Die Markierung von Stammzellen und ihren Nachkommen mit einer induzierbaren transgenen Abstammungsverfolgungs-Mauslinie ermöglicht eine räumliche und zeitliche Analyse der Aktivierung, Proliferation, Migration und/oder Differenzierung von adulten Stammzellen im Gehirn in vivo. Die Abstammungsverfolgung kann neue Informationen über die Verpflichtung der Abstammung, die Reaktion auf Interventionen und die Multipotenz aufdecken. Zu den Vorteilen transgener Linienverfolgungsansätze gehören die Spezifität der Rückverfolgung einer bestimmten Zelllinie, die unauslöschliche Expression des fluoreszierenden Proteins unabhängig vom Zellumsatz oder der Zelldifferenzierung, die geringe Toxizität von Doxycylin, die bedingte Aktivierung und die Benutzerfreundlichkeit bei gängigen nachgelagerten Assays auf Abstammungsspurengeweben, einschließlich Immunfärbung und Immunfluoreszenz.
Aufgrund der breiten Implikation von Plastizität und Zelle im erwachsenen Gehirn wird die Charakterisierung und Analyse von adulten Stammzellen dazu beitragen, über die Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen, metabolische Auswirkungen auf die Plastizität des Gehirns, das Altern und andere verwandte Erkrankungen zu informieren. Um zu beginnen, gleitet auf Raumtemperatur und fixiert mit eiskaltem Aceton für 15 Minuten. Waschen Sie die Objektträger fünf Minuten lang im 1X-Spülpuffer und schütteln Sie sie bei Raumtemperatur zwischen den einzelnen Schritten mit 60 Umdrehungen pro Minute.
Permeabilisieren Sie für das Stehen von Kernantigenen mit 0,3% Triton X-100 für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Permeabilisieren Sie für den Stand von zytoplasmatischen Antigenen mit 0,3% Tween-20 für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Führen Sie den Antigenabruf durch, indem Sie Objektträger in 50 bis 100 Millilitern 1x DAKO Antigen Retrieval Solution für 10 Minuten zweimal auf niedrigem Niveau abfüllen.
Als nächstes fünf Minuten bei Raumtemperatur mit Puffer abspülen. Objektträger in 0,3%Typogen Schwarz in 70%Ethanol für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann mit Spülpuffer waschen. Ziehen Sie eine hydrophobe Barriere um das Gewebe.
Blockieren Sie für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius mit blockierendem Reagenz. Und mit primärem Antikörper inkubieren, verdünnt in Antikörperverdünnungsmittel über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Dias für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Inkubieren Sie am nächsten Tag Abschnitte in Alexa Fluor-Sekundärantikörpern für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Objektträger zweimal im Spülpuffer für 10 Minuten. Decken Sie Gehirnabschnitte in 100 Mikrolitern eines bis 500 Anti-GFP-Antikörpers ab, der an AlexaFluor 488 konjugiert ist, und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius, um das endogene Fluor4 zu verstärken und die verfolgten Zellen zu markieren.
Am nächsten Tag zweimal mit Spülpuffer waschen. Und dann fünf Minuten lang in fließendem DI-Wasser waschen. Fleck mit 100 Nanogramm pro Milliliter 4'6-Diamidino-2-phenylindol für fünf Minuten entgegensetzen.
Dann fünf Minuten lang in fließendem DI-Wasser waschen. Fügen Sie einen Tropfen fluoreszierendes sicheres Befestigungsmedium auf jeden Gewebeabschnitt hinzu und versiegeln Sie es mit einem 22 Millimeter x 22 Millimeter großen Deckglas. Die Bildgebung wird am Tag der Montage empfohlen, um ein optimales Signal zu gewährleisten.
Um mit der Fixierung und dem Schneiden nach transkardialer Perfusion zu beginnen, werden die Gehirne nach der Fixierung über Nacht bei 4% PFA bei vier Grad Celsius aufgenommen. Und dann wieder für eine Stunde bei Raumtemperatur. Gehirnwäsche in 1x PBS für eine Stunde zweimal bei Raumtemperatur.
Schneiden Sie das Gehirn mit dem sagittalen Hirnblock in einen Millimeter dicke Abschnitte und legen Sie es in fünf Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen mit 1x PBS. Für die Methanol-Vorbehandlung beginnen Sie mit dem Waschen mit 1x PBS für eine Stunde zweimal bei Raumtemperatur. Waschen Sie 50% Methanol für eine Stunde bei Raumtemperatur.
80%methanol eine Stunde bei Raumtemperatur einwaschen. In 100% Methanol für eine Stunde, zweimal, bei Raumtemperatur waschen. Bleichmittelproben mit 5%Wasserstoffperoxid in 20%Dimethylsulfoxid und Methanol bei vier Grad Celsius über Nacht.
Nach dem Bleichen die Proben zweimal bei Raumtemperatur eine Stunde lang in Methanol waschen. 20% Dimethylsulfoxid und Methanol zweimal bei Raumtemperatur eine Stunde lang waschen. 80%methanol eine Stunde bei Raumtemperatur einwaschen.
Waschen Sie 50% Methanol für eine Stunde bei Raumtemperatur. In PBS zweimal eine Stunde bei Raumtemperatur waschen. In PBS 0,2%Triton X-100 zweimal eine Stunde lang bei Raumtemperatur waschen.
Für die Immunfärbung von klärenden Gehirnen beginnen Sie mit der Inkubation von Proben in 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 20% DMSO, 0,3 molaren Glycin, bei 37 Grad Celsius über Nacht auf einem Orbitalschüttler. Block in 1x PBS, 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 6% Ziegenserum bei 37 Grad Celsius für drei Tage auf einem Orbital-Shaker. Waschen Sie Proben in 1x PBS, 0,2% Tween-20, 10 Mikrogramm pro Milliliter Heparin-Natriumsalz aus Schweineschleimhaut für eine Stunde zweimal bei 37 Grad Celsius.
Als nächstes inkubieren Sie in 1x PBS, 0,2% Tween-20, 10 Mikrogramm pro Milliliter Heparin, 5% DMSO, 3% Ziegenserum mit einer bis 500 Konzentration Kaninchen Anti-GFP AlexaFluor 488 bei 37 Grad Celsius auf einem Orbitalshaker für zwei Tage. Waschen Sie Proben in 1x PBS, 0,2% Tween-20 mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Heparin für eine Stunde bei 37 Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler dreimal und dann einmal täglich für zwei Tage. Inkubieren Sie Proben über Nacht in einem Milliliter 50% Tetrahydrofuran und Wasser.
Inkubieren Sie Proben für eine Stunde in einem Milliliter 80% THF Tetrahydrofuran und Wasser. Inkubieren Sie Proben zweimal für eine Stunde in 100% Tetrahydrofuran. Proben mit einem sterilen Tuch trocknen und in Dichlormethan inkubieren, bis sie auf den Boden der Durchstechflasche sinken.
Nicht länger als 60 Minuten inkubieren. Inkubieren Sie Proben in einem Milliliter Dibenzylether, bis sie klar sind. Lagern Sie die Proben in Dibenzylether bei Raumtemperatur, bis sie zur Abbildung bereit sind.
Um immungefärbte Hirnschnitte abzubilden, analysieren Sie Objektträger mittels konfokaler Mikroskopie, bei denen die Co-Expression mehrerer Antikörper bestätigt werden kann. Wir verwenden ein Leica Stellaris Fünfmikroskop mit HyD S Hybriddetektoren. Um bereinigte Gehirne abzubilden, verwenden Sie ein invertiertes konfokales Mikroskop mit einer automatisierten Bühne und einer automatisierten Kachelfunktion.
Beginnen Sie, indem Sie einen gereinigten Gehirnabschnitt flach gegen eine Glasbodenschale legen, die in Dibenzylether eingetaucht ist. Ein merklicher Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen verschiedenen Gehirnregionen und verschiedenen Zelltypen wurde nach einer Pulsjagdperiode in den von der Abstammung verfolgten Gehirnen beobachtet. Aderhautepithelzellen im Aderhautplexus hatten eine dicke Zellmembran und ein starkes grünes fluoreszierendes Signal, was darauf hindeutet, dass sie von Tert-positiven Zellen stammten, die leicht von den umgebenden Zellen unterschieden werden konnten.
Die anderen kleineren Zelltypen im Gliederplexusstroma hatten ein schwächeres GFP-Signal. Im Kleinhirn exprimierten Bergmann-Gliazellen höhere GFP-Spiegel als Korbzellen, und es gab auch Unterschiede in der GFP-Expression zwischen einzelnen Korbzellen. Für fabriksensorische Neuronenaxone innerhalb der glomerulären Schicht des Riechkolbens exprimierten auch hohe Konzentrationen von GFP olfaktorische sensorische Neuronenaxone, die die glomeruläre Schicht des Riechkolbens füllen, exprimierten hohe Konzentrationen von Membrantomaten oder rote Fluoreszenz im Vergleich zu den meisten anderen Gehirnregionen, selbst wenn die gleichen Neuronen GFP-positiv sind, was darauf hindeutet, dass einige Zellen während der Linienverfolgung langsamer das Mtomatensignal zu verlieren schienen.
Im Gegensatz dazu exprimierten GFP-positive Zellen im Aderhautplexus einen niedrigen mTomato-Gehalt. In den meisten anderen Hirnregionen exprimieren Tomatensignale in den meisten Zelltypen auf niedrigem Niveau, wobei Endothelzellen zu den wenigen Zellen gehören, deren Fluoreszenzsignal hell genug war, um sich deutlich vom rot fluoreszierenden Hintergrund des Hirngewebes abzuheben. Das Wichtigste, woran man sich erinnern sollte, ist, dass das fluoreszierende Signal in gereinigten Gehirnen schneller verblasst als die meisten anderen Immunassays.
Denken Sie daran, Ihre Proben so schnell wie möglich und innerhalb von sieben Tagen abzubilden. Im Anschluss können die Bildgebung der Gehirnschnitte oder der klaren Gehirne, die Einfärbung der Marker mit den GFP-Signalen und unsere Quantifizierung der Fluorenz mit Hilfe von Softwareprogrammen erfolgen.
