Dieses Protokoll kann beantworten, wie verschiedene Schaltkreise im Gehirn die adulte Neurogenese regulieren und insbesondere, wie stimulierende oder hemmende neuronale Schaltkreise die Proliferation adulter neuronaler Stammzellen beeinflussen. Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie in der Lage ist, gezielt gewünschte neuronale Schaltkreise anzusprechen und die Belastung der Tiere zu reduzieren. Diese Methode kann Einen einblick in die Art und Weise geben, wie verschiedene Gehirnkreise die Adult Neurogenese regulieren, insbesondere, wie bestimmte Zelltypen, die bestimmte Neurotransmitter freisetzen, die Proliferation adulter neuronaler Stammzellen regulieren.
Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie die Gewebeabschnitte in PBS und montieren Sie fünf bis acht Abschnitte auf einem positiv geladenen Dia in serieller Reihenfolge von vorder nach hinten. Lassen Sie die Gewebeabschnitte bei Raumtemperatur für zwei bis fünf Minuten trocknen und halten Sie sich vollständig an den Dias. Bereiten Sie als Nächstes den Citratpuffer in einem Container vor.
Den Citratpuffer in einer Mikrowelle fünf Minuten erhitzen, bis die Lösung kocht. In der Zwischenzeit die montierten Abschnitte in einen Glasschieberhalter legen. Nach fünf Minuten den Diahalter mit den Abschnitten vorsichtig in eine Pipettenbox legen.
Stellen Sie die Mikrowellenleistung auf 50 % und die Kochzeit auf sieben Minuten ein. Starten Sie einen Timer für sieben Minuten, und überwachen Sie die Lösung. Stoppen Sie den Mikrowellenherd, wenn die Lösung zu kochen beginnt, und setzen Sie die Mikrowelle nach dem Kochen stopp.
Stoppen Sie, nachdem der Timer abgelaufen ist, auch wenn die Kochzeit auf der Mikrowelle noch nicht abgelaufen ist. Das Ziel dieses Schritts ist es, das Wasser direkt unter der Siedetemperatur zu halten, ohne das Wasser übermäßig kochen zu lassen. Zu viel Kochen entfernt Gewebeabschnitte aus der Folie.
Dann übertragen Sie die warme Box mit Citratpuffer und Geweberutschen in einen Eiskübel zum Kühlen. Bedecken Sie die Box, und warten Sie etwa 30 Minuten oder bis die Lösung kühl ist, bevor Sie zu Thymidin analoge Färbung. Um die Gewebeabschnitte mit Thymidin analog zu färben, entfernen Sie die Gewebeabschnitte aus dem Citratpuffer.
Lassen Sie die Gewebeabschnitte trocknen und vollständig an den Dias haften, bevor Sie einen Rand mit einem hydrophoben Stift ziehen. Als Nächstes durchperimisieren Sie die Abschnitte mit Permeabilisierungspuffer für 20 bis 30 Minuten. Waschen Sie die Abschnitte zweimal mit TBS-Triton für jeweils fünf Minuten.
Bereiten Sie dann eine Edu-Reaktionslösung vor. Inkubieren Sie die Abschnitte in Edu Reaktionslösung für 30 Minuten bis eine Stunde. Anschließend dreimal in TBS-Triton für jeweils fünf Minuten waschen.
Bedecken Sie die Dias in Aluminiumfolie oder legen Sie sie in eine lichtgeschützte Kammer, um sie nach diesem Schritt vor Licht zu schützen. Überprüfen Sie in diesem Stadium, ob die Edu-Reaktion mit einem Fluoreszenzmikroskop funktioniert. Edu-markierte Zellen sollten beobachtet werden, wenn die Reaktion wirkt.
Blockieren Sie nun die montierten Gewebeabschnitte mit einem Blockierpuffer, der im selben Tier wie der sekundäre Antikörper angehoben wird, für 30 Minuten bis zu einer Stunde. Dann waschen Sie sie zweimal in TBS-Triton für jeweils fünf Minuten. Bereiten Sie während des Sperrschritts die primäre Antikörperlösung vor, indem Sie den primären Antikörper im Blockierpuffer mischen.
Anschließend fügen Sie 250 Mikroliter Primärantikörperlösung pro Schlitten hinzu, um sicherzustellen, dass die Gewebeabschnitte vollständig untergetaucht sind, und inkubieren Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur. Am nächsten Tag waschen Sie die Gewebeabschnitte dreimal in TBS-Triton für jeweils fünf Minuten, um überschüssigen Primärantikörper zu entfernen. Dann inkubieren Sie die Gewebeabschnitte in fluorophorkonjugierten Sekundärantikörpern, die in blockblockierender Pufferlösung für zwei Stunden bei Raumtemperatur hergestellt werden.
Waschen Sie die Gewebeabschnitte dreimal in TBS-Triton für jeweils fünf Minuten, um überschüssige sekundäre Antikörper zu entfernen. Als nächstes 300-Mikromolar-DAPI-Lösung bei 1 bis 100 in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur auftragen. Danach waschen Sie die Gewebeabschnitte dreimal in PBS für jeweils fünf Minuten, um überschüssige DAPI zu entfernen, und entfernen Sie den PAP-Stiftkreis um das Gewebe mit einem Wattestäbchen.
Lassen Sie die Abschnitte trocknen, bevor Sie Montagemedien auftragen und mit Abdeckungen bedecken. Öffnen Sie mit der Imaging-Software das Bild jedes Dentate-Gyrus-Abschnitts als zusammengesetztes Bild mit den Kanälen, die in unterschiedlichen Farben verschmolzen sind, um die Kolokalisierung einfach zu visualisieren. Messen Sie dann die Fläche des Gyrus in jedem Abschnitt mit dem Polygonauswahlwerkzeug, und zeichnen Sie alle Abschnitte jeder Maus auf.
Dies wird die Fläche des Dentate Gyrus sein, die verwendet wird, um die Dichte zu berechnen. Mit dem Software-Plugin-Zellzähler unter Plugins, Analyze, Cell Counter, Cell Counter, notieren Sie die Anzahl der Zellen im Dentate Gyrus, die den primäre Antikörper und Thymidin-AnalogE aus dem zusammengesetzten Bild kolokalisieren. Zeichnen Sie außerdem die Gesamtzahl der Edu-positiven und nestin-positiven Zellen mit einem radialen Prozess auf.
Im Falle von Nestin ist es sehr wichtig, auf die Morphologie der Zellen zu achten. Bei der Quantifizierung neuronaler Stammzellen stellen Sie sicher, dass nur Zellen mit einem radialen Prozess quantifiziert werden. Geben Sie die Zellenanzahl in eine Tabellenkalkulationssoftware ein, um alle Daten für die spätere Analyse zu kompilieren.
Um beispielsweise die Stammzelldichte zu erhalten, dividieren Sie die Summe der nestin-positiven und Edu-positiven Zellen durch die Summe des Dentat-Gyrusvolumens in jedem Tier. Berechnen Sie das Volumen jedes Abschnitts, indem Sie die Fläche mit den gesamten Z-Schritten multiplizieren, wobei davon ausgegangen wird, dass jeder Schritt ein Mikrometer beträgt. In diesem Protokoll sollten die Gesamtschritte nahe 40 betragen, da Gewebe mit 40 Mikrometern geschnitten wird.
Anschließend berechnen Sie die Gesamtzahl der proliferierenden Zellen, Prozent der sich vermehrenden neuronalen Stammzellen und der gesamten proliferierenden Zellen nach der Stimulierung kontralateraler Mooszellen. Durch die Verwendung eines Thymidin-Analog-Edu- und Antigen-Retrievals für die Nestin-Färbung wurden die wueligen neuronalen Stammzellen erfolgreich beschriftet. Zusätzlich, durch Das Weglassen der Antigen-Retrieval-Schritt, Tbr2-positive neuronale Vorläufer und Neuroblast und DCX-positive Neuroblast und unreife Neuronen wurden gekennzeichnet.
Hier ist ein Beispiel für die Fläche quantifiziert und verwendet, um Zelldichte zu berechnen, und hier ist ein Beispiel für das montierte Gewebe auf einem Dia. Sowohl erfolgreiche als auch subpar-Experimente werden zum Vergleich gezeigt. Schließlich gibt es verschiedene Quantifizierungen, die aus einem erfolgreichen Experiment gewonnen werden können.
Die Quantifizierungen umfassen die Dichte der sich ausbreitenden neuronalen Stammzellen, den Prozentsatz der sich ausbreitenden neuronalen Stammzellen, die gesamten proliferierenden Zellen und den gesamten Stammzellpool. Bei der kontralateralen Stimulation moosiger Zellen wurde eine Abnahme der proliferation neuronaler Stammzellen beobachtet. Der wichtigste Schritt in diesem Verfahren ist die Kontrolle des Tissue-Kochens in der Mikrowelle.
Die Gewebeabschnitte werden beschädigt, wenn sie zu lange kochen. Nach diesem Verfahren konnte man verschiedene virale Vektoren injizieren, um dieselbe Schaltung anzusprechen. Zum Beispiel, wenn man einen neuronalen Kreislauf stimulieren würde, könnte man ihn mit einem hemmenden DREADD-Virus hemmen.
Die in diesem Protokoll vorgestellten Techniken sind nicht neu. Die Stärke dieses Protokolls ist jedoch, dass es alle Schritte abdeckt, die für die Beantwortung von Fragen über die Auswirkungen der Schaltkreise auf die Adult Neurogenese erforderlich sind.
