) bewertet. Die SPS-BM-Protokoll könnte einfach für die Verwendung mit anderen transgenen Tiermodellen, den Einfluss bestimmter Gene auf erwachsene Neurogenese beurteilen angepasst werden. Ferner könnte SPS-BM in anderen experimentellen Einstellungen auf die Untersuchung und Manipulation DG abhängigen Lern, beispielsweise mit pharmakologischen Mitteln gerichtet werden.

Kreuzung der I &amp;kgr; B / - und tTA transgene Mauslinien zu bedingte Inhibition von NF-&amp;kgr; B-Aktivität im Hippocampus. Um die Expression des I &amp;kgr; B &amp;agr;-AA1-Transgens in der transgenen Mausdoppel (1A) zu untersuchen, wurden Gehirn isoliert, kryogeschnitten und gefärbt mit einem Antikörper gegen GFP (green fluorescent protein). Die konfokale Laserscanmikroskopie zeigte eine hohe Expression des Transgens in der CA1-und CA3-Regionen und ...

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Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methoden zur Manipulation und Analyse von NF-kB-abhängige erwachsene Neurogenese beschrieben. Ein detailliertes Protokoll für eine Gyrus dentatus abhängige Verhaltenstest (als das räumliche Muster trenn Barnes Labyrinth) zur Untersuchung der kognitiven Ergebnis in Mäusen dargestellt. Diese Technik sollte auch dazu beitragen, dass Untersuchungen in anderen experimentellen Einstellungen.

Methoden zur Analyse und Modulation von NF-kappaB-abhängigen adulte Neurogenese

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

methods-for-modulation-analysis-nf-b-dependent-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

14.2K Aufrufe.  University of Bielefeld.  Methoden zur Manipulation und Analyse von NF-kB-abhängige erwachsene Neurogenese beschrieben. Ein detailliertes Protokoll für eine Gyrus dentatus abhängige Verhaltenstest (als das räumliche Muster trenn Barnes Labyrinth) zur Untersuchung der kognitiven Ergebnis in Mäusen dargestellt. Diese Technik sollte auch dazu beitragen, dass Untersuchungen in anderen experimentellen Einstellungen. 

Serie: Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). Animal models are necessary for studying the etiopathology and potential therapies of cerebrovascular diseases. Imaging the vasculature in large animals is relatively easy. However, developing vessel imaging methods of murine brain disease models is desirable due to the cost and availability of genetically-modified mouse lines. Imaging the murine cerebral vascular tree is a challenge. In humans and larger animals, the gold standard for assessing the angioarchitecture at the macrovascular (conductance) level is x-ray catheter contrast-based angiography, a method not suited for small rodents.
In this article, we present a method of cerebrovascular casting that produces a durable skeleton of the entire vascular bed, including arteries, veins, and capillaries that may be analyzed using many different modalities. Complete casting of the microvessels of the mouse cerebrovasculature can be difficult; however, these challenges are addressed in this step-by-step protocol. Through intracardial perfusion of the vascular casting material, all vessels of the body are casted. The brain can then be removed and clarified using the organic solvent methyl salicylate. Three dimensional imaging of the brain blood vessels can be visualized simply and inexpensively with any conventional brightfield microscope or dissecting microscope. The casted cerebrovasculature can also be imaged and quantified using micro-computed tomography (micro-CT)1. In addition, after being imaged, the casted brain can be embedded in paraffin for histological analysis.
The benefit of this vascular casting method as compared to other techniques is its broad adaptation to various analytic tools, including brightfield microscopic analysis, CT scanning due to the radiopaque characteristic of the material, as well as histological and immunohistochemical analysis. This efficient use of tissue can save animal usage and reduce costs. We have recently demonstrated application of this method to visualize the irregular blood vessels in a mouse model of adult BAVM at a microscopic level2, and provide additional images of the malformed vessels imaged by micro-CT scan. Although this method has drawbacks and may not be ideal for all types of analyses, it is a simple, practical technique that can be easily learned and widely applied to vascular casting of blood vessels throughout the body.

In this article, we present a simple, practical technique for cerebrovascular casting that is easy to perform and can be utilized to image the vascular tree of the adult mouse brain.

Zerebrovaskuläre Casting der erwachsenen Maus für 3D-Imaging und morphologische Analyse

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Forschung

Neurowissenschaften

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Funktionelle Abfrage der Erotik Hypothalamus Neurogenese mit Brennradiologische Hemmung

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Immunhistochemie und Multiple Markierung mit Antikörper aus dem gleichen Host Arten, die Adult Neurogenese Studieren

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

Die Beurteilung Primäre Neurogenese in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at the synaptic level. The Active Zone (AZ) is the region at the presynaptic membrane that mediates neurotransmitter release and is composed of a dense collection of scaffold proteins. AZs of Drosophila melanogaster (Drosophila) photoreceptors undergo molecular remodeling after prolonged exposure to natural ambient light. Thus the level of neuronal activity can rearrange the molecular composition of the AZ and contribute to the regulation of the functional output.
Starting from the light exposure set-up preparation to the immunohistochemistry, this protocol details how to quantify the number, the spatial distribution, and the delocalization level of synaptic molecules at AZs in Drosophila photoreceptors. Using image analysis software, clusters of the GFP-fused AZ component Bruchpilot were identified for each R8 photoreceptor (R8) axon terminal. Detected Bruchpilot spots were automatically assigned to individual R8 axons. To calculate the distribution of spot frequency along the axon, we implemented a customized software plugin. Each axon&#39;s start-point and end-point were manually defined and the position of each Bruchpilot spot was projected onto the connecting line between start and end-point. Besides the number of Bruchpilot clusters, we also quantified the delocalization level of Bruchpilot-GFP within the clusters. These measurements reflect in detail the spatially resolved synaptic dynamics in a single neuron under different environmental conditions to stimuli.

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Here we show how to quantify the number and spatial distribution of synaptic active zones in Drosophila melanogaster&#160;photoreceptors, highlighted with a genetically encoded molecular marker, and their modulation after prolonged exposure to light.

Analyse Synaptische Modulation von<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorezeptoren nach der Einwirkung von Längerer Licht

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

Die Maus Hinterhirn als Modell für die Erforschung embryonaler Neurogenese

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Schildzecken und erwachsenen Gehirn

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Isolierung von Erwachsenen Rückenmark Kerne für massiv parallele Single-Kern-RNA-Sequenzierung

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...