Wir danken Philipp Denninger um Hilfe bei der Vorbereitung und Video Bhavna Chaudhuri für die Bereitstellung von pflanzlichen Linien auszudrücken FRET-Sensoren. Diese Arbeit wurde durch Mittel der National Science Foundation (MCB 1021677), das Department of Energy (DE-FG02-04ER15542) zu WBF, die National Institutes of Health und dem Howard Hughes Medical Institute an SRQGG unterstützt wurde durch ein EMBO lange unterstützt -Term Fellowship. MM wurde von der Alexander von Humboldt-Stiftung unterstützt.

Hinweis: Führen Sie alle Schritte vorbereitenden Schritte unter sterilen Bedingungen. 1. Vorbereitung von Kunststoff-Kegel für die Keimung der Samen <ol><li> In eine 10 cm Petrischale mit Wachstumsmedium, das 1% Agar in einer Dicke von 5 mm. Wir verwenden eine halbe Stärke modifizierte Hoagland Medium 4, aber mittel-Zusammensetzung sollte so gewählt werden, um individuelle experimentellen Anforderungen angepasst werden. </li><li> Während das Medium noch flüssig ist, verwenden Sie einen Mehrkanal-Pipette bis 10 ul Pipettenspitzen mit 5 ul Medium aus der Petrischale zu füllen. </li><li> Lagern Sie die gefüllten Spitzen in der Pipettenspitze Feld, bis das Medium ist solide, dann bis 4 mm langen Kunststoff-Kegel und aufrecht in eine Petrischale mit einem soliden Wachstum mittel geschnitten. </li></ol> 2. Samenkeimung und Wachstum des Keimlings <ol><li> Auftauchen sterilisieren Samen in 5% NaOCl für 5 min waschen dreimal mit sterilem Wasser, dann einen einzigen Samen oben auf jeder der mittel-gefüllten Kegels. </li><li> Verschließen Sie die Schale mit Mikroporeklebeband (3M) und bei 4 ° C zur Keimung zu synchronisieren. </li><li> Nach drei Tagen, übertragen Sie die Platten zu einem Wachstum Schrank, um Keimung zu beginnen. Unser Wachstum Bedingungen sind 23 ° C bei einer hohen light/8h 16h Dunkel-Zyklus (Lichtintensität: 100 uE m -2 s -1). </li><li> Zwischen 5 und 7 Tage nach der Keimung, die Sämlinge sollten bereit sein, für die Übertragung zum RootChip. Zu diesem Zeitpunkt sollte Wurzelspitzen in der Nähe der unteren Auslässe der Kunststoffkegeln sein. Überprüfen Sie Sämling Gesundheit, Wurzellänge und, falls zutreffend, Expression eines fluoreszierenden Marker unter einem Binokular. </li><li> Markieren Sie einzelne Setzlinge für die Übertragung auf den Chip. Wählen Sie zehn oder so Sämlinge falls man diese während der Übertragung beschädigt. </li></ol> 3. Transfer von Sämlingen auf die RootChip <ol><li> Um die RootChip für langfristige Experimente sterilisieren, wickelndas Gerät in Seidenpapier, in eine Glas-Petrischale, und Autoklaven. </li><li> Sobald die RootChip abgekühlt ist, bedecken Sie es mit flüssigen Nährmedium. Die RootChip sollten vollständig eingetaucht werden, sondern der Flüssigkeitsstand sollte nicht mehr als 3 mm über der Oberfläche RootChip sein. </li><li> Mit einem 20 ul Pipette, ziehen Medium durch die Wurzel Einlass-und Auslass Kammer, um die Beobachtung Kammer mit Medium füllen. </li><li> Stecken Kunststoffkonen in Schritt 2.5 in die Buchten RootChip ausgewählt. Die Kegel sollte eng anliegen in den Buchten. Da die RootChip auf einer dünnen Schicht aus optischem Glas montiert ist, nicht zu viel Druck auf den Chip. </li><li> Inkubieren Sie die RootChip über Nacht in einem flüssigen Medium. Um zu verhindern, schwimmend, legen Sie zwei Glasplättchen auf den Chip. Fügen Sie einen Magnetrührer und schließen Sie die Schüssel. </li><li> Übertragen Sie die Montage auf einem Magnetrührer und vorsichtig geschwenkt, das Medium. </li><li> Die RootChip die Buchten schneiden die Sender zu einem Winkel von 30 ° auf das Gerät normal FACIlitate Wurzelwachstum in die Kanäle (Abbildung 1A). Zur weiteren Unterstützung des Wachstums in die gewünschte Richtung, kippen Sie die Montage leicht, indem Sie einen Objektträger aus Glas unter der Petrischale auf der Seite des Chips gegenüber der Auslässe. </li><li> Um das Licht / Dunkel-Zyklus zu halten, beleuchten die Sämlinge mit einer Ringleuchte (Lichtintensität: 100 uE m -2 s -1), verbunden mit einer Zeitschaltuhr. </li></ol> 4. Anschließen des RootChip an die LVG <ol><li> Am folgenden Tag, füllen einen verschließbaren, druckbeaufschlagbaren Fläschchen mit flüssigem Nährmedium (Abbildung 1B). </li><li> Kehren Sie die Chip-Träger und legen es auf eine stabile Oberfläche. Entfernen Sie die RootChip aus dem flüssigen Medium und setzen Sie sie PDMS Seite nach unten in die untere Öffnung des Chip-Trägers. Orient den Chip, so dass die Seite mit den Steuerschicht Einlässe zugewandten Seite der Druckleitung Schlauchverbinder in dem Träger Seitenwand. </li><li> Trocknen Sie das Deckglas auf dieBoden des Chips durch leichtes Blotting mit Tissue-Papier. Sichern Sie die RootChip auf dem Träger mit Klebeband und rechts der ganzen Versammlung. </li><li> Schlauchverbinder werden durch Schneiden flexiblem Kunststoff Microbore Schlauch (TYGON, 0,20 &quot;ID x 0.060&quot; OD) in 5 cm lange Stücke und deren Verbindung zu Edelstahl Microbore Röhren (New England Small Tube, 0,025 &quot;AD x 0,013&quot; ID x 0,75 gemacht &quot; lang). Füllen Sie die Schlauchanschlüsse mit Wasser mit einer Spritze und stecken jede Schlauch-Anschluss in das entsprechende Control Layer Einlass auf dem Chip. Das Wasser wird später füllen die Kontrolle Schicht Kanäle und verwendet, um den Druck auf die mikromechanische Ventile übertragen werden. </li><li> Stecken Sie die entgegengesetzten Enden der Linien in den Medien / Lösung Durchstechflasche (n). Üben Sie Druck auf die Lösung Fläschchen mit einer Spritze von Luft. Die erhöhte Luftdruck innerhalb der Lösung Fläschchen wird Flüssigkeit in die Leitungen zu zwingen. </li></ol> 5. Montage des RootChip am Mikroskop <ol><li> Setzen Sie den Träger auf den MikroskopOPE Bühne. Um die Möglichkeit der Anordnung Verschieben innerhalb des Experiments durch Vibrationen in den Raum zu verringern, sollte der Träger exakt in die Kerben der Einsatzplatte. </li><li> Die Chip-Ventile und die Strömung des Mediums durch den Chip werden durch Luftdruck gesteuert. Zwei Linien mit Regulatoren sind aus einer Hauptdruckleitung verzweigte - eine solche verwendet wird, um das Medium durch die Kanäle zu steuern, und der andere mit elektropneumatische Ventile, die die Push-up-Ventile der Steuerungsschicht Betätigung verbunden ist. Die Magnetventile werden vom Computer über den USB-Ventilsteuerung (entwickelt von Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab) betrieben. Schließen Sie beide Druckregler, bevor Sie den Chip. </li><li> Fügen Sie ein paar ml Wasser zu den Stauseen des Trägers zu halten hoher Luftfeuchtigkeit innerhalb der Baugruppe. Dieser Schritt sollte über Verlauf der mehr Experimente, um die Pflanzen vor dem Austrocknen bewahren wiederholt werden. Lassen Sie die Lautstärke zu minimieren ter Menge an Flüssigkeit, die auf das Mikroskop fließen könnte. Für Langzeit-Experimenten, kann der Abfluss aus der Chip-Outlets in den Stauseen des Trägers durch die Verbindung der Chip-Filialen zu den Stauseen mit Microbore Schlauch (siehe Schritt 4.4) geführt werden. Alternativ kann der Ausfluss, der auf der Chip-Oberfläche sammelt durch Pipettieren gesammelt werden. </li><li> Bereiten squared Blatt aus transparentem Kunststoff von Klarsichthüllen (C-Line). Den durchsichtigem Kunststoff des Trägers durch doppelseitiges Klebeband mit hoher Luftfeuchtigkeit in der Anordnung zu halten. </li><li> Positionieren Sie den Ring leicht über den Chip und Pflege der Hell / Dunkel-Zyklus. Das Ringlicht sollte ausgeschaltet werden, bevor dem Beginn jedes Experiment, das fluoreszierende Marker verwendet, da die direkte Beleuchtung mit Bild Kollektion stören wird eingeschaltet. </li></ol> 6. Die Bedienung des RootChip mit dem LabVIEW-Schnittstelle Die RootChip Controller-Schnittstelle für die LabVIEW-Software-Plattform könnenvon unserer Website heruntergeladen werden <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a> . <ol><li> Die Ventile auf dem Chip werden durch Aufbringen von Druck auf die Steuerschicht, in diesem Fall durch Öffnen der elektropneumatische Ventile geschlossen. Der Controller-Schnittstelle ermöglicht die Betätigung der Ventile durch Anklicken des Buttons unter dem Ventil-Nummer. Helles Grün zeigt an, Anwendung von Druck und Schließen eines Ventils Chip (Abbildung 2B). Aktivieren Sie alle drei Einlassventile-Lösung in der Controller-Schnittstelle vor dem Öffnen der Druckregler. Hinweis: Die Controller-Schnittstelle verfügt über eine Feedback-Schleife, die Überwachung der den Zustand des Systems ermöglicht. Diese Funktion kann durch einen Klick auf den &quot;Rücklesen&quot;-Button in der Controller-Schnittstelle aktiviert werden. </li><li> Öffnen Sie den Druckregler für die Steuerung Schicht und zunächst auf 15 psi eingestellt, öffnen Sie dann den Regler für den Fluss-Schicht und zunächst auf 5 psi eingestellt. AbhängigkeitDing von der gewünschten Strömungsrate, können die Drücke später eingestellt werden. </li><li> Öffnen Sie das Einlassventil für das Wachstum Medium der Wahl, um die Kammern mit Medium spülen. </li><li> Überprüfen Sie Fließwege unter dem Mikroskop. Typischerweise wird die Luft in den Strömungskanälen gefangen und muss entfernt werden. Zusätzlich sind die Kanäle des Control-Schicht noch Luft enthalten, die durchgeführt werden müssen und gezwungen durch das Wasser aus dem Schlauch-Anschlüsse (Dead-End-Füllung) ersetzt. Beide Aufgaben werden durch Spülen jedes der acht Kammern mehrfach (5 psi) bis die gesamte Luft aus den Kanälen in der PDMS (&quot;Entgasen&quot;) gezwungen wird, erreicht. Hinweis: Die Controller-Schnittstelle kann so programmiert werden, um Experimente zu automatisieren. Solche Routinen können auch zu entgasen dem Chip verwendet werden. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse Der Hauptzweck des RootChip ist es, eine Imaging-Plattform und einer Durchströmungsauslaßvorrichtung System in einem Gerät mit einem hohen Maß an Integration zu verbinden. Um die Manipulation nachweisender Mikroumgebung von Wurzeln gespült wir die Kammern mit dunklen Lebensmittelfarbe (1:4 Verdünnung in Hydrokultur-Medium) gemessen und den Austausch von Flüssigkeit in den Kammern. Bei der empfohlenen Druck von 5 psi messen wir einen vollständigen Austausch innerhalb von 10 Sekunden bei einem berechneten Flussrate von ca. 1,5 ml / min (Abbildung 3). Wir beobachteten auch Wurzelwachstum von Sämlingen, in diesem Fall im Dunkeln gewachsen und mit 10 mM Glucose als eine externe Energiequelle (4). Abhängig von den Wachstumsbedingungen wie Licht und Zusammensetzung des Mediums, können Pflanzen in der RootChip für bis zu drei Tage lang beobachtet. Die RootChip wurde genutzt, um intrazelluläre Glukose und Galaktose Ebenen in Wurzeln zum Ausdruck genetisch kodierte Nanosensoren, auf Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 7.5 basieren überwachen. Wurzeln in der Chip wurden mit Rechteckimpulsen von Glukose oder Galaktose-Lösung perfundiert ( <strong&gt; Abbildung 5). Die intrazelluläre Niveaus von Zucker wurden überwacht und werden hier ausgedrückt als Verhältnis der Intensität des Akzeptor-Fluorophor Citrin der Intensität des Spenders ECFP gezeigt. Der Anstieg der Kennzahl zeigt Anhäufung von Zucker. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. RootChip Prinzip. <ol class="ualpha"><li> Die Beobachtung RootChip verfügt über acht Kammern für das Wachstum von Wurzeln und Imaging. Die Samen zuerst in Kunststoffkonen keimen - gefertigt aus Kunststoff Pipettenspitzen - welche mit festen Medium gefüllt ist. Die Wurzelspitze wächst durch das Medium und erreicht den Raum, in dem ein kontinuierlicher Strom von flüssigem Medium hält die Bedingungen in der Kammer konstant. Mikromechanischen Ventilen (rot) steuern den Fluss. Der Chip basiert auf einem optischen Deckglas montiert. Zeichnung nicht maßstabsgerecht. (Adaptiert mit Erlaubnis von Grossmann et al., Plant Cell 2011.) </li><li> Scheme eines druckbeaufschlagbaren Lösung Fläschchen mit Membran (rot). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Anschließen und montieren RootChip. <ol class="ualpha"><li> Draufsicht auf die in vollem Umfang angeschlossen RootChip und Träger montiert auf einem inversen Mikroskop. </li><li> Schema, das die Ventilanordnung und die Controller-Schnittstelle. Ein Beispiel für ein Ventil Einstellung, um die Fluidströmung zu einer einzigen Kammer führen gezeigt. Während die Ventile 4 bis 8 wirken als einzelne Armaturen, Ventile 0 bis 3 Akt in Gruppen. Mit diesem System wird eine einzelne Kammer kann durch die Aktivierung einer Kombination von Ventilen gerichtet werden. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Austausch von Lösungen in der Beobachtung, chBernsteinen. Visualisierung der Austausch von Flüssigkeit in einem Beobachtungsraum mit Farbstofflösung. Das Bild ist eine Überlagerung von Hellfeld-und falsch-farbige Intensität des Farbstoffs Signal. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. On-Chip-Wurzelwachstum. Beobachtung eines einzelnen wachsenden Wurzel Expression eines fluoreszierenden FRET Nanosensor für Glucose / Galactose im Laufe der 20h. Zeitformat: hh: mm; Maßstab: 100 um. <img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Messung der intrazellulären Blutzuckerspiegel mittels FRET Nanosensoren. <ol class="ualpha"><li> Die Höhe der Sensor als Citrin Intensität innerhalb der Wurzelspitze (links) dargestellt. Die Reaktion des intrazellulären FRET Nanosensor der Anwendung von Glucose oder Galactose Lösung ratiometrische Bildern gezeigt. (Mit freundlicher Genehmigung von Grossmann et al Angepasst., 2011 PlaNT-Cell) Balkenlänge. 100 um. </li><li> Tracing FRET-Verhältnis ändert sich als Reaktion auf drei wiederholten Rechteckimpulse von Glucose (grün) und Galactose (rot). </li></ol>

<ol>
	<li>Grossmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science.">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography.">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li><li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Imaging+with+Fluorescent+Biosensors:+Advanced+Tools+for+Spatiotemporal+Analysis+of+Biodynamics+in+Cells.">Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors: Advanced Tools for Spatiotemporal Analysis of Biodynamics in Cells.</a> Annu. Rev. Plant Biol. , (2012).</li><li>Loqu&#233;, D., Lalonde, S., Looger, L. L., von Wir&#233;n, N., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytosolic+trans-activation+domain+essential+for+ammonium+uptake.">A cytosolic trans-activation domain essential for ammonium uptake.</a> Nature. 446, 195-198 (2007).</li><li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors.">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21, 45-54 (2010).</li><li>Fehr, M., Frommer, W. B., Lalonde, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+maltose+uptake+in+living+yeast+cells+by+fluorescent+nanosensors.">Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 9846-9851 (2002).</li><li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor.">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1091-1099 (2008).</li><li>Chaudhuri, B., Hörmann, F., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+glucose+flux+impedance+using+FRET+sensors+in+wild-type+Arabidopsis+plants.">Dynamic imaging of glucose flux impedance using FRET sensors in wild-type Arabidopsis plants.</a> J. Exp. Bot. 62, 2411-2417 (2011).</li><li>Meier, M., Lucchetta, E. M., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+stimulation+of+the+Arabidopsis+thaliana+root+using+multi-laminar+flow+on+a+microfluidic+chip.">Chemical stimulation of the Arabidopsis thaliana root using multi-laminar flow on a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 10, 2147-2153 (2010).</li><li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-in-chip:+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis.">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703-26 (2011).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li><li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+Compatibility+of+Poly(dimethylsiloxane)-Based+Microfluidic+Devices.">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Anal. Chem. 75, 6544-6554 (2003).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Hauptvorteile des RootChip gegenüber herkömmlichen Methoden sind das Wachstum minimal-invasive Präparation für die Mikroskopie, die Fähigkeit, reversibel und wiederholt verändern die Root-Umgebung, und die Fähigkeit zur kontinuierlichen Beobachtung von entwicklungspolitisch kompetente und physiologisch gesundes Gewebe über einen Zeitraum von mehreren Tagen. Zuvor wurden die Keimlinge senkrecht auf gelierten Medium gezüchtet und auf eine Perfusionssystem unmittelbar vor dem Experiment, das nur die Messung eine einzige Ursache zu einer Zeit 8 erlaubt. Mikrofluidik-Tools wurden für Arabidopsis, aber auf einem niedrigen Integrationsgrad 9 oder ohne Perfusion Steuerung 10 verwendet worden. Die RootChip verbindet ein hohes Maß an Integration mit der Fähigkeit, durch genaue Experimente Strömungsführung zu automatisieren. Ein weiterer Vorteil dieser Plattform Merkmal aller mikrofluidischen Vorrichtungen 11, ist, dass nur minimale Mengen an Flüssigkeit benötigt, um die Wurzel mit der erforderlichen Mutter zuzuführenkontrollierten Nährstoffeintrag, auch für Experimente über mehrere Tage. Die RootChip wird derzeit als Einweg-Gerät konzipiert, aber da die Produktionskosten von Chips niedrig sind, macht die kleine Mengen an Reagenzien verbraucht der Chip immer noch sehr kostengünstig. Es gibt ein paar kritische Schritte, die ergriffen werden, um die Gesundheit der Setzlinge garantiert werden muss: Das Volumen in der Kunststoff-Kegel ist nur 3-4 ul, die beginnen, um zu trocknen, wenn sie der Luft ausgesetzt wird. Daher ist es wichtig, dass die Zapfen auf den Chip übertragen werden schnell und Feuchtigkeit hoch gehalten wird, bis die Wurzeln der Beobachtungskammern, die sie mit ausreichend Wasser liefert erreicht haben. Schritte von 4,2 bis 4,5 sollte schnell und ohne Unterbrechung der Trocknung der Sämlinge zu verhindern durchgeführt werden. Schritte von 3,5 bis 3,8 beschreiben die Inkubation des Chips in flüssigen Medien, in denen die Wurzeln wachsen in die Beobachtungskammern. Dieser Schritt kann durch Montage des Chips in die c übersprungenarrier sofort ab und konstante Perfusion mit Wachstumsmedium. Wir empfehlen jedoch, Einweichen in Wachstumsmedium über Nacht, da sie einige Vorteile hat: 1) es schafft eine feuchte Umgebung, damit die Keimlinge weniger wahrscheinlich geworden ausgetrocknet, als sie in der Beobachtung Kammer wachsen sind; 2) wird der Chip in Flüssigkeit getränkt, so Entgasung (Schritt 6.4) wird schneller sein. Es ist wichtig, um Medien mit niedrigen Konzentrationen der gelösten Stoffe zu verwenden. Mehr konzentrierten Lösungen können ausfallen und verstopfen die Kanäle, insbesondere, wenn der Chip über mehrere Tage verwendet wird. Sobald das Gerät in der Druckluftleitung verbunden ist, wird die Strömung des Mediums, indem hydraulische Druck in den Ventile gesteuert. Um eine ordnungsgemäße Schließung der mikromechanische Ventile gewährleisten, ist es wichtig, einen Steuerdruck, die etwa dreimal höher als der Fließdruck zu wählen. Der Fließdruck sollte nicht mehr als 15 psi als die Flüssigkeit wird aus der Wurzel Buchten geschoben werden. Höhere Drücke may auch dazu führen, Delamination der Chip, der den Chip unbrauchbar macht. Eine Begrenzung der RootChip ist, dass PDMS porösen auch hydrophob ist. Während das Material praktisch inert ist gegenüber wässrigen Lösungen, kann es zu absorbieren organischen Verbindungen 12. Dies kann mit einem raschen Austausch von Lösungen als organische Verbindungen aus dem Material selbst wenn die Zufuhr dieser Verbindung an dem Einlass wurde gestoppt entweichen kann, beeinträchtigen. Aufgrund der Porosität kann die Verwendung von organischen Lösungsmitteln Aufquellen des PDMS 12. Wir unterstützen weiterhin die RootChip optimieren und erweitern ihren Nutzen, zum Beispiel mit Wurzeln von Nutzpflanzen. Wir glauben, dass durch die Verbesserung der Zugriff auf das Root für Behandlungen und Beobachtung, Mikrofluidik-Tools wie der RootChip eröffnen sich neue Dimensionen der Wurzel Forschung.

<table border="1"><tbody><tr><td> Artikel </td><td> Quelle </td><td> Information </td></tr><tr><td> Chip-Träger, Software und andere Informationen. </td><td> Carnegie Institution - DPB </td><td> CAD-und CNC-Dateien für Träger Fertigung, Controller-Software und weitere Informationen stehen zum Download auf der Website <a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a> Träger können auch von dieser Website bestellt werden. </td></tr><tr><td> RootChip </td><td> Stanford Foundry </td><td> Mask Design und Fertigung Protokolle sind auf Anfrage erhältlich. Ready-to-use RootChips kann bestellt werden bei <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry/" target="_blank">http://www.stanford.edu/group/foundry/</a> </td></tr><tr><td> Chip-Controller </td><td> -Home-gebaut</td><td> Die automatisierte Ventilsteuerung System wurde ursprünglich von Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab entwickelt. Eine detaillierte Anleitung, wie Sie Ihre eigenen Controller bauen Ventil sind zu finden unter <a href="https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers" target="_blank">https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers</a> </td></tr></tbody></table>

time-lapse fluorescence imaging of arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the rootchip

Die Root-Funktionen wie die physische Verankerung der Pflanze und ist das Organ für die Aufnahme von Wasser und mineralischen Nährstoffen wie Stickstoff, Phosphor-, Sulfat-und Spurenelementen, die Pflanzen aus dem Boden zu erwerben. Wenn wir nachhaltige Konzepte für die Herstellung qualitativ Ernteertrag entwickeln wollen, müssen wir besser verstehen, wie die Wurzel, entwickelt greift ein breites Spektrum an Nährstoffen, und interagiert mit symbiotischen und pathogenen Organismen. Um diese Ziele zu erreichen, müssen wir in der Lage sein Wurzeln im mikroskopischen Detail über Zeiträume von Minuten bis Tagen zu erkunden. Wir entwickelten die RootChip, ein Polydimethylsiloxan (PDMS) - basierte Mikrofluidik-Vorrichtung, die uns zu wachsen und Wurzeln Bild von Arabidopsis-Keimlinge können unter Vermeidung jeglicher körperlicher Belastung zu Wurzeln während der Vorbereitung für die Abbildung 1 (Abb. 1). Das Gerät enthält einen gegabelten Kanalstruktur mit mikromechanischen, um die Fluidströmung leitenaus der Lösung Einlässen zu jedem der acht Beobachtung Kammern 2. Diese Perfusion System ermöglicht die Wurzel Mikroumgebung gesteuert und modifiziert werden mit Präzision und Geschwindigkeit. Das Volumen der Kammern beträgt etwa 400 nl und erfordern somit nur minimale Mengen an Testlösung. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für das Studium der Biologie an der Wurzel RootChip mit bildgebenden Ansätze mit Echtzeit-Auflösung. Roots kann über mehrere Tage mit Zeitraffer-Mikroskopie analysiert werden. Roots mit Nährlösungen oder Inhibitoren durchströmt werden, und bis zu acht Sämlinge können parallel analysiert werden. Dieses System hat das Potenzial für eine breite Palette von Anwendungen, einschließlich der Analyse des Wurzelwachstums in Gegenwart oder Abwesenheit von Chemikalien, Fluoreszenz-basierte Analyse von Genexpression, und Analyse von Biosensoren, zB FRET Nanosensoren 3.

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Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die Kultivierung von Arabidopsis-Keimlinge in der RootChip, ein Mikrofluidik-Imaging-Plattform, die eine automatisierte Kontrolle der Wachstumsbedingungen kombiniert mit mikroskopischen Wurzel Überwachungs-und FRET-basierten Messung der intrazellulären Metaboliten.

Zeitraffer-Fluoreszenz-Imaging von Arabidopsis Wurzelwachstum mit Rapid Manipulation der Root-Umgebung mit dem RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

time-lapse-fluorescence-imaging-arabidopsis-root-growth-with-rapid

Research

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Bioengineering

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Serie: Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but important bioinstruments capable of testing the force dependence of structural features in proteins. Scale has been a limiting parameter on how accurately researchers can peer into the nanomechanical world of molecules, such as nucleic acids, enzymes, and motor proteins that perform life-sustaining work. Atomic force microscopy (AFM) is well tuned to determine native structures of fibrous proteins with a distance resolution on par with electron microscopy. However, in AFM force studies, the forces are typically much higher than a single molecule might experience 1, 2. Optical traps (OT) are very good at determining the relative distance between the trapped beads and they can impart very small forces 3. However, they do not yield accurate absolute lengths of the molecules under study. Molecular simulations provide supportive information to such experiments, but are limited in the ability to handle the same large molecular sizes, long time frames, and convince some researchers in the absence of other supporting evidence2, 4.
The gravitational force spectrometer (GFS) fills a critical niche in the arsenal of an investigator by providing a unique combination of abilities. This instrument is capable of generating forces typically with 98% or better accuracy from the femtonewton range to the nanonewton range. The distance measurements currently are capable of resolving the absolute molecular length down to five nanometers, and relative bead pair separation distances with a precision similar to an optical trap. Also, the GFS can determine stretching or uncoiling where the force is near equilibrium, or provide a graded force to juxtapose against any measured structural changes. It is even possible to determine how many amino acid residues are involved in uncoiling events under physiological force loads 2. Unlike in other methods where there is extensive force calibration that must precede any assay, the GFS requires no such force calibration 5. By complementing the strengths of other methods, the GFS will bridge gaps in understanding the nanomechanics of vital proteins and other macromolecules.

This is a step-by step guide showing the purpose, operation, and representative results from the novel gravitational force spectrometer.

Demonstration der Verwendung des neuartigen Gravitationskraft Spectrometer auf Stretch and Measure Faserproteinen

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

Forschung

Biotechnik

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Gold Nanostar Synthesis mit einem Silver Seed vermitteltes Wachstum Methode

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Sample Drift Correction Following 4D Confocal Time-lapse Imaging

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture cellular behaviors involved in developmental processes.&#160; The ability to track and follow cell movements is limited by sample movements that occur due to drift of the sample or, in some cases, growth during image acquisition. Tracking cells in datasets affected by drift and/or growth will incorporate these movements into any analysis of cell position. This may result in the apparent movement of static structures within the sample. Therefore prior to cell tracking, any sample drift should be corrected. Using the open source Fiji distribution 1 &#160;of ImageJ 2,3 and the incorporated LOCI tools 4, we developed the Correct 3D drift plug-in to remove erroneous sample movement in confocal datasets. This protocol effectively compensates for sample translation or alterations in focal position by utilizing phase correlation to register each time-point of a four-dimensional confocal datasets while maintaining the ability to visualize and measure cell movements over extended time-lapse experiments.

Time-lapse microscopy allows the visualization of developmental processes. Growth or drift of samples during image acquisition reduces the ability to accurately follow and measure cell movements during development. We describe the use of open source image processing software to correct for three dimensional sample drift over time.

Beispiel Drift Korrektur Nach 4D Konfokale Zeitraffer-Imaging

The generation of four-dimensional (4D) confocal datasets; consisting of 3D image sequences over time; provides an excellent methodology to capture ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

Bildgebung der Wurzelhaare Morphologie der Arabidopsis Sämlinge in einer zweischichtigen mikrofluidischen Plattform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Durchführung von mehreren Imaging-Modi mit einem Fluoreszenzmikroskop

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Kontinuierliche Messung des biologischen Rauschens in Escherichia Coli mittels Zeitraffermikroskopie

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, biomimetic surfaces mimicking the microstructure of leaf surface, were used to study the effects of leaf microstructure on leaf-environment interactions. However, no such tool exists for roots. We developed a tool allowing the synthetic mimicry of the root surface microstructure into an artificial surface. We relied on the soft lithography method, known for leaf surface microstructure replication, using a two-step process. The first step is the more challenging one as it involves the biological tissue. Here, we used a different polymer and curing strategy, relying on the strong, rigid, polyurethane, cured by UV for the root molding. This allowed us to achieve a reliable negative image of the root surface microstructure including the delicate, challenging features such as root hairs. We then used this negative image as a template to achieve the root surface microstructure replication using both the well-established polydimethyl siloxane (PDMS) as well as a cellulose derivative, ethyl cellulose, which represents a closer mimic of the root and which can also be degraded by cellulase enzymes secreted by microorganisms. This newly formed platform can be used to study the microstructural effects of the surface in root-microorganism interactions in a similar manner to what has previously been shown in leaves. Additionally, the system enables us to track the microorganism&#8217;s locations, relative to surface features, and in the future its activity, in the form of cellulase secretion.

Biomimetics has been previously used as a tool to study leaf-microorganism interactions. However, no such tool exists for roots. Here, we develop a protocol to form synthetic surfaces mimicking root surface microstructure for the study of root-environment interactions.

Biomimetische Replikation der Wurzeloberflächen-Mikrostruktur mit Änderung der weichen Lithographie

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

Blutfluss-Bildgebung mit ultraschnellem Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Ein einfacher mikrofluidischer Chip für Langzeitwachstum und Bildgebung von Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...