Die Autoren bedanken sich bei Bob Freeman für die Ausbildung und die Kirschner-Labor für den Einsatz des Frosches Anlage danken, und die Mitglieder der Van Vactor Labor für die Unterstützung. Wir danken der Nikon Imaging Center an der Harvard Medical School für die Unterstützung bei der Lichtmikroskopie für die Bilder in Abbildung 1. Diese Arbeit wurde durch die folgende finanziert: NRSA NIH Gemeinschaft und NIH K99 Stipendium für LAL, Basic Science Partnership Finanzierung ( <a href="https://bsp.med.harvard.edu/" target="_blank">https://bsp.med.harvard.edu/</a> ) zu AEF und NIH RO1 NS035909 DVV

Hinweis: Wir beschreiben die Schritte in den ersten beiden Abschnitten nur kurz, als hervorragende Protokolle mit detaillierten Informationen wurden an anderer Stelle, die sich speziell auf diesen Schritten (zB 8-12) veröffentlicht. Darüber hinaus hat das allgemeine Protokoll der Arbeit mit Xenopus spinalen Neuronen im Live-Zellkultur zuvor in einem ausführlichen Verfahren Artikel 8 veröffentlicht. Wir empfehlen Überprüfung, dass Artikel als Ergänzung zu diesem Video, obwohl wir hier nicht genügend Informationen, um erfolgreich und Fehlerbehebung des Neuralrohrs Dissektion und plating Protokoll in Schritt 3. 1. In-Vitro-Fertilisation von Xenopus Eier <ol><li> Erhalten Eier von weiblichen Frösche, die mit Choriongonadotropin (400 Einheiten / frog) 12-18 h vor dem Eiersammlung injiziert wurden. Sammle Eier in Geändert Ringer 1X Marc-Lösung (MMR) (0,1 M NaCl, 2,0 mM KCl, 1,0 mM MgSO 4, 2,0 mM CaCl 2, 5,0 mM HEPES, pH 7,4 9). </li><li> Befruchten Eier in vitro mit Hackfleisch Hoden, wie zuvor beschrieben 9. </li><li> Nach mindestens 20 min, zu entfernen Embryo Gelee Mantel durch Inkubieren Embryonen in 2% Cystein in 1X MMR (auf pH 7,8 mit NaOH) für 3-5 min. Waschen mit 0,1 x MMR (oder 0,1 x MBS (Modified Barths Saline, 1X Rezept: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 2,5 mM NaHCO 3, 5 mM HEPES, pH 7,8)) 3 -5 Zeiten, und halten Embryonen bei Raumtemperatur bis Injektionen, oder, falls gewünscht, Ort Embryonen bei 14-18 ° C zu verlangsamen Entwicklung. </li></ol> 2. Mikroinjektion von RNA Anmerkung: Während wir hier RNA-Injektion zu verwenden, sind diese Techniken nicht beschränkt auf RNA und DNA, Proteine ​​oder modifizierte Nukleinsäuren zur Genmanipulation können ebenfalls verwendet werden und sind zuvor 12 beschrieben. <ol><li> Vor Experiment RNAs für die Kennzeichnung des Zytoskeletts oder andere Strukturen are von linearisierten DNA-Templates unter Verwendung der mMessage mMachine Kit (Ambion) transkribiert. mRNAs erfordern eine 5&#39;-Cap und eine 3&#39;-Polyadenylierungs-Schwanzes an Übersetzung und Verhütung Abbau in Embryonen. pCS2 + ist eine häufig verwendete Vektor für diesen Zweck, und die Transkription Kit umfasst eine Kappe analogen während der Synthesereaktion. Wir resuspendieren transkribierten mRNA in Nuklease-freiem ddH 2 0, an einer Börse Konzentration zwischen 500 und 2.000 ng / ul, durch prompte Lagerung bei -80 ° C, gefolgt Vor der Injektion verdünnte RNA in ddH 2 0 auf die geeignete Konzentration für die Injektion. Da nur ein geringes Volumen in Embryonen injiziert werden, Resuspendieren in Puffer ist nicht notwendig. Unsere letzten Injektion Konzentration typischerweise 50-200 pg / nl, je nach Konstruktion, und wir normalerweise wird injizieren bis 4 nl pro Embryo, obwohl viele Laboratorien traditionell injizieren bis zu 10 nl, die etwa 1% des Gesamtvolumens ist ein Embryo. RNA kann in hohen Dosen toxisch, und die Dosis pro Embryo Gattungenlly im Bereich von 10 pg bis 1 ng, obwohl bis zu 5 ng toleriert Abhängigkeit von der speziellen Gens und Reinheit sein. Doch für bildgebende Proteinlokalisierung sollte die niedrigst möglichen Ebene injiziert, um Überexpression Artefakte zu vermeiden. RNA für EB1-GFP in diesem Protokoll wird auf endgültige Höhe von 250 pg pro Embryo verwendet. </li><li> Planen Injektionsnadeln durch Ziehen Kapillare mit einer Nadel Abzieher 9, zu einem Spitzendurchmesser von ~ 0,2 um. Mit einem Sutter P-87 Abzieher, verwenden wir die folgenden Einstellungen: heat 644, Pull 125, Geschwindigkeit 70, Zeit 250, aber diese Parameter unterscheiden sich je nach Maschine und muss nach der Änderung des Filament (verwenden wir derzeit eine 2,5 mm nachjustiert werden quadratisches Feld Filament, das 2,5 mm breit) ist. Unter dem Mikroskop brechen Nadelspitze mit der Pinzette in einem Winkel zu einer Pinole-artige Form zu erzeugen. Es gibt andere Verfahren zum Brechen und Füllen Injektionsnadeln (zB 11,12), aber wir füllen die Nadel mit RNA, indem ein kleiner Tropfen (0,5 - 1 ul) mit dem hinteren Ende desNadel. Für Mikroinjektion in Embryonen, gibt es eine Reihe von kommerziell erhältlichen Einspritzsystemen, zwei der häufigsten ist die Pico-Injektor (Medical Systems) und die Nanoject (Drummond Scientific) (siehe 11 für weitere Informationen). Wir verwenden die Medical Systems PLI-100 Pico-Injector, die komprimiertes Gas verwendet für ein digital festgelegten Zeitraum, um konsistente Nanoliterbereich liefern. Injektionsvolumen muss für jede neue Mikropipette mit einem Objektmikrometers kalibriert werden und Einspritzzeit sollten angepasst werden, um gewünschte Menge des eingespritzten RNA zu erreichen. </li><li> Ort befruchteten Embryonen auf dem 1 - bis 4-Zellen-Stadium in eine Plastikschale mit 5% Ficoll in 0,1 X MMR. Halten des Embryos im Platz mit einer Pinzette oder zum Einsetzen in eine Halteplattform (a Kunststoffnetz mit einer ~ 1 mm-Raster, verklebt auf der Unterseite der Schale mit Plastilin oder Dentalwachs) einzuspritzen gewünschte Volumen in tierische Blastomeren (siehe Schritt 2.1 Für weitere Details bzgl. Injektionsvolumina). Verteilen Sie in mehreren locations gesamten Embryos, um wenigstens eine Injektion in jeden der tierischen Blastomeren erhalten gleichmäßigere Verteilung (z. B. für einen 4-Zellen-Stadium Embryo, wir typischerweise 1-2 mal injizieren in jedem Blastomere, während in einem 2-Zellstadium Embryo, injizieren wir 2-4 mal in jedem Blastomeren). Ein Vorteil des Wartens bis zum 2-4 Zell-Stadium ist, dass Sie sicherstellen, der Embryo zu spalten begonnen normal. Allerdings, wenn die Zeit drängt, können Sie an der 1-Zell-Stadium beginnen, mit geringen Unterschieden im Ergebnis außer mehr Embryonen zu müssen injiziert werden. Ältere Embryonen können ebenso verwendet werden, und dies ist besonders nützlich, wenn bestimmte Zelltypen zur Injektion ausgerichtet sind, aber als wir im Allgemeinen bevorzugen eher breit Ausdruck, wir jüngeren Embryonen injiziert, um die Notwendigkeit zahlreicher Injektionen reduzieren. </li><li> Übertragen injizierten Embryonen zu einer Plastikschale mit 0,1 X MMR und ihnen zu ermöglichen, bis der Bühne 20-23 13 zu entwickeln. Inkubieren Embryonen bei 14 bis 22 ° C je nach gewünschtem speed der Entwicklung. (Für Sezieren neuronalen Rohren am folgenden Tag, verwenden Sie ~ 22 ° C. Für den Tag nach, verwenden Sie ~ 14 ° C) </li></ol> 3. Neuralrohr Dissection und Oberflächen <ol><li> Vor Durchführung der Dissektionen, bereiten die Kulturschalen 14. Zunächst beschichten Deckgläser mit genügend Lösung von 200 ug / ml Poly-Lysin in PBS zu bündeln über die Oberfläche des Deckglases, entweder Mattek-oder Lab-Tek Kulturschalen und inkubieren für eine Stunde (alternativ könnte man Deckgläschen sitzen lose in einer Petrischale für die spätere Platzierung auf Glas-Objektträger für die Bildgebung und Immunzytochemie). Absaugen und waschen mit einem Überschuss an PBS 3 mal, und trocknen lassen. Dann coat Gerichte mit 10 ug / ml Laminin in PBS (wir normalerweise 500 ul pro Deckglas, genug, um Pool über der Oberfläche) für eine Stunde bei 37 Grad. Absaugen Laminin-Lösung und 3 x waschen mit einem Überschuss an PBS, man aufpassen, nicht zu lassen, Laminin-beschichteten Oberflächen freigelegt werden, um die Luftschnittstelle. Replace PBS mit Kulturmedium (50% Ringerlösung, 49% L-15 Medium, 1% fötalem Rinderserum, plus 50 ug / ml Penicillin / Streptomycin und Gentamycin, pH 7,4 und filtersterilisiert). (Ringer-Media, 115 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM Hepes pH 7,4, 0,5 mM EDTA). Während unsere Protokoll verwendet dieses Medium ist anzumerken, dass dies eine gemeinsame angereicherten Medium für ältere Xenopus retinalen Ganglienzellen Kulturen, wo Neuronen reduziert Energie reserviert haben ist. Junge Rückenmarks Kulturen überleben und zu wachsen für mehr als 24 Stunden im reinen Ringers die Medien ohne zusätzliche Wachstumsfaktoren, und dies ist in der Tat einer der Vorteile der Verwendung dieses Systems. Optional: add NT3 und BDNF (bis zu Endkonzentrationen von 25 ng / ul) von Nährmedien in Axon Auswuchs erhöhen. </li><li> Aufgrund der Variabilität in der Expression von mRNA injiziert, kann Embryonen weisen ein Mosaik von Fluoreszenz. Vor dem Durchführen Sezieren, Sieb Embryonen auf das Vorhandensein von Fluoreszenz, um diese Embryonen, EXP identifizierenRESS das fluoreszierende Fusionsprotein im Neuralrohr. Zeigen fluoreszierende Embryonen im Stadium 20-23 in einem Agarose-beschichtete Kunststoff-Schale mit Steinberg Medien (58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca (NO 3) 2, 1,3 mM MgSO 4, 4,6 mM Tris, pH-Wert auf 7,8 dann gefüllt autoklaviert) 5. Um die Agarose-beschichtete Schale, Mantel unten Plastikschale mit geschmolzener 1% Agarose in 0,1 MMR und sei aushärten zu machen. Dies bietet eine weiche Oberfläche, so daß keine Beschädigungen an der feinen Pinzette und Wolfram Nadeln während der nachfolgenden Schritte verwendet Dissektion auftreten. Dissection von Embryonen außerhalb Stufe 23 möglich ist, aber es ist schwieriger als Gewebe stärker aneinander haften und erfordern daher längere Behandlung mit Kollagenase. </li><li> Unter einem Binokular, entfernen Sie die Dotterhaut mit feinen Pinzetten und dann isolieren die gesamte dorsale Teil des Embryos, indem eine Reihe von Einschnitten. Während einer Zange den Embryo in Position zu halten, verwenden Sie die zweite, um einen Einschnitt auf das MakeSeite des Embryos, um den hohlen Innenraum freizulegen. Dann nutzen beide Zangen kneifen zusammen das Gewebe zwischen den dorsalen und ventralen Hälfte des Embryos, wodurch Schneiden der Embryo in die Hälfte auf den dorsalen Abschnitt, der das Neuralrohr zu isolieren. </li><li> Legen Sie die dorsalen Explantat in ein Eppendorf-Röhrchen mit 2 mg / ml Kollagenase in Steinberg Medien für 15-20 min auf einem Rotator, um Gewebe zu lösen, und dann Pipette dorsalen Explantat in eine Kunststoff-Agarose-beschichteten Teller mit frischen Steinberg-Lösung. Alternativ kann das Explantat in einer Petrischale mit der Kollagenase-Lösung für 15 min, wobei das gesamte Dissektion dann durchgeführt werden könnte abgegeben werden. </li><li> Verwendung einer Pinzette vorsichtig sezieren das Neuralrohr von der dorsalen und der ventralen Epidermis Notochord. Schieben Sie die Spitze der Zange zwischen der Epidermis und des darunterliegenden Gewebes und langsam nach hinten ziehen die Epidermis und enthüllt das Neuralrohr unten. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um das Gewebe zu halten und eine weitere, um die Spitze zwischen dem SchieberNeuralrohr und Chorda. Schließlich verwenden, um die Zange Somiten beiderseits der Röhre zu entfernen. </li><li> Übertragen der Neuralrohr an ein Agarose-beschichteten Schale mit Kulturmedien aufgefüllt, wie in Schritt 3.1 beschrieben. </li><li> Nach Sammlung von mehreren neuronalen Rohre, schneiden sie in zahlreiche Stücke (ungefähr 20, wenn das ganze Rohr isoliert ist) mit geschärften Wolframnadeln oder Zangen, und dann die Stücke Platte in Kulturschalen mit Medium (hergestellt in Schritt 3.1) gefüllt, Ausbreiten die Explantate gleichmäßig in Reihen. </li><li> Nach dem Plattieren, nicht bewegen die Gerichte, weil diese die Anheften der Zellen stören würde. Inkubieren plated Neuralrohr Explantate rund 20-22 ° C. Wir in der Regel verlassen die Schale von Zellen auf der Bank über Nacht bei Raumtemperatur. Einer der Vorteile von Xenopus laevis Neuronen ist, dass ein spezieller Inkubator für Zellkulturen, der CO 2-Gehalt oder die Temperatur reguliert nicht benötigt wird. Neuriten und Wachstumskegeln beobachtet und bei Raumtemperatur 12 abzubildenden-24 Stunden nach dem Ausstreichen, obwohl Auswachsen kann mit der Zugabe von Wachstumsfaktoren beschleunigt werden. Im allgemeinen wird die Expression eines RNA oder Plasmid Produkt in Variablenausdruck zwischen Zellen führen und somit kann es eine Reihe von Fluoreszenz Expressionsniveaus zwischen Wachstumskegeln sein. Wir haben RNA-Expression von fluoreszierenden Proteinen, über 48 Stunden nach dem Ausstreichen persistieren beobachtet, obwohl dies abhängig von der speziellen Konstruktion. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Nachdem Sie das Protokoll, das in Abbildung 1A zusammengefasst ist, werden gesunde, korrekt seziert und kultiviert neuronalen Explantaten senden zahlreiche Axone oder Neuriten in jede Richtung auf Laminin / Poly-Lysin Substrat, in 1B gezeigt. Die Wachstumsbedingungen Konen an den Spitzen der Axone kann entweder durch DIC Optik, wie in 1C gesehen, ein Bild insgesamt Motilität Dynamik oder hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie abgebildet werden, um die lo untersuchencalization von fluoreszent-tagged Zytoskelett-Proteine, beispielsweise EB1-GFP in 1D gezeigt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4232/4232fig1.jpg" /> Abbildung 1. Zusammenfassung der experimentellen Protokoll und die erwarteten Ergebnisse. A) Protocol Flow-Chart. Siehe Film für Details bezüglich Dissektion am Tag 3. Die gesamte Neuralrohr sollte in etwa 20 gleich große Stücke geschnitten und verteilt sich gleichmäßig in Reihen auf dem Deckglas. In diesem Cartoon, sind Schere dargestellt zu vertreten Schneiden des Gewebes mit feinen Pinzetten. CG Choriongonadotropin B) DIC Bild Axone oder Neuriten wachsen aus Explantat (Explantat der oberen linken Ecke). C) Höhere Vergrößerung Bild des Wachstums Kegel an der Spitze eines wachsenden Axons. D) Fluoreszenzmikroskopisches Bild EB1-GFP im Wachstum Kegel. Maßstab 10 um. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4232/4232fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

<ol>
	<li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trip+of+the+tip:+understanding+the+growth+cone+machinery.">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).</li><li>Buck, K. B., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone+turning+induced+by+direct+local+modification+of+microtubule+dynamics.">Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics.</a> J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).</li><li>Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. 42, 913-926 (2004).</li><li>Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+adhesion+and+signaling+dynamics+in+Xenopus+laevis+growth+cones.">Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones.</a> Dev. Neurobiol. , (2011).</li><li>Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+behavior+in+the+growth+cones+of+living+neurons+during+axon+elongation.">Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation.</a> J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).</li><li>Tanaka, E., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubules+in+growth+cone+turning+at+substrate+boundaries.">The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries.</a> J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).</li><li>Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubule+dynamics+in+growth+cone+motility+and+axonal+growth.">The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth.</a> J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).</li><li>Gomez, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+Xenopus+spinal+neurons+in+live+cell+culture.">Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture.</a> Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , (2010).</li><li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+Eggs+from+Xenopus+laevis+Females.">Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females.</a> J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).</li><li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis.">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).</li><li>Lavery, D. L., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+and+loss-of-function+strategies+in+Xenopus.">Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus.</a> Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1994).</li><li>Guirland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cAMP+signaling+through+G-protein-coupled+receptors+mediates+growth+cone+attraction+induced+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide.">Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide.</a> J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).</li><li>Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+action+potential+mechanism+of+amphibian+neurons+isolated+in+culture.">The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).</li><li>Turney, S. G., Bridgman, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+stimulates+and+guides+axonal+outgrowth+via+growth+cone+myosin+II+activity.">Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).</li><li>Weinl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+turning+of+Xenopus+retinal+axons+induced+by+ephrin-A5.">On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5.</a> Development. 130, 1635-1643 (2003).</li><li>Knoll, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration.">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).</li><li>Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+expression+in+transgenic+Xenopus+embryos.">Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos.</a> Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Xenopus laevis neuronalen Explantaten aus senden Neuriten in einem sehr robusten Weise durch 24 Stunden nach dem Ausstreichen auf dem Laminin / Poly-Lysin Substrat, wenn die Bedingungen angemessen sind. Mit diesem Substrat sind Wachstumskegeln höchst beweglich und kann Axon Längen von bis zu 1 mm zu erreichen, die sich in allen Richtungen nach außen aus dem Explantat, obwohl typische Längen 100 um oder mehr sind. Wenn Neuriten nicht wachsen, gibt es eine begrenzte Anzahl von Gründen der Fall sein. Eine Mö...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Choriongonadotropin </td><td> Argent Chemical Laboratories </td><td> C-HCG-ON-10 </td></tr><tr><td> Cysteine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 52-90-4 </td></tr><tr><td> mMessage mMachine Kit </td><td> Ambion </td><td> AM1340 </td></tr><tr><td> Kapillar Borosil Nadeln 1,2 mm (OD) x 0,9 mm (ID) </td><td> FHC </td><td> 30-31-0 </td></tr><tr><td> Ficoll </td><td> Sigma </td><td> F2637 </td></tr><tr><td> Dumont Nr. 5 Biologie Inox Forceps </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 9001-12-1 </td></tr><tr><td> Mattek Gerichten </td><td> Mat Tek Corporation </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr><tr><td> L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 21083-027 </td></tr><tr><td> Poly-l-Lysine </td><td> Sigma </td><td> P-1399 </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Sigma </td><td> L2020 </td></tr><tr><td> NT3 </td><td> Sigma </td><td> N1905 </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> Sigma </td><td> B3795 </td></tr></tbody></table>

neural explant cultures from xenopus laevis

Der komplexe Prozess der Axon Führung weitgehend durch das Wachstum Kegel, der die dynamische beweglichen Struktur an der Spitze des wachsenden Axon ist angetrieben. Während Axon Auswuchs, muss der Wachstumskegel integrieren mehrere Stromquellen Signalstoff Informationen zu modulieren ihre Zytoskelett um die Wachstumskegel vorwärts zu treiben und genau zu navigieren, um die spezifischen Ziele 1 finden. Wie diese Integration auf der Zytoskelett-Ebene auftritt, wird noch im Entstehen begriffen, und Prüfung der Zytoskelettprotein und Effektor Dynamik innerhalb der Wachstums Kegel kann die Aufklärung dieser Mechanismen ermöglichen. Xenopus laevis Wachstum Kegel groß genug (10-30 Mikrometer im Durchmesser), um hohe auflösenden Echtzeit-Bildgebung von Zytoskelett Dynamik (z. B. 2-4) und sind einfach zu isolieren und in einer Testumgebung manipulieren Vergleich zu anderen Wirbeltieren. Der Frosch ist ein klassisches Modellsystem für Entwicklungsneurobiologie Studien und wichtige frühe Einblicke in das Wachstum Kegel microtubule Dynamik wurde zunächst festgestellt, mit diesem System 5-7. Bei diesem Verfahren wird 8 sind Eier gesammelt und in vitro befruchtet, injiziert mit RNA kodierenden fluoreszenzmarkiertes Zytoskelett-Fusionsproteine ​​oder andere Konstrukte, die Genexpression zu manipulieren, und konnte sich dann auf dem Neuralrohr Stadium entwickeln. Neural Rohre werden durch Dissektion isoliert und dann kultiviert werden, und das Wachstum Kegel auf entwachsen Neuriten abgebildet werden. In diesem Artikel beschreiben wir, wie Sie diese Methode, deren Ziel die Kultur Xenopus laevis Wachstum Kegel für nachfolgende Bild mit hoher Auflösung Analyse durchzuführen. Während wir das Beispiel + TIP Fusionsprotein EB1-GFP bereitzustellen, kann dieses Verfahren auf eine beliebige Anzahl von Proteinen, um deren Verhalten in der Wachstumskegel aufzuklären aufgebracht werden.

Watch this Scientific Journal Video about Neural Explant Cultures from Xenopus laevis at JoVE.com

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Kultivierung neuronalen Explantaten aus seziert<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonen, die fluoreszierende Fusionsproteine ​​ausdrücken können zur Abbildung von Wachstum Kegel Zytoskelett Dynamik.

Neural Explantatkulturen aus<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

neural-explant-cultures-from-xenopus-laevis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

12.5K Aufrufe.  Harvard Medical School. Kultivierung neuronalen Explantaten aus seziert Xenopus laevis Embryonen, die fluoreszierende Fusionsproteine ​​ausdrücken können zur Abbildung von Wachstum Kegel Zytoskelett Dynamik.

Serie: Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissection, Kultur und Analyse der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonic Netzhautgewebe

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

Gleichzeitige Pre-und Post-synaptischen Elektrophysiologische Aufnahme von<em&gt; Xenopus</em&gt; Nerv-Muskel-Co-Kulturen

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

Eine einfache Verhaltenstest zur Prüfung von Visual Function in<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Aufzeichnung von Temperatur-induzierte neuronale Aktivität durch Calcium Überwachen von Änderungen in der Riechkolben von<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

Ableitung von Leptomeningen Explantation Kulturen von Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Zeitabhängige Erhöhung der Netzwerkreaktion auf die Stimulation von neuronalen Zellkulturen auf Mikroelektroden-Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls body functions and internal organ rhythms when animals are exposed to emotional challenges and changes in their living environments. In general experiments, signals from different organs, such as the brain and the heart, are recorded by independent recording systems that require multiple recording devices and different procedures for processing the data files. This study describes a new method that can simultaneously monitor electrical biosignals, including tens of local field potentials in multiple brain regions, electrocardiograms that represent the cardiac rhythm, electromyograms that represent awake/sleep-related muscle contraction, and breathing signals, in a freely moving rat. The recording configuration of this method is based on a conventional micro-drive array for cortical local field potential recordings in which tens of electrodes are accommodated, and the signals obtained from these electrodes are integrated into a single electrical board mounted on the animal's head. Here, this recording system was improved so that signals from the peripheral organs are also transferred to an electrical interface board. In a single surgery, electrodes are first separately implanted into the appropriate body parts and the target brain areas. The open ends of all of these electrodes are then soldered to individual channels of the electrical board above the animal's head so that all of the signals can be integrated into the single electrical board. Connecting this board to a recording device allows for the collection of all of the signals into a single device, which reduces experimental costs and simplifies data processing, because all data can be handled in the same data file. This technique will aid the understanding of the neurophysiological correlates of the associations between central and peripheral organs.

This study introduces a method for the simultaneous recording of local field potentials in the brain, electrocardiograms, electromyograms, and breathing signals of a freely moving rat. This technique, which reduces experimental costs and simplifies data analysis, will contribute to the understanding of the interactions between the brain and peripheral organs.

Gleichzeitige Aufnahmen der kortikalen lokales Feld Potentiale, Elektrokardiogramm, Elektromyogramm und Atemrhythmus aus einem frei beweglichen Ratte

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...