Dieses Protokoll ermöglicht eine pflanzenweite Echtzeit-Bildgebung der Aktivität des systemischen Signalsystems der Pflanze durch Überwachung der Dynamik des Kalziums und des apoplastischen Glutamats als Reaktion auf Wunden. Diese anlagenweite Echtzeit-Bildgebungsmethode bietet ein robustes Werkzeug, um die Dynamik der schnellen und fernen Signale in Pflanzen zu verstehen, und kombiniert eine hohe räumliche zeitliche Auflösung und Benutzerfreundlichkeit. Dieses Protokoll bietet das Potenzial, einen neuen Einblick in die räumlichen und zeitlichen Eigenschaften des Systems Calciumsignalisierung sowohl bei biotischen als auch bei abiotischen Stressreaktionen bei anderen Pflanzenarten zu geben.
Takuya Uemura, ein Postdoktorand aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie mit dem Einschalten des motorisierten fluoreszierenden Stereomikroskops, das mit einem 1X-Objektiv und einer sCMOS-Kamera ausgestattet ist. Konfigurieren Sie die Geräteeinstellungen für die Bestrahlung mit Anregungslicht mit einer Zentrierung auf 470 Nanometern, die mit einem Filter ausgewählt wird, der Licht zwischen 450 und 490 Nanometern durchlässt.
Erfassen Sie Emissionslicht mit einem Filter, der zwischen 510 und 560 Nanometer überträgt. Entfernen Sie den Deckel aus der Schüssel, in der sich die Pflanze befindet, und legen Sie ihn unter die Objektivlinse. Überprüfen Sie das fluoreszierende Signal der Pflanze.
Warten Sie dann ca. 30 Minuten im Dunkeln, bis die Pflanzen an die neuen Umweltbedingungen angepasst sind. Stellen Sie den Fokus und die Vergrößerung ein, um die gesamte Pflanze im Sichtfeld zu sehen. Stellen Sie dann die Erfassungsparameter ein, um die fluoreszierenden Signale mit der Bildgebungssoftware des Mikroskops zu erkennen.
Stellen Sie die Aufnahmezeit auf 11 Minuten ein. Bild für fünf Minuten vor Beginn des Experiments, um die Pflanze an die Blaulichtbestrahlung vom Mikroskop zu gewöhnen, und beginnen Sie dann mit der Aufnahme. Um die durchschnittliche Ausgangsfluoreszenz zu bestimmen, zeichnen Sie mindestens 10 Frames vor der Verwundung oder Glutamatanwendung auf.
Für die Echtzeit-Bildgebung von wundinduzierten zytosolischen Kalziumionen und apoplastischen Glutamatkonzentrationsänderungen schneiden Sie den Blattstiel oder den mittleren Bereich des Blattes L1 mit einer Schere. Für die Echtzeit-Bildgebung von Glutamat ausgelösten zytosolischen Kalziumveränderungen schneiden Sie etwa einen Millimeter von der Blattspitze L1 über die Hauptvene mit einer Schere. Nach mindestens 20 Minuten 10 Mikroliter 100 Millimolarglutamat auf die Schnittfläche des Blattes auftragen.
Für die Analyse der Fluoreszenzintensität im Zeitverlauf definieren Sie einen interessierenden Bereich an der Stelle, an der die Fluoreszenzintensität analysiert werden soll. Definieren Sie zwei ROIs für die Geschwindigkeitsberechnung der Kalziumwelle. Klicken Sie in der Bildgebungssoftware auf Zeitmessung, definieren und kreisen.
Messen Sie den Abstand zwischen den beiden Bereichen, indem Sie auf Anmerkungen und Messung, Länge und einfache Linie klicken. Messen Sie die Rohblütenwerte in jedem ROI im Laufe der Zeit, indem Sie auf Messen klicken, und exportieren Sie dann die Rohdaten in eine Tabellenkalkulationssoftware, um das fluoreszierende Signal zu jedem Zeitpunkt in Zahlen umzuwandeln. Bestimmen Sie den Ausgangsfluoreszenzwert, der als F-Null angegeben wird, indem Sie das durchschnittliche F über die ersten 10 Frames in den aufgezeichneten Daten berechnen und dann die F-Daten wie im Textmanuskript beschrieben normalisieren.
Definieren Sie für die Calciumgeschwindigkeitswellenanalyse einen signifikanten Signalanstiegspunkt über den vorstimulierten Werten, der den Nachweis eines Kalziumanstiegs in jedem ROI darstellt. Berechnen Sie die Zeitdifferenz im Kalziumanstieg zwischen den beiden ROIs und den Abstand zwischen ihnen, um die Geschwindigkeiten einer Kalziumwelle zu bestimmen. Die Ausbreitung einer wundauslösenden Veränderung der Konzentrationen des zytosolischen Calciumions und des apoplastischen Glutamats wird hier gezeigt.
Das Schneiden des Blattstiels eines Blattes in Pflanzen, die GCaMP-3 exprimieren, führte zu einem signifikanten Anstieg des Kalziums. Es wurde lokal induziert und verbreitete sich dann im gesamten Gefäß. Das Signal wurde innerhalb weniger Minuten schnell auf benachbarte Blätter übertragen.
Beim Schneiden eines Blattes und von Pflanzen, die einen einfachen Chitinase I-Leimschnüffler exprimieren, wurde ein schneller apoplastischer Glutamatanstieg in der Schnittregion beobachtet. Innerhalb weniger Minuten breitete sich das Signal auch durch das Gefäß aus. Für die Echtzeit-Bildgebung der Kalziumsignalausbreitung, die durch die Anwendung von Glutamat ausgelöst wird, wurde der Rand eines Blattes in Pflanzen, die CCaMP-3 exprimieren, geschnitten.
Dies führte zu einem lokalen Anstieg der zytosolischen Kalziumionenkonzentration, aber das Signal verschwand innerhalb weniger Minuten. Nach etwa 10 Minuten wurde Glutamat auf die Schnittfläche aufgetragen, was zu einem schnellen lokalen Anstieg der Konzentration von zytosolischem Kalzium und dann zur Ausbreitung dieses Signals auf distale Blätter führte. Um die Veränderungen innerhalb einer festen Kalziumkonzentration zu messen, die durch Wunden im systemischen Blatt induziert werden, wurde die zeitliche Verlaufsänderung der GCaMP-3-Signalintensität in zwei interessanten Regionen gemessen.
Änderungen der Apoplastischen Glutamatkonzentration als Reaktion auf mechanische Schäden wurden ebenso gemessen. Die Glutamatsignatur zeigte etwa 100 Sekunden nach der Verwundung einen einzigen Peak. Dieses Experiment sollte unter temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Bedingungen durchgeführt werden, da sie durch Änderungen dieser Umgebungsbedingungen erhöht werden.
Dieses Protokoll bietet das Potenzial, Einblicke in die molekularen Mechanismen zu geben, die der Fernsignalisierung zugrunde liegen, indem Mutanten verwendet werden, die die defekten und mutmaßlichen Elemente des Laborsignalsystems sind.
