The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).

HINWEIS: Alle Verfahren, die lebende Tiere wurden in Übereinstimmung mit der EG-Richtlinie 86/609 / EWG des Rates Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren und von der Ethikkommission (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz) zugelassen wurde. 1. intraperitoneale Injektion von Thymidinanaloga <ol><li> Wiegen Tiere am Tag vor der Injektion. Berechnen Sie die Menge an Thymidin-Analogon für alle am nächsten Tag sowie individuelle Gewicht angepassten Injektionsvolumina einer 10 mg / ml Stammlösung geplant Injektionen erforderlich. </li><li> Bereiten Sie 10 mg / ml Thymidin-Stammlösung. (VORSICHT! Thymidin-Analoga sind giftig. Folgen Sie den spezifischen Sicherheitsdatenblätter (MSDS) von den Lieferanten zur Verfügung gestellt, also tragen Laborkittel und Schutzhandschuhe, mit einem Laborabzug). <ol><li> Nehmen Thymidin-Analogon aus dem Gefrierschrank und bringen es auf RT, ca. 21 ° C. Wiegen Sie 10 mg und fügensteriler Kochsalzlösung (für BrdU und CldU) oder 0,04 N NaOH (in steriler Kochsalzlösung, für IDU), Wirbel. Platz für mindestens 10 bis 15 Minuten lang in einem 50 ° C Wasserbad und Wirbel alle 2 - 3 Minuten, um das Pulver aufzulösen. HINWEIS: Lösungen für bis zu 24 Stunden, wenn sie bei Raumtemperatur und für mehrere Wochen bei -20 ° C gelagert. Schützen Lösungen von Licht (Abdeckung mit Aluminiumfolie). Kontrollieren Sie immer die Niederschläge und wieder auflösen, wenn nötig. </li></ol></li><li> Restrain die Maus durch das Genick und intraperitoneale Injektion eines geeigneten, dem Gewicht angepassten Volumen der Stammlösung (bei Raumtemperatur) mit einer feinen Dosierung Spritze mit einer 30 G-Nadel. HINWEIS: Bei CldU und IdU müssen nacheinander im gleichen Tier verabreicht werden, zu prüfen, um äquimolare Konzentrationen injiziert (zB 42,5 mg / kg CldU und 57,5 mg / kg IdU, die 50 mg / kg BrdU entsprechen). Deshalb passen Sie die Injektionsvolumina der 10 mg / ml-Stammlösungen. </li></ol> 2. Gewebepräparation <ol><li> PrepaWieder 4% Formaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4 am Tag vor Perfusion. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Transkardial perfuse die tief narkotisierten Mäusen (3,5% Isofluran) über der linken Herzkammer mit 10 ml eiskaltem PBS, dann mit 40 ml eiskaltem Formaldehyd (Durchflussrate von 5 ml / min). Präparieren des Gehirns und post-fix im gleichen Fixativ für 24 h bei 4 ° C. </li><li> Übertragen Sie die Gehirne nacheinander in 10% (24 Stunden bei 4 ° C) und 30% Saccharose (bis das Gehirn sinkt, ca. 48 h). Zum Einfrieren langsam tauchen die kryogeschützt Gehirn in -25 ° C Isopentan bis keine Luftblasen entstehen aus dem Gewebe. Bei -80 ° C. </li><li> Geschnitten Koronalschnitte von 40 um Dicke auf einem Gefriermikrotom (Blocktemperatur bei -25 bis -16 ° C). Sequenziell Übertragungsabschnitten in Frostschutzlösung, die Vertiefungen einer 24-Well-Zellkulturplatte (siehe Abbildung 1). Lagerung bei -20 ° C. </li></ol><img alt = &quot;1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.551 / 52551fig1.jpg&quot; /&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung der Übertragung von Mikrotom Scheiben in eine 24-Well-Platte. Bei A1 starten und legen nachfolgende Scheiben in Reihe A nach A6 gehen in die nächste Zeile B und so weiter. Bei Erreichen D6, gehen Sie zurück zu A1 und fortfahren. Diese Anordnung von Scheiben ermöglicht die Quantifizierung von jedem n-ten Abschnitt eines gesamten Gehirns. Zur Quantifizierung von neugeborenen Zellen nehmen jeden 6. Hirnschnitt (entsprechend dem Inhalt einer Spalte), Immunfluoreszenz Phänotypisierung nehmen jeden 12-ten Abschnitt (entspricht dem Gehalt von 2 alternierende Reihen von einer Spalte). 3. Immunfärbung HINWEIS: Abschnitte verarbeitet frei schwebenden, in der Regel in 6-Well-Platten mit einer Trägerplatte ausgestattet und Mesh-Einsätzen. Ausnahmsweise Blockieren, Antikörperinkubationen und ABC-Reaktion sind in 12- oder 24-Well-Platten durchgeführt, ohne Mesh-Einsätze (0,5 bis 1 ml pro well reicht, abhängig von der Anzahl der Schichten, die gefärbt werden müssen). Während dieser Schritte Übertragungsabschnitte mit Hilfe einer feinen Bürste (Spülen mit jeder neuen Lösung). Alle Inkubationen werden unter ständigem Rühren (max 150 rpm) durchgeführt. <ol><li> Immunhistochemie (ABC-Methode) <ol><li> Übertragen Sie Abschnitte von Frostschutzmittel in TBS und gründlich (einmal O / N bei 4 ° C, 5-mal bei RT für 10 Minuten jede) zu Frostschutzmittel vollständig zu entfernen. </li><li> Inkubieren für 30 min in 1,5% H 2 O 2 in TBS-T, um endogene Peroxidase-Aktivität zu quenchen. Achten Sie auf die Blasenbildung und wieder tauchen Abschnitte, wenn nötig. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je. </li><li> Optional: Inzwischen vorzuwärmen Heizschrank und 2 N HCl auf 37 ° C. Abschnitte Inkubation 30 min bei 37 ° C in 2 N HCl, um DNA zu denaturieren. Sanft getrennte Abschnitte mit Hilfe eines Pinsels. </li><li> Optional: Neutralisieren Sektionen für 10 min in 0,1 M Boratpuffer pH8,5, RT. Während der Übertragung, kurz Tupfer die Mesh-Einsätze, die die Abschnitte auf einem Papiertuch, um HCl leavings entfernen. Spülen Sie 2 mal in TBS 15 min je. </li><li> Inkubieren in TBSplus, um das Gewebe durchlässig und unspezifische Antikörperbindungsstellen, 1 h bei RT zu blockieren. </li><li> Inkubieren in primären Antikörper in TBSplus, O / N bei 4 ° C verdünnt. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je. </li><li> Inkubiere in biotinylierten sekundären Antikörper in TBSplus, 3 h bei RT verdünnt. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je. In der Zwischenzeit ... </li><li> Bereiten ABC-Komplex gemäß dem Protokoll des Herstellers (1% A + 1% B in TBS-T). Man lässt 30 min bei RT stehengelassen, bevor Gebrauch. Abschnitte AB Reagenz Inkubation für 1 h bei RT. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je. </li><li> Bereiten Sie 50 ml 0,5 mg / ml DAB in TBS-T pro 6- oder 12-Well-Platte, aufgeteilt in zwei Hälften und Pipette 4 ml oder 2 ml pro Vertiefung auf. Übertragungsabschnitten in DAB-Lösung (VORSICHT! DAB ist giftig. Folgen Sie der spezific Sicherheitsdatenblatt des Lieferanten, dh tragen Laborkittel und Schutzhandschuhe, mit einem Laborabzug). </li><li> 0,5 ml 1% H 2 O 2 zu den verbleibenden 25 ml DAB-Lösung, zu mischen und Pipetten äquivalente Volumina wie oben in jede Vertiefung Peroxidase-Reaktion gestartet werden. Inkubieren für 12 min. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je. </li><li> Berg Abschnitte Folien in Gelatine, an der Luft trocknen O / N. Deckglas mit permanentes Fixiermittel. </li><li> Optional: bevor Sie das Deckglas Gegenfärbung (siehe Abschnitt 3.5). HINWEIS: Wenn das Signal-zu-Rausch-Verhältnis niedrig ist, da der hohe Hinter Wiederholen H 2 O 2 -Behandlung nach der Inkubation mit AB-Reagenz (Schritt 3.1.8). </li></ol></li><li> Multiple-Immunfluoreszenz <ol><li> Einzelne oder gleichzeitig mehrere Immunfluoreszenz <ol><li> Übertragen Sie Abschnitte von Frostschutzmittel in TBS und gründlich (einmal O / N bei 4 ° C, 5-mal bei RT für 10 min jeweils) vollständig zu entfernen eintifreeze. </li><li> Optional: wie Sie die Schritte 3.1.3 - 3.1.4. </li><li> Inkubieren in TBSplus, um das Gewebe durchlässig und blockieren unspezifische Antikörperbindungsstellen, 1 h bei RT. </li><li> Inkubieren in primären Antikörper-Cocktail (zB Ratten α-BrdU, Meerschweinchen α-DCX, Ziegen α-GFP) in TBSplus, O / N bei 4 ° C verdünnt. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je. </li><li> Inkubieren in Cocktail aus einem Fluorochrom konjugierte Sekundärantikörper (zB Rhodamin Red α-rat, Alexa-647 α-Meerschweinchen, Alexa-488 α-Ziege, alle in Esel abgeleitet) in TBSplus verdünnt, 3 Stunden bei Raumtemperatur oder O / N bei 4 ° C. Ab sofort schützen Schnitte von Licht. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min je. </li><li> Berg Abschnitte Folien in Gelatine, an der Luft trocknen O / N. Deckglas mit wässrigem Eindeckmedium. </li></ol></li><li> Sequential mehrere Immunfluoreszenz mit primären Antikörpern aus derselben Wirtsspezies <ol><li> Da die Schritte 3.2.1.1 - 3.2.1.3. </li><li> Inkubieren in fiersten primären Antikörper (zB Kaninchen α-Antigen A), O / N bei 4 ° C. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min. </li><li> Inkubieren im ersten Fluorochrom-konjugierten Sekundärantikörper (zB Rhodamin Red-Konj. Esel α-Kaninchen), 3 Stunden RT. Ab sofort schützen Schnitte von Licht. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min. </li><li> Inkubieren in 10% Normalserum von demselben Host wie die primären Antikörper (zB Kaninchenserum) für 3 h RT offen Paratope am ersten sekundären Antikörpers sättigen. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min. </li><li> Inkubiere in TBSplus mit 50 ug / ml unkonjugierter einwertige Fab-Fragmente gegenüber dem Gastgeber der primären Antikörper gerichtet (zB α-Kaninchen-IgG (H + L)) an Epitope, die von dem zweiten sekundären Antikörper, O / N erfasst werden kann abzudecken 4 ° C. </li><li> Mindestens 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min. Während der Übertragung, kurz swab die Mesh-Einsätze, die die Abschnitte auf einem Papiertuch, um alle Fab leavings entfernen. </li><li> Inkubieren im zweiten primären Antikörper (zB Kaninchen α-Antigen B), O / N bei 4 ° C. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min. </li><li> Inkubieren im zweiten Fluorochrom-konjugierten Sekundärantikörper (zB Alexa-488-Konj. Esel α-Kaninchen), 3 Stunden RT. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min jeweils, montieren und Deckglas oben. HINWEIS: Um die Antigene mit Antikörpern beschriften aus verschiedenen Wirtsarten fügen Sie sie in Schritt 3.2.2.2 und den entsprechenden Sekundärantikörper zu Schritt 3.2.2.3. </li></ol></li><li> Eine der sekundären Antikörper aus derselben Spezies wie eine der primären Antikörper Hinweis: Dieses Protokoll ist zusammen mit GFAP, Nestin-GFP und DCX geeignet für Vierfachfärbung gegen BrdU oder Ki67. <ol><li> Befolgen Sie streng Protokoll Schritte 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Bis zu diesem Zeitpunkt ausschließlich Eselserum in TBSplus. </li><li> Inkubiere in TBSplus enthaltend 3% Ziegenserum, 1 h bei RT. Dies umfasst offene Paratope auf der α-Ziege sekundären Antikörper. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min. </li><li> Inkubieren in AMCA-Konj. Ziegen α-Kaninchen in TBSplus, 3 Stunden RT oder O / N 4 ° C verdünnt. Dreimal in TBS Spülen für 15 Minuten jeweils, montieren und Deckglas oben. </li></ol></li><li> CldU, IdU Co-Färbung <ol><li> Spülen, denaturieren und zu neutralisieren Abschnitte, wie in Abschnitt 3.2.1 beschrieben (Schritte 3.2.1.1 - 3.2.1.2). </li><li> Inkubieren mit 20 ug / ml unkonjugierter Fab Fragmente α-Maus-IgG (H + L) in TBSplus, 1 h bei RT. Spülen 4 mal in TBS und einmal in TBS-T für jeweils 10 min. </li><li> Inkubieren in primären Antikörper-Cocktails Ratte α-BrdU (1: 400; gereinigt IgG2) und Maus-α-BrdU (1: 350) in TBSplus, O / N bei 4 ° C verdünnt. 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min. </li><li> Inkubation in sekundärem Antikörper-Cocktail enthält biotinylierten Esel α-Ratte (1: 500) und FITC-conj. Esel α-Maus-Fab-Fragmente (1: 100). 3 mal in TBS und einmal Spülen in TBS-T für jeweils 10 min. </li><li> Inkubieren in Rhodamin Red-Konj. Streptavidin, 2 h bei RT. Spülen Sie 3 mal in TBS 15 min jeweils, montieren und Deckglas oben. </li></ol></li><li> Die Amplifikation von Fluoreszenzsignal in Nestin-GFP-Mäuse <ol><li> Hinzufügen Ziege α-GFP an den primären Antikörper-Cocktail. </li><li> Hinzufügen eines Fluorochrom konjugierten sekundären Antikörpers mit spektralen Eigenschaften ähnlich GFP (wie Alexa 488 conj. Esel α-Ziege) an den sekundären Antikörper-Cocktail. </li></ol></li></ol></li><li> Epitopdemaskierung <ol><li> Führen Sie Epitopdemaskierung nach dem Ausspülen Frostschutzmittel. Vorheizen Dämpfer mit 6- oder 12-Well-Platten mit 0,1 M Citratpuffer pH 6,0 bis 95 bis 99 ° C (etwa 25 min). </li><li> Übertragen Sie die Abschnitte in die heiße Citratpuffer und Dampf für 30 Minuten (die Platten abdecken mit Aluminiumfolie als Kunststoff lIDs sind nicht hitzebeständig). </li><li> Unmittelbar danach die Platten in einem Eisbad abkühlen. Dies hilft, um Gewebemorphologie, die von besonderer Bedeutung ist bei der Arbeit mit Hirnschnitten der postnatalen Tieren zu schützen. </li><li> Spülen Sie 3 mal in TBS für jeweils 10 min zu spülen und zu neutralisieren, das Citrat und weiterhin Färbung. </li></ol></li><li> Maus-Antikörper auf Mausgewebe <ol><li> Mit 20 &amp; mgr; g / ml einwertige Fab-Fragmente α-Maus-IgG (H + L; gleichen Wirtsart als sekundärer Antikörper) zu der ersten Sperrstufe (zB Schritt 3.1.5 oder 3.2.1.3). </li><li> Spülen Sie 4-mal in TBS und einmal in TBS-T für 10 Minuten jeweils, und fahren Sie mit entsprechenden Protokoll. </li></ol></li><li> Kresylviolett Gegenfärbung <ol><li> Vorheizen Kresylviolett Lösung auf 60 ° C (im Glas). Die Objektträger in der heißen Lösung für 3 min. </li><li> Spülen Sie in aq. dest. und dehydratisieren 2 Mal für jeweils 1 min in 70%, 96% und 100% Isopropanol ist. </li&gt; <li> Klar für 5-6 min in Xylol oder Xylol-Ersatzstoff und Deckglas mit einem kompatiblen permanentes Fixiermittel. </li></ol></li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Graf Peroxidase gefärbt neugeborenen Zellen in jedem 6-ten Abschnitt entlang der gesamten rostrokaudalen Umfang des Gyrus dentatus. Verwenden Sie ein Lichtmikroskop bei 400-facher Vergrößerung. </li><li> Multiplizieren die resultierende Zellzahlen mit dem Schnittpunkt-Intervall, um eine Schätzung der Gesamtzahl der Neugeborenen-Zellen zu erhalten. </li><li> Bild der Fluoreszenz mit einem konfokalen Lasermikroskops mit geeigneten Laser und Filtersystemen ausgestattet beschriftet Abschnitte. Nehmen Bildstapeln an zufälligen Positionen entlang der gesamten Ausdehnung des Gyrus dentatus bei 400-facher Vergrößerung und mindestens 50 zufällig ausgewählten interessierenden Zellen pro Hemisphäre für die Co-Markierung mit anderen Markern analysiert. </li><li> Multiplizieren die resultierende Prozentsatz der co-markierten Zellen (% / 100) mit der Gesamtzahl der neugeborenen Zellen zu berechnen absoluteNummern bestimmter neugeborenen Zellpopulationen. </li></ol>

<ol>
	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).</li><li>Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+integration+and+plasticity+of+new+neurons+in+the+adult+hippocampus.">Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus.</a> J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).</li><li>Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+period+for+enhanced+synaptic+plasticity+in+newly+generated+neurons+of+the+adult+brain.">A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain.</a> Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).</li><li>Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+is+adult+hippocampal+neurogenesis+necessary+for+learning?+evidence+from+animal+research.">When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research.</a> Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).</li><li>Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+and+new+memories:+how+does+adult+hippocampal+neurogenesis+affect+learning+and+memory.">New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).</li><li>Encinas, J. M., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+quantitating+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+brain.">Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain.</a> Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).</li><li>Burns, K. A., Kuan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+doses+of+bromo-+and+iododeoxyuridine+produce+near-saturation+labeling+of+adult+proliferative+populations+in+the+dentate+gyrus.">Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus.</a> Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).</li><li>Cameron, H. A., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+produces+a+large+pool+of+new+granule+cells+in+the+dentate+gyrus.">Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus.</a> J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).</li><li>Vega, C. J., Peterson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+proliferative+history+in+tissue+revealed+by+temporal+halogenated+thymidine+analog+discrimination.">Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination.</a> Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).</li><li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ki-67+protein:+from+the+known+and+the+unknown.">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).</li><li>Brown, D. C., Gatter, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki67+protein:+the+immaculate+deception.">Ki67 protein: the immaculate deception.</a> Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).</li><li>Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+neurogenesis+in+the+central+nervous+system+using+nestin+promoter-GFP+transgenic+mice.">Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice.</a> Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).</li><li>Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+hippocampal+neurons+in+adult+mice+living+in+an+enriched+environment.">More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment.</a> Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).</li><li>Sicinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+D2+is+an+FSH-responsive+gene+involved+in+gonadal+cell+proliferation+and+oncogenesis.">Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis.</a> Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).</li><li>Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+kinetics+of+dentate+gyrus+neurogenesis+in+the+absence+of+cyclin+D2.">Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2.</a> BMC Neurosci. 13, 46 (2012).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis:+paradigms,+pitfalls,+limitations,+and+validation.">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).</li><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunocytochemistry:+an+update.">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).</li><li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+(CldU+and+IdU)+in+primary+tissue.">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).</li><li>Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+epitope+retrieval+in+diagnostic+immunohistochemistry:+a+concise+review+with+practical+considerations.">Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations.</a> Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Quantifizierung und Identifizierung von Subpopulationen von neugeborenen Zellen ist ein zentrales Thema in der adulten Neurogenese Forschung. Die Kombination von Proliferationsmarker und Antikörper gegen Proteine ​​in bestimmten Phasen der adulten Neurogenese ausgedrückt ermöglicht immunhistochemischen Nachweis dieser Subpopulationen. Einige der Antikörper oder Antikörperkombinationen erfordern spezifische Färbung Bedingungen. Kennzeichnung von sich teilenden Zellen mit synthetisch...

Zwei Hirnregionen konstitutiv erzeugen neue Nervenzellen während des gesamten Lebens, das Subventrikularzone der Seitenventrikel und der Subgranularzone (SGZ) des Gyrus dentatus des Hippocampus (DG). Die neugeborenen Neuronen stammen aus neuralen Vorläuferzellen und durchlaufen verschiedene Stadien der morphologischen und physiologischen Entwicklung vor Erreichen der Geschlechtsreife 1,2. Aus einem sich langsam teil radialen Gliazellen artigen Stammzellen (Typ 1) aufeinanderfolgenden Stufen der transit amplifying Zwischenvorläuferzellen entstehen. Je mehr undifferenzierte Untertypen (Typ 2a und Typ 2b) eine unregelmäßige Form mit kurzen, tangentialen Prozesse. Sie erzeugen Neuroblasten (Typ 3), die nach und nach in den Zellzyklus verlassen, um unreife Neuronen werden (mit Dendriten erweitert in Richtung der molekularen Schicht) und schließlich in den Hippocampus-Netzwerk als reife Körnerzellen zu integrieren. Aufgrund ihrer besonderen physiologischen Eigenschaften diese Zellen stellen die Schaltung mit verbesserter Plastizität 3 suggesting eine einzigartige Rolle bei der Funktion des Hippocampus. Eigentlich Studien der letzten zehn Jahre generiert erhebliche Beweise dafür, dass die adulte Neurogenese trägt zur räumlichen Gedächtnisses, Muster Trennung und emotionales Verhalten 4,5. Adulte Neurogenese kann durch verschiedene Ansätze untersucht werden. Thymidinanaloga integrieren in die DNA während der S-Phase des Zellzyklus und ermöglichen Geburt aus, Quantifizierung und Schicksal Analyse der neugeborenen Zellen 6-8. Sequentielle Anwendung unterschiedlicher Thymidin-Analoga (zB CldU, EdU oder IdU) kann zur Zellerneuerung oder Zellpopulationen zu verschiedenen Zeitpunkten während des Verlaufs des Experiments 9 geboren untersuchen. Eine Alternative, endogenen Marker für Zellproliferation Ki67. Es ist in sich teilenden Zellen in allen Phasen des Zellzyklus (G1, S, G2, M), mit Ausnahme der Ruhephase (G0) und dem Beginn des G1 10,11 ausgedrückt. Um den Phänotyp Neugeborenen Zellpopulationen in der Erwachsenen dentat analysierene Gyrus mehrere stufenspezifische molekulare Marker wie GFAP, Nestin, DCX und NeuN 1,6 verwendet werden. GFAP ist ein Marker für reife Astrozyten wird aber auch in radialer Gliazellen-ähnlichen Zellen in der adulten Vorderhirn exprimiert. Nestin ist ein Zwischenfaden spezifisch für radiale Glia-ähnlichen Zellen und frühen Zwischen Progenitorzellen. DCX ist ein Mikrotubuli-assoziierten Protein in Zwischenvorläuferzellen, Neuroblasten und unreife Neuronen exprimiert. Auf der Grundlage der (Mit-) Expression dieser drei Marker und die morphologischen Merkmale der markierten Zellen vier verschiedene Vorläuferzelltypen zu unterscheiden: Typ 1 (GFAP +, Nestin +, DCX -), Typ 2a (GFAP - Nestin + , DCX -) Typ 2b (GFAP - Nestin +, DCX +) und Typ 3 (GFAP - Nestin -, DCX +) ein. Co-Kennzeichnung von DCX mit NeuN, die in postmitotischen Neuronen exprimiert wird, ermöglicht die Differenzierung von immature (DCX +, NeuN +) und reifen (DCX -, NeuN +) Körnerzellen. Die oben genannten Markierungen werden häufig für Immunofluoreszenz co-Kennzeichnung und anschließende konfokale Mikroskopie verwendet, um die Anzahl und die Identität von neugeborenem Zellen zu analysieren. Dies erfordert typischerweise Antikörper aus verschiedenen Wirtsspezies zu unerwünschten Antikörper Kreuzreaktivität verhindern. Allerdings ist die Mehrzahl der primären Antikörper für die Neurogenese Forschung angehoben entweder in Kaninchen oder Mäusen (zB Maus-α-BrdU, Maus α-NeuN, Kaninchen α-Ki67, Kaninchen α-GFAP). Dies führt zu starken Einschränkungen hinsichtlich der Anzahl und Kombination von Antigenen, die in einer einzigen Scheibe ausgewertet werden konnte. Dies wiederum nicht steigt nur der Färbung Aufwand, da mehrere Färbungen müssen durchgeführt werden, sondern könnte auch die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu beeinträchtigen. Darüber hinaus sind einige Antigene anfällig für Formalinfixierung induzierte Epitop Maskierung (zB Ki67Nestin). Wir beschreiben hier Änderungen von den klassischen Ein- und Mehr Immunomarkierung Protokolle (zB Epitopdemaskierung, mehrere aufeinander folgende Immunfärbung, die Verwendung von Nestin-GFP transgenen Mäusen, 12), die viele dieser Probleme zu überwinden. Insbesondere erlaubt die sequenzielle Mehrfachimmunfärbungsprotokolls gegen bis zu vier unterschiedlichen Antigene auch wenn ein Teil der Antikörper wird aus dem gleichen Wirt stammen. Dies ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis von Typ 1, Typ 2a, 2b Typ und Typ 3-Vorläuferzellen, sowie ihre proliferative Aktivität innerhalb einer einzelnen Seite.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="665">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:277px;">Name</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:131px;">Comments &#38; Dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="13">
			<td height="13" style="height:13px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thymidine analog administration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine, BrdU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285</td>
			<td rowspan="4" style="width:131px;">toxic (mutagenic, teratogenic)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Chloro-2&#8242;-deoxyuridine, CldU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6891</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Chloro-2&#8242;-deoxyuridine, CldU</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2105478</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Iodo-2&#8242;-deoxyuridine, IdU</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100357</td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane-Actavis</td>
			<td>Piramal Healthcare</td>
			<td>700211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Paraformaldehyde powder (PFA)</td>
			<td>Riedel-De H&#228;en</td>
			<td>16005</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Perfusion pump PD5206</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>523-52060-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Masterflex Tygon lab tubing, &#216; 0.8 mm&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>06409-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freezing microtome Microm HM 400</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">24 Well Cell Culture Multiwell Plates</td>
			<td style="width:147px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefal Vitacuisine Steamer</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>VS 4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vectastain Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">DAB (3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-5637</td>
			<td style="width:131px;">carcinogenic, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">rabbit IgG1 &#945;-Ki67</td>
			<td style="width:147px;">Novocastra/ Leica Biosystems</td>
			<td>NCL-L-Ki67MM1</td>
			<td style="width:131px;">DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rabbit &#945;-GFAP, AS-3-GF</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>173 002</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat IgG (H+L) &#945;-GFP</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>R1091P</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">mouse IgG1 &#945;-nestin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6142</td>
			<td style="width:131px;">1:200; requires epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">guinea pig IgG (H+L) &#945;-Doublecortin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">rat IgG2a &#945;-BrdU (ascites)</td>
			<td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td>
			<td>OBT0030CX</td>
			<td style="width:131px;">for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">rat IgG2a &#945;-BrdU (purified)</td>
			<td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td>
			<td>OBT0030&#160;&#160;</td>
			<td style="width:131px;">for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">mouse IgG1&#312; &#945;-BrdU</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td style="width:131px;">for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse IgG1 &#945;-NeuN</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-065-152</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rat IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>712-065-150</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-065-151</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat &#945;-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11006</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-097-003</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-605-151</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>706-605-148</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>712-295-150</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-295-152</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>706-296-148</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-Rhodamine Red-X&#160;</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>016-290-084</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat &#945;-rabbit IgG (H+L)-AMCA</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-155-144</td>
			<td style="width:131px;">1:250, works only with rabbit &#945;-GFAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D1306</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blocking</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fab-fragment donkey &#945;-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-007-003</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fab-fragment donkey &#945;-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-007-003</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal donkey serum</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal rabbit serum</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>011-000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal goat serum</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>005-000-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Cresyl violett</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Neo-Clear</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>109843</td>
			<td style="width:131px;">non-toxic xylene substitute</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Neo-Mount</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>109016</td>
			<td style="width:131px;">permanent mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Axioskop 2</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">LSM 710</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis

Neurogenese ist ein stark reguliert, mehrstufiges Verfahren, bei dem neue Neuronen aus einer aktivierten neuronalen Stammzelle über setzen verstärkt Zwischenvorläufertypen erzeugt. Jede dieser Subtypen exprimiert ein Satz spezifischer molekularer Marker, der zusammen mit spezifischen morphologischen Kriterien können für die Identifikation verwendet werden. Typischerweise werden Immuntechniken aufgebracht mit Subtyp-spezifische Antikörper in Kombination mit exo- oder endogenen Proliferationsmarker. Wir beschreiben hier Immunmarkierung Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung von allen Stadien der Erwachsenen Neurogenese. Diese umfassen die Anwendung der Thymidinanaloga, transkardialer Blutung, Gewebeverarbeitung, hitzeinduzierter Epitopdemaskierung, ABC Immunhistochemie, mehrere indirekte Immunfluoreszenz, konfokale Mikroskopie und Zell Quantifizierung. Außerdem eine sequentielle Mehrfachimmunfluoreszenz-Protokoll, das Probleme u umgeht präsentieren wirsually sich aus der Notwendigkeit der Verwendung von primären Antikörpern in den gleichen Wirtsspezies erhöht. Es ermöglicht eine genaue Identifizierung aller Hippocampus-Vorläuferuntertypen zusammen mit einem Proliferationsmarker in einem einzigen Abschnitt. Diese Techniken sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Regulierung der unterschiedlichen Vorläufertypen parallel, ihre Beteiligung an der Hirnerkrankungen und deren Rolle in spezifischen Gehirnfunktionen zu untersuchen.

Wir verwendeten die vorstehend beschriebenen zu quantifizieren und zu charakterisieren neugeborenen Zellen in den postnatalen und Hippocampus Methoden. Daher haben wir Wildtyp und Neurogenese-defizienten Cyclin D2 Knock-out (CCND2 KO) Mäuse unter Bedingungen bekannt, die Rate der Neurogenese (dh angereicherten Umgebung, EE) 13,14 beeinflussen gebracht. Immunhistochemische Färbung DAB entweder gegen Ki67, BrdU CldU oder IdU konsistent zeigten unterschiedliche neugeborenen Zellzahlen zwische...

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis at JoVE.com

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Immunhistochemie und Multiple Markierung mit Antikörper aus dem gleichen Host Arten, die Adult Neurogenese Studieren

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

immunohistochemistry-multiple-labeling-with-antibodies-from-same-host

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.4K Aufrufe.  Jena University Hospital. This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Serie: Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissektion und Immunhistochemie von Larven, Puppen und Erwachsenenbildung<em&gt; Drosophila</em&gt; Netzhäute

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Forschung

Neurowissenschaften

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Funktionelle Abfrage der Erotik Hypothalamus Neurogenese mit Brennradiologische Hemmung

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Membrane Potential Dye Imaging von Ventromedial Hypothalamus Neuronen aus erwachsenen Mäusen zu Glucose Sensing Studieren

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

Methoden zur Analyse und Modulation von NF-kappaB-abhängigen adulte Neurogenese

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen im erwachsenen Zebrafisch mit Fluoreszenzfarbstoffen

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive functions including decision making, sensory-guided behavior or memory. To understand how such intricate neuronal networks perform such tasks, a crucial step is to determine the function (or electrical activity) of individual cell types within the network, preferentially when the animal is performing a relevant cognitive task. Additionally, it is equally important to determine the anatomical structure of the network and the morphological architecture of the individual neurons to allow reverse engineering the cortical network. Technical breakthroughs available today allow recording cellular activity in awake, behaving animals with the valuable option of post&#160;hoc identifying the recorded neurons. Here, we demonstrate the juxtasomal biocytin labeling technique, which involves recording action potential spiking in the extracellular (or loose-patch) configuration using conventional patch pipettes. The juxtasomal recording configuration is relatively stable and applicable across behavioral conditions, including anesthetized, sedated, awake head-fixed, and even in the freely moving animal. Thus, this method allows linking cell-type specific action potential spiking during animal behavior to reconstruction of the individual neurons and ultimately, the entire cortical microcircuit. In this video manuscript, we show how individual neurons in the juxtasomal configuration can be labeled with biocytin in the urethane-anaesthetized rat for post&#160;hoc identification and morphological reconstruction.

To understand the structure of neuronal networks, functional and morphological characterization of individual neurons is a necessity. Here, we demonstrate juxtasomal biocytin labeling, which allows electrophysiological recordings in the extracellular configuration, yet maintaining the ability to intracellularly label the neuron for post&#160;hoc reconstruction of dendritic and axonal architecture.

Juxtasomal Biocytin Labeling, um die Struktur-Funktions-Beziehung der einzelnen kortikalen Neuronen Studieren

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

Die Beurteilung Primäre Neurogenese in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.