Unser Protokoll erkennt die Notwendigkeit an, die menschliche Blut-Hirn-Schranke in vitro besser zu rekapitulieren, um komplexe zelluläre Mechanismen zu untersuchen, die die Erholung nach einem Schlaganfall beeinflussen. Unser Triple-Modell weist eine robuste Integrität auf, die teilweise mit einer großen Kompartimentierung von Bohrlocheinsätzen zusammenhängt, wodurch wir die Änderungshäufigkeit verringern und Störungen der Populationen vermeiden können. Unser Modell ist ein großartiges Werkzeug, um die molekularen und zellulären Veränderungen zu untersuchen, die an der Blut-Hirn-Schranke während und nach einem ischämischen Schlaganfall auftreten.
Unser Protokoll ermöglicht die Entdeckung neuartiger Ziele und Therapeutika zur Verbesserung der Genesung nach einem Schlaganfall. Aktuelle Behandlungen für ischämische Schlaganfälle sind zeitkritisch und folglich nicht immer wirksam. Beginnen Sie mit der Kultivierung von HBVP in T75-Kulturkolben mit einer aktivierten Oberfläche für die Zelladhäsion in einem 5%-Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius, bis sie konfluieren.
Sobald der Zusammenfluss erreicht ist, saugen Sie das alte Perizytenmedium ab und waschen Sie die Zellen mit fünf Milliliter warmem PBS von Dulbecco. Saugen Sie das PBS des Dulbecco ab und lösen Sie die Zellen aus dem Kolben mit einer Kombination aus vier Milliliter warmer Trypsin-EDTA-Lösung und einem Milliliter PBS von Dulbecco. Der Kolben wird fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator inkubiert.
Betrachten Sie unter einem Mikroskop, um zu bestätigen, ob die Zellen vom Kolben gelöst sind. Fünf Milliliter warmes Perizytenmedium mit 2% FBS in den Kolben geben und die abgelösten Zellen in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension drei Minuten lang bei 200 g, so dass die Zellen ein Pellet im Boden des Röhrchens bilden können.
Saugen Sie das Medium aus dem Röhrchen ab, um sicherzustellen, dass das Zellpellet intakt bleibt. Suspendieren Sie das Zellpellet erneut im Perizytenmedium. Berechnen Sie die Menge des Mediums in Abhängigkeit vom Zusammenfluss der Zellen und der Anzahl der benötigten Bohrlocheinsätze.
Nehmen Sie 10 Mikroliter der resuspendierten Zellen, legen Sie sie in einen Zellzählobjektträger und zählen Sie die Anzahl der Zellen. Bestimmen Sie die Zelldichte und säen Sie 300.000 Zellen pro Einsatz in einem Milliliter Perizytenmedium auf die abluminale Seite der Vertiefungen. Kultivieren Sie primäre menschliche Astrozyten mit dem Astrozytenmedium, das 2% FBS enthält, wie im Textmanuskript beschrieben.
Bestimmen Sie die Zelldichte und säen Sie 300.000 Zellen pro Vertiefung auf den Boden der Gewebekultur-Sechs-Well-Platten. Decken Sie die Platte ab, um Verdunstung zu verhindern, und inkubieren Sie über Nacht. In ähnlicher Weise kultivieren Sie HBMEC in Gewebekulturschalen unter Verwendung eines vollständigen klassischen Mediums mit 10% FBS, wie im Textmanuskript beschrieben.
Nehmen Sie die Gewebekultur-Sechstopfplatten mit Astrozyten und die Vertiefungen mit Perizyten aus dem Inkubator. Das Astrozytenmedium wird aus den Gewebekultur-Sechs-Well-Platten abgesaugt und zu jeder Vertiefung ein Milliliter Perizytenmedium und ein Milliliter Astrozytenmedium hinzugefügt. Das Perizytenmedium aus den Vertiefungen absaugen und in die Gewebekulturplatten mit sechs Vertiefungen geben, die die ausgesäten Astrozyten enthalten.
Säen Sie HBMEC mit einer Dichte von 300.000 Zellen pro Vertiefung in zwei Milliliter des kompletten klassischen Mediums auf die apikale Seite derselben Bohrlocheinsätze. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS von Dulbecco. Für Dreifachzellkulturen, die Sauerstoff-Glukose-Entzug ausgesetzt sind, fügen Sie sowohl den apikalen als auch den basolateralen Kompartimenten ein glukosefreies Medium hinzu.
Ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches Medium und normoxische Kontrollzellkulturen. Platzieren Sie Kontroll-Dreifachkulturen im 5%-Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie eine Petrischale mit 20 Milliliter sterilem Wasser in die Hypoxie-Inkubatorkammer, um eine ausreichende Befeuchtung der Kulturen zu gewährleisten.
Öffnen Sie die Kammer, indem Sie die Ringklemme lösen, und ordnen Sie die Zellkulturen auf den Regalen an. Versiegeln Sie die Kammer, indem Sie die Ringklemme sichern. Öffnen Sie die Ein- und Auslassöffnungen der Kammer und befestigen Sie den Schlauch oben am Durchflussmesser der Kammer.
Befestigen Sie den Schlauch von der Unterseite des Durchflussmessers über einen Luftfilter am Gastank. Öffnen Sie das Tankdurchflussregelventil, indem Sie es gegen den Uhrzeigersinn drehen, um einen minimalen Gasfluss zu ermöglichen. Öffnen Sie das Druckregelventil langsam durch Drehen im Uhrzeigersinn.
Spülen Sie die Kammer fünf Minuten lang mit dem Gasgemisch bei einer Durchflussrate von 20 Litern pro Minute. Trennen Sie die Kammer von der Gasquelle und schließen Sie beide weißen Kunststoffklemmen fest. Schalten Sie das Tankdurchflussregelventil aus, indem Sie im Uhrzeigersinn drehen.
Schließen Sie das Druckregelventil, indem Sie es gegen den Uhrzeigersinn drehen. Stellen Sie die Hypoxiekammer für vier Stunden in einen herkömmlichen Inkubator, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Setzen Sie das sterilisierte TEER-Instrument in die Biosicherheitswerkbank ein und stecken Sie die Elektroden in das Epithelvolt-Ohm-Meter.
Sterilisieren Sie die Elektroden in 30 Milliliter 70% Isopropylalkohollösung für mindestens 30 Minuten. Schalten Sie das TEER-Gerät ein und stellen Sie die Funktion auf Ohm ein. Entfernen Sie die Elektroden aus der 70%igen Isopropylalkohollösung und legen Sie sie mindestens 30 Minuten lang in 20 Milliliter PBS von Dulbecco, bis die digitale Anzeige auf dem TEER-Gerät null Ohm anzeigt.
Führen Sie den langen Zapfen der Elektrode durch eine der drei Öffnungen im Brunneneinlegehangar des Blank Well Insert Control ein, bis er den Boden des Brunnens berührt. Stellen Sie sicher, dass der kurze Zapfen über der apikalen Kultur auf dem Boden des Brunneneinsatzes ruht. Warten Sie, bis die digitalen Anzeigewerte am TEER-Gerät abgeschaltet sind, bevor Sie den Wert aufzeichnen.
Setzen Sie die Elektroden wieder in das PBS von Dulbecco ein, um sie zwischen den Messungen zu waschen. Sammeln Sie weiterhin alle TEER-Messungen für zwei weitere Blank-Well-Insert-Kontrollen. Sammeln Sie die TEER-Messungen der Probenplatten, wie zuvor gezeigt.
Nach allen Messungen wird die Elektrode für 30 Minuten wieder in die 70%ige Isopropylalkohollösung gegeben. Trennen Sie dann die Elektroden vom TEER-Instrument und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Berechnen Sie die TEER-Werte.
Asspirieren Sie das Medium aus dem basolateralen Kompartiment und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter phenolrotes freies Endothelzellwachstumsmedium im Dreizellkultur-Blut-Hirn-Schrankenmodell. Waschen Sie die Zellen im apikalen Kompartiment zweimal mit HBSS. Fügen Sie einen Milliliter der FITC-Dextranlösung in das apikale Fach hinzu und bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie, dann legen Sie die Platte für eine Stunde in den auf 37 Grad Celsius eingestellten Inkubator mit 5% Kohlendioxid.
Nehmen Sie 100 Mikroliter Medium aus den basolateralen Fächern und geben Sie es in eine schwarze 96-Well-Platte. Messen Sie die Fluoreszenz mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät, wobei die Anregungs- und Emissionswellenlängen auf 480 bzw. 530 Nanometer eingestellt sind. Säen Sie 200 Mikroliter HBMEC, primäre Astrozyten und HBVP in der Mitte von Poly-D-Lysin-beschichteten 35-Millimeter-Glasbodenschalen mit einer Dichte von 150.000 Zellen pro Schale.
Vor der Aussaat von HBMEC den Boden des Geschirrs mit dem Anhaftungsfaktor beschichten. Lassen Sie die Zellen an der Glasoberfläche haften, indem Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator stehen lassen. Sobald der Zusammenfluss erreicht ist, verwerfen Sie das Kulturmedium und fügen Sie zwei Milliliter vorgewärmtes glukosefreies Medium für Sauerstoff-Glukose-Entzug oder normales Medium für Kontrollen hinzu.
Nach der Behandlung des Sauerstoff-Glukose-Entzugs ersetzen Sie das Medium in allen Schalen durch das bildgebende optimierte Medium und führen dann eine Fluoreszenz-Lebendzellbildgebung mit dem GFP-Filter und dem konfokalen Mikroskop-Inkubator der Oberstufe durch, wie im Textmanuskript beschrieben. Die Barriereintegrität der endothelialen Monoschicht in den angegebenen Blut-Hirn-Schranken-Modellkonfigurationen wurde durch Bestimmung des TEER vor und nach Sauerstoff-Glukose-Entzug sowie nach 24 Stunden Reoxygenierung beurteilt. Vier Stunden lang verursachte der Sauerstoff-Glukose-Mangel nur in der HBMEC-Monokultur und im Kokulturmodell mit HBMEC und HBVP eine signifikante Abnahme der TEER-Werte.
Diese verringerten Werte erreichten nach 24 Stunden Reoxygenierung die Ausgangswerte. Die TEER-Werte im Triple-Co-Kultur-Modell waren signifikant höher als die in den Doppel-Kokultur-Kontrollen oder der Monokultur-Kontrolle unmittelbar nach Sauerstoff-Glukose-Entzug. Die parazelluläre Permeabilität von endothelialen Monoschichten auf 20 Kilodalton Molekülmasse, FITC-Dextran, war in der HBMEC-Monokultur und in geringerem Maße im Kokulturmodell mit HBMEC und HBVP im Vergleich zu normoxischen Kontrollen drastisch erhöht.
Darüber hinaus waren 20 Kilodalton FITC-Dextranpermeabilitätswerte die niedrigsten im Triple-Brain-Blood-Schrankenmodell unter allen Modellen unter normoxischen und Sauerstoff-Glukose-Deprivationsbedingungen. In keinem der Modelle wurden Veränderungen im 70-Kilodalton-FITC-Dextranfluss über endotheliale Monoschichten beobachtet. Alle primären menschlichen Typen, die Sauerstoff-Glukose-Entzug ausgesetzt waren, zeigten eine starke grüne Fluoreszenz, was beweist, dass die abgebildeten lebenden Zellen hypoxisch waren.
Nach der Aussaat der vaskulären Perizyten des menschlichen Gehirns auf der abluminalen Seite von Bohrlocheinsätzen ist es sehr wichtig, sie mit der Flip-Platte abzudecken, um eine Verdunstung zu verhindern. In unserem Modell verwenden wir einen relativ kleinen Porendurchmesser von 0,4 Mikrometern aus Polyester-Vertiefungen, wodurch es für das Screening von Arzneimittelkandidaten auf jede Krankheit geeignet ist, die zur Behandlung die Blut-Hirn-Schranke überwinden muss. Diese Technik bietet eine hervorragende Möglichkeit, bei Bedarf die Modifikation von Proteinen und Transportern zu visualisieren.
