1. Benutzerdefinierte ZFN Design Process <ol><li> Um die ZFN Design Prozess zu beschleunigen, sollte ein Ermittler stellen: </li><ul><li> Informationen über das Ziel-Gen wie dem Gen-Namen, Arten und Gene Annotation / Identifikationsnummer. </li><li> Ein klar gesagt über-all Ziel des Experiments (zB Knockout oder Knockin) </li><li> Alle spezifischen Faktoren des Gens Ziel, das atypische Gen Aufbau, spezielle Biologie in der Genort verwickelt, oder keine homologen Regionen anderer Stelle im Genom enthalten. </li><li> Das spezifische DNA-Sequenz für die Zinkfinger-Nucleasen zum Ziel. </li></ul><li> Die Sigma Bioinformatik Team führt in silico Design zum ersten ZFN Zinkfinger Zielorten zu entwickeln. </li><li> Erste ZFN Zielorten an eine ZFN wissenschaftlichen technischer Berater zur Verfügung gestellt. Für weitere technisch komplexen Projekten arbeitet diese Sigma Wissenschaftler mit den Ermittlern, um das Projekt zu entwickeln. </li><li&gt; Das Sigma Bioinformatik Team führt eine Analyse mit ZFN Algorithmen, um in silico ZFN Designs generieren. Dazu gehört auch eine ganze Genom Suche nach Off-Target-Sites, wiederholen Sie die Maskierung und SNP-Analyse für jede potentielle ZFN Zielort. </li><li> Bioinformatik bietet die Top-ZFN Zielorten an die Ermittler für Kritik. Nach der Freigabe der potentielle ZFN Zielstellen, wird diese Information an die ZFN Produktionsteam vorgesehen, um die ZFN Herstellungsverfahren beginnen. </li></ol> 2. Benutzerdefinierte ZFN Produktion <ol><li> Die Sigma-Archiv von Zink-Finger-Module verwendet, die zugelassenen ZFN Designs montieren. </li><li> Jedes Design ZFN montiert und Sequenz auf einem hohen Durchsatz Klonen Plattform verifiziert. </li><li> Sobald die Produktion aller ZFN Designs abgeschlossen ist, wird jede ZFN wird zur Validierung geschickt. </li></ol> 3. Validierung von Custom ZFNs <ol><li> ZFN Projekte invon Mensch, Maus, Ratte oder CHO-Spezies in gut charakterisierten Zelllinien für jede Art validiert werden, wird ein Hefe-basierten Assays für andere Organismen oder Zelltypen verwendet. </li><li> ZFN Konstrukte werden in den entsprechenden Zelllinie durch Nukleofektion geliefert und die ZFNs ausgedrückt werden. </li><li> DNA wird aus dem Pool von ZFN transfizierten Zellen geerntet und die Region von Interesse PCR-amplifiziert. </li><li> Die Cel-1-Assay wird dann auf der PCR-Produkt durchgeführt. Die Gelelektrophorese basiert auf der Cel-1-Assay zu validieren ZFN Aktivität ausgeführt werden. </li><li> Die höchste Aktivität ZFN Design bestätigt durch die Cel-1-Assay wird dann an den Kunden. ZFNs sind in mRNA und Plasmid-DNA mit PCR-Primer für die Cel-1-Assay und genomische DNA als eine positive Kontrolle geliefert. </li></ol> 4. Lieferung von Validated ZFNs durch Nukleofektion <ol><li> Samen der Zellen bei einer Dichte von 2x10 5 Zellen / ml am Tag vor Nukleofektion. </li><li> Am Tag der Nukleofektion,nehmen Cell Line Nucleofector Kit V und lassen auf Raumtemperatur erwärmt. </li><li> Fügen Sie die Ergänzung des Nucleofection Lösung V nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Zählen Sie die Zellen. Die Zelldichte sollte zwischen 2,5-5x10 5 Zellen / ml liegen. </li><li> In eine Platte mit 6 Vertiefungen mit 2 ml des Mediums in jeder Vertiefung und Vorwärmen in einem CO 2-Inkubator bei 37 ° C für mindestens 20 Minuten vor Nukleofektion. </li><li> Zentrifuge 2x10 6 Zellen pro Transfektion (8x10 6 insgesamt) bei 200xg für 5 Minuten. </li><li> Waschen der Zellen zweimal mit 20 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). </li><li> Bereiten experimentellen Röhren: (siehe Tabelle in Custom ZFN Technical Bulletin) </li><li> Entfernen Sie die 6-Well-Platte mit Medien aus Schritt (6,5) aus Inkubator. </li><li> Die Zellen in 400 ul (100 ul / Reaktion) von Nucleofection Lösung V. </li><li> Eine Reaktion zu einer Zeit, werden 100 ul Zellen zu jeder DNA oder mRNA-haltigen Rohr. Transfer das Gemisch auf eine 2 mm Elektroporationsküvette und nucleofect auf einem Nucleofector mit einem geeigneten Programm. </li><li> Unmittelbar nach Nukleofektion jeder Probe, Hilfe einer Pipette auf ~ 500 pl vorgewärmtem Medium aus der 6-Well-Platte in Schritt (6.9) hinzufügen, um die Küvette. Dann transferieren Sie Zellen aus der Küvette mit dem übrigen vorgewärmtem Medium in der 6-Well-Platte. </li><li> Beende alle Reaktionen und senden Sie das 6-Well-Platte auf die CO 2-Inkubator bei 37 ° C </li></ol> 5. Ernte genomische DNA nach Lieferung der ZFNs <ol><li> 6-Well-Platte - nicht ernten all der gepoolten Zellen. Es ist wichtig, um die Kultur zu erhalten, um Zellen zu einzelnen Zelle Verdünnung Klon haben, nachdem Sie, dass Sie Cel-1 Verdauung Produkte zu bestätigen. Ein bis drei Tage nach Nukleofektion Sammeln der Zellen chromosomale DNA herzustellen mit der GenElute Säuger genomische DNA-Miniprep-Kit. </li></ol> 6. Cel-1-Test </p&gt; <ol><li> PCR-Amplifikation der genomischen DNA aus den Proben ZFN transfizierten und der positiven Kontrolle genomischer DNA mit dem Kit mitgeliefert, mit den mitgelieferten Primer. (Siehe Tabelle in Custom ZFN Technical Bulletin): Die PCR-Reaktion wird mit den folgenden Bedingungen eingestellt. </li><li> Um Heteroduplexe aus den PCR-Homoduplexe generieren nehmen 10 ul PCR-Reaktion aus jeder ZFN behandelten Probe zuzüglich der Kontrolle und verwenden Sie das folgende Programm auf einem Thermocycler: 95 ° C, 10 Minuten 95 ° C bis 85 ° C, 2 ° C / Sekunde 85 ° C bis 25 ° C, -0,1 ° C / Sekunde 4 ° C, auf unbestimmte Zeit </li><li> Fügen Sie 1 ul-Enhancer und 1 ul Nuclease S (ab Transgenomic Katalognummer 706025) zu jeder Reaktion und inkubieren bei 42 ° C für 20-40 Minuten. </li><li> Führen Sie die Aufschlüsse auf einem 10% PAGE-TBE-Gel mit der richtigen Marker wie DirectLoad WideRange DNA-Leiter (Katalognummer D7058) (siehe Ergebnisse in Custom ZFN Technical Bulletin). </li><li> Aufce positives Signal in ZFN-behandelten Population wurde durch Cel-I-Test nachgewiesen, um klonale Isolierung und Charakterisierung fort. </li></ol> 7. Klonale Isolierung und Charakterisierung <ol><li> Einzel-Zell-Klon die ZFN-behandelten Proben mittels Standardverfahren einschließlich FACS und Verdünnungsklonierung. </li><li> Lassen Sie die Klone, um ausreichend zu erweitern, dann spalten gewissen Anteil an Zellen für genomische DNA Ernte, Einfrieren wieder den Rest als überhöhte Material. </li><li> Verstärken genomische DNA aus den Klonen unter Verwendung der Primer Cel-I und Analyse der Fragments durch Cel-I-Assay (mit und ohne WT DNA versetzt in), oder alternativ diese Amplikon, direkt zum Genotypisierung. </li><li> Genotyp Kandidaten-Klone als mit bearbeitet Allele durch das bevorzugte Verfahren identifiziert. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel des gesamten CompoZr ZFN Workflow ist in 2 dargestellt. ZFNs geliefertdie Zellen, wo sie binden und zu spalten die entsprechende DNA-Sequenz, die eine Doppel-(DSB) erstellt. Die natürliche Reparatur-Prozess, nicht-homologe Endverbindung (NHEJ), repariert die DSB. In einigen Fällen aberrante NHEJ kommt es zur Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden. PCR-Amplifikation von genomischer DNA geerntet Ergebnisse in Heteroduplex-Bildung zwischen Wildtyp und modifiziert Amplikons nach der Denaturierung / Annealing-Schritts der PCR-Reaktion. Die Zugabe der Cel-1-Enzym zur Spaltung keine Heteroduplexmoleküle. Cel-1 Ergebnisse werden durch PAGE-Analyse gelöst zu ZFN Spaltung zu bestätigen. Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung des Cel-1-Test und der erwarteten Ergebnisse. Repräsentative Cel-1 Ergebnisse sind in den 4 und 5 enthalten Abbildung 4 enthält aus einer sehr aktiven Paar ZFNs (21%) in K562-Zellen;. Abbildung 5 enthält die Ergebnisse von einer weniger aktiven Paar (2,4%) der ZFNs inK562-Zellen. ZFN-Aktivität ist in beiden Figuren durch die Anwesenheit von zwei PCR-Fragmente unter der elterlichen PCR-Fragment bestätigt. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. Darstellung der gebundenen Zink-Finger-Nukleasen. ZFNs sind Proteine ​​einer Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne, fusioniert an die Spaltdomäne des FokI-Restriktionsendonuklease umfasst entwickelt. Wenn als ein Heterodimer gebunden ist, zu schaffen ZFNs eine doppelsträngige Pause zu einer vom Benutzer angegebenen DNA-Sequenz. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung des benutzerdefinierten ZFN Service-Workflow. Grafische Darstellung der Workflow um einen gentechnisch veränderten Zelllinie unter Verwendung CompoZr ZFNs generieren. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Schematische Darstellung des Cel-1-Test und die Ergebnisse. A) ZFN Plasmid-o<html> r mRNA an Zellen geliefert. B) ausgedrückt ZFNs binden und schneiden sich Zielsequenz, eine doppelte (DSB) in einem Teil der Zellen. C) aberrante Reparatur von einigen DSBs durch nicht-homologe Endverknüpfung Ergebnisse in der Nucleotid-Insertion oder Deletion. D) Genomische DNA wird aus dem Pool von transfizierten Zellen geerntet und verstärkt an der Stelle von Interesse. EF) PCR-Produkt wird denaturiert und erneut geglüht schaffen Heteroduplexbildung zwischen Wildtyp und modifiziert Amplikons. G) Die Cel-1 Fehlpaarungsendonuclease Assay zur Spaltung von Heteroduplex-Moleküle. H) Cel-1-Enzym verdaut werden durch PAGE aufgelöst. Das beobachtete Verhältnis von Spaltprodukt auf eine parenterale Band, das von ImageJ Software bestimmt, zeigt die Fraktion Schnitt und die Effizienz der ZFNs. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Cel-1 ergibt sich aus 21% aktiven ZFNs ImageJ Software finden Sie unter.:_blank &quot;&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/. <img src="/files/ftp_upload/3304/3304fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Cel-1 ergibt sich aus 2,4% aktive ZFNs ImageJ Software ist verfügbar unter:. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> .

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Forscher können ZFN veränderten Zellen oder Tiere zu Kollaborateuren unter dem Standard-Forschung Lizenzvertrag zu versehen. Unter diesen Umständen fragt, Sigma, dass ein Material Transfer Agreement an Ort und Stelle befindet sich zwischen Sigma, das ZFN Kunden und ihre Mitarbeiter setzen. : Die Forschungs-Lizenz kann eingesehen werden unter <a href="http://www.sigma.com/zfn" target="_blank">http://www.sigma.com/zfn</a> . Wenn es ein Potenzial für eine kommerzielle Anwendung mit ZFN modifizierten Zellen Sigma fragt dann, dass eine kommerzielle Lizenz an Ort und Stelle gelegt wird. Produktion und freien Zugang zu diesem Beitrag wird von Sigma, Inc. gesponsert

Sobald ZFN-modifizierten Zellen werden isoliert haben sie dauerhafte und vererbbare Änderungen der DNA. Daraus ergibt sich die Möglichkeit, stabil veränderte Zelllinien oder Zuchttiere mit gewünschten genetischen Veränderungen zu erzeugen, um Forschung zu betreiben. CompoZr Benutzerdefinierte ZFNs bieten eine robuste Methode zur Genom-Bearbeitung in einer Vielzahl von Zelltypen. Veröffentlichung der erfolgreichen Bearbeitung mit ZFNs Genom beinhaltet, ist aber nicht zu humanen Zelllinien, Maus, Ratte, Zebrafisch, Frosch-, Schweine-und CHO-Forschung Modelle beschränkt. 3,4,5,6,7,8,9 die Möglichkeit, eine zu erstellen doppelsträngigen Bruch an der gewünschten Zielstelle in der angegebenen Zelltyp ist gewährleistet, wenn die ZFNs ordnungsgemäß in eine Zelle abgegeben werden. Es ist auch möglich, sequentielle Zink-Finger-Modifikationen zu einer Zelle durchzuführen, um mehr als eine genetische Veränderung innerhalb einer Zelle zu haben. 10. Die Fähigkeit, eine spezifische Ziel-Sequenz wählen und nur zu modifizieren, dass bestimmten Locus ist eine der Hauptursachen für die Fähigkeit, mehrere erstellen ModifikationenKationen. Die CompoZr Benutzerdefinierte ZFN Zertifikat von Analyse wird mit den sehr Reagenzien im Kit wodurch sichergestellt, dass alle Komponenten des Kits sind sorgfältig den Erfolg unserer Kunden bestätigt vorausgesetzt generiert. Kritische Schritte des Workflows von Anfang bis Ende sind nachfolgend dargestellt: Zellklonierung Die Fähigkeit zu isolieren und zu erweitern eine bestimmte Zelllinie sollten vor Beginn jeder ZFN getestet werden. Einzelne Zellen zu isolieren und erweitert werden, um sicherzustellen, dass ein klonal abgeleitete Bevölkerung möglich ist. Manche Zelllinien sind in dieser Angelegenheit widerspenstigen und Tricks wie Bereicherung für Klone bearbeitet oder Kultur mit konditionierten Medien können helfen, diese Herausforderungen zu meistern. Liefer-Effizienz Optimierung der Lieferzeiten Effizienz ist ein Muss vor der Lieferung der ZFNs. Es können viele Verfahren, einschließlich Lipid-basierte Transfektion, Elektroporation und nucleofecti verwendet werdenauf. Die ideale Lieferung Methode besteht darin, eine, die die optimale Mischung aus Effizienz und Lieferung das Überleben der Zelle liefert. Quantifizieren diese Effizienz kann durch die Bereitstellung einer GFP-Kontroll-Plasmid und zur quantitativen Bestimmung durch visuelle Inspektion oder FACS 24 48 Stunden nach der Lieferung geschätzt werden. Cel-I-Test Es ist zwingend notwendig, dass Cel-I-Test parallel mit den entsprechenden Kontrollen durchgeführt, um sicherzustellen, dass PCR, Verdauung und Elektrophorese-Parameter werden nicht mit der Interpretation von ZFN Experiment stören. Jedes Kit beinhaltet Kontrolle genomischer DNA, mit der die Cel-I-Bild in der Bescheinigung über die Analyse zu erstellen. Verstärkung aus der Kontroll-DNA mit den mitgelieferten Primer durch Cel-I-Test gefolgt wird dem Benutzer erlauben, die Ergebnisse mit, dass in dem Certificate of Analysis (CofA) Bild zu vergleichen, und zu isolieren, mögliche Ineffizienzen in diesem Aspekt eines Experiments. Eine entsprechende negative Kontrolle z. B. irreführende oder GFP behandelten ZelleProbe sollte ebenfalls enthalten, um Aufklärung über alle nicht-spezifische Spaltung Erzeugnisse zu ermöglichen. Qualitative / Quantitative Analyse von Einzel-Zell-Klone Nach ZFN Behandlung und Einzelzell-Klonierung, können die Populationen von Zellen für die Bearbeitung an dem Ort von Interesse durch eine Anzahl von Verfahren gescreent werden. Cel-I-Assay kann mit genomischer DNA von Klonen werden zum Zwecke der Identifizierung von Kandidaten-Klone für weitere Genotypisierung durchgeführt. Es ist wichtig, Spike WT PCR-Fragments in die Probe Amplikons im Verhältnis 1:1 vor der Durchführung der Cel-I verdauen als homozygot mutierten Klone homogene Moleküle enthalten wird, zu vermitteln und damit einen negativen Cel-I-Test Ergebnis. Ein alternatives Verfahren zum Screening von Kandidaten-Klone diese ist, um einen PCR-Primer Landung direkt auf der ZFN Zielstelle zu entwerfen. In Verbindung mit einem der Kontroll-Primer, zeigt ein negatives Ergebnis Ergebnis Verlust des WT-Sequenz. Eine heterozygote Klon, enthaltend mindestens eine WT-Allel yield PCR-Signal, sondern kann aus vollständig WT Klone durch die Durchführung der PCR im Zusammenhang mit SYBR qPCR getrennt werden. Sobald Kandidaten-Klone durch die obigen Verfahren identifiziert wurden, können sie durch Standard-Pyrosequenzierung, tief-Sequenzierung oder anderen Sequenzierverfahren genotypisiert werden. Für alle Sequenzierungsmethoden, sollte ein Fragment aus der genomischen DNA klonale erstellt generiert werden. Für traditionelle Pyrosequenzierung Allele können durch TA-Klonierung der PCR-Produkt getrennt werden, und Sequenzierung der einzelnen Kolonien. Für Methoden, wie tief die Sequenzierung dieser Schritt ist nicht erforderlich. Homologie Regie Repair (HDR) Dieses Protokoll bietet die Methode für die ZFN vermittelte Gen-Knockout über NHEJ. Integration von Transgenen kann auch durch Einführung eines Donor-Plasmids mit Homologiearme durchgeführt werden, die Flanke eine ZFN Schnitt Seite. 11. In diesem Szenario wird das ZFN erstellt doppelsträngigen Pause von HDR anstelle von NHEJ repariert wird. HDR gerichtet integration von Transgenen kann bestätigt mit ähnlichen Methoden auf die Verfahren in diesem Protokoll zur Verfügung gestellt werden. Fehlerbehebung Lieferung von ZFNs ZFN Lieferung und Ausdruck-Lieferung können durch Lieferung einer GFP oder andere solche Plasmid für die Visualisierung und / oder die Quantifizierung. Gesteuert werden Niedrige Expression aufgrund Promoter Inkompatibilität mit dem Zelltyp von Interesse können durch Zustellung ZFNs in mRNA-Format überwunden werden. Darüber hinaus kann die Kälte-Schock-Methode verwendet werden, um weiteren Erhöhung der Wirksamkeit von ZFNs in Zellen. 12. Wenn mRNA verwendet wird es unerlässlich, dass die Zellen vor der Lieferung gewaschen, um sicherzustellen, dass alle aus Serum stammender RNasen wurden entfernt wird. Es ist auch klug, um die mRNA auf Eis auftauen, und fügen Sie es zu den Zellen im allerletzten Moment eine Chance für den Abbau zu minimieren. Cel-I-Test Die Gründung der Cel-I ASSAy ist spezifisch und ausreichend Verstärkung des Locus von Interesse. Wenn nicht-spezifische Amplifikationsprodukte beobachtet werden verwenden Standard-PCR-Verfahren zur Problembehandlung, um die Spezifität wie Optimierung der Vorlage Betrag, Primer-Konzentration, und Radfahren Parameter zu erhöhen. Führen Sie PAGE-Analyse als Standard zu Agaroseelektrophorese entgegengesetzt, wie das letztgenannte Verfahren keine ausreichende Auflösung und Empfindlichkeit. Cel-I-Digest Bedingungen können auch optimiert werden, wenn nicht verdaute Produkt oder übermäßigen Schlieren beobachtet werden. Titration der Menge an Cel-1-Nuclease und / oder Länge der Kochzeit kann titriert werden, um diese Aspekte zu verbessern.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Nuclease S (Cel-1-Enzym) </td><td> Transgenomic </td><td> 706025 </td></tr><tr><td> Expand High Fidelity PCR System </td><td> Roche </td><td> 03 300 242 001 </td></tr><tr><td> Cell Line Nucleofector Kit V </td><td> Lonza </td><td> VCA-1003 </td></tr><tr><td> GenElute HP endotoxinfreier Plasmide Maxiprep Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

genome editing with compozr custom zinc finger nucleases (zfns)

Genome-Bearbeitung ist eine leistungsfähige Technik, die verwendet werden, um Genfunktionen und den genetischen Grundlagen von Erkrankungen aufklären können. Traditionelle Gen Bearbeitungsmethoden wie chemisch-basierten Mutagenese oder zufällige Integration von DNA-Sequenzen übertragen wahllosen genetischen Veränderungen in einer allgemeinen ineffizient und erfordern Einbau von unerwünschten oder synthetische Sequenzen mit aberranter Kulturbedingungen, möglicherweise verwirrend biologische Studie. Im Gegensatz dazu können transiente ZFN Expression in einer Zelle ermöglichen präzise, ​​vererbbare Gen-Bearbeitung in sehr effizienter Weise ohne die Notwendigkeit für die Verwaltung von Chemikalien oder die Integration von synthetischen Transgene. Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) sind Enzyme, die binden und schneiden verschiedene Sequenzen der doppelsträngigen DNA (dsDNA). Eine funktionale CompoZr ZFN Gerät besteht aus zwei einzelnen monomeren Proteine, die eine DNA &quot;half-site&quot; binden von ca. 15-18 Nukleotiden (siehe Abbildung 1). Wenn zwei ZFN MonoMers &quot;nach Hause&quot; zu ihren benachbarten Zielstellen die DNA-Spaltung Domänen dimerisieren und erstellen Sie ein Doppel-(DSB) in der DNA. 1 Einführung von ZFN-vermittelte DSBs im Genom wird die Grundlage für hocheffiziente Genom-Bearbeitung. Imperfect Reparatur von DSB in einer Zelle über die nicht-homologen Ende (NHEJ) DNA-Reparaturwegs in kleine Insertionen und Deletionen (indels) führen. Erstellung der indels innerhalb des Gens kodierende Sequenz von einer Zelle in Leserasters nachfolgenden funktionellen Knockout eines Genlocus mit hoher Effizienz. 2 ergeben Während dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von ZFNs, ein Gen-Knockout erstellen, Integration von Transgenen kann auch über durchgeführt werden Homologie-gerichteten Reparatur an der ZFN Schnitt vor Ort. Die CompoZr Benutzerdefinierte ZFN-Service stellt eine systematische, umfassende und gut charakterisierten Ansatz zur gezielten Gen-Bearbeitung für die wissenschaftliche Gemeinschaft mit ZFN Technologie. Sigma Forscher arbeiten eng mit den Ermittlern zu 1) perform Due-Diligence-Analyse einschließlich der Analyse der relevanten Gen-Struktur, Biologie und Modell-System gemäß den Projektzielen, 2) wenden dieses Wissen auf eine solide Targeting-Strategie, 3 entwickeln), dann planen, bauen, und funktionell zu validieren ZFNs für Aktivität in einer entsprechenden Zelllinie. Der Prüfer erhält positive Kontrolle genomischer DNA und Primer, und ready-to-use ZFN Reagenzien sowohl in Plasmid-DNA und in-vitro-transkribierten mRNA-Format geliefert. Diese Reagenzien können dann für die transiente Expression in des Ermittlers Zelllinie oder Zelltyp der Wahl geliefert werden. Die Proben werden dann für die Gen-Bearbeitung an dem Ort von Interesse durch molekularbiologische Standardtechniken, einschließlich PCR-Amplifikation, enzymatischen Verdau und Elektrophorese getestet. Nach dem positiven Signal für die Gen-Editing in der Anfangsphase Bevölkerung erkannt wird, sind Single-Cell-Zellen geklont und genotypisiert zur Identifizierung von Mutanten-Klone / Allele.

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Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

Die CompoZr Benutzerdefinierte Zinkfinger-Nuclease (ZFN) Service ermöglicht die präzise Bearbeitung Genoms in jedem Organismus oder einer Zelllinie an jedem Ort durch den Anwender definiert. Dieser Artikel beschreibt das Verfahren für die Konstruktion, Herstellung, Prüfung und Umsetzung der CompoZr Benutzerdefinierte ZFN-Service.

Genome Editing mit CompoZr Benutzerdefinierte Zinkfinger Nukleasen (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

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Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

25.2K Aufrufe.  Sigma Life Science. Die CompoZr Benutzerdefinierte Zinkfinger-Nuclease (ZFN) Service ermöglicht die präzise Bearbeitung Genoms in jedem Organismus oder einer Zelllinie an jedem Ort durch den Anwender definiert. Dieser Artikel beschreibt das Verfahren für die Konstruktion, Herstellung, Prüfung und Umsetzung der CompoZr Benutzerdefinierte ZFN-Service.

Serie: Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Gross und Fine Dissection of Inner Ear Sinnesepithelien in Adult Zebrafisch ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Forschung

Biologie

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator (TAPS)

Although tactile spatial acuity tests are used in both neuroscience research and clinical assessment, few automated devices exist for delivering controlled spatially structured stimuli to the skin. Consequently, investigators often apply tactile stimuli manually. Manual stimulus application is time consuming, requires great care and concentration on the part of the investigator, and leaves many stimulus parameters uncontrolled. We describe here a computer-controlled tactile stimulus system, the Tactile Automated Passive-finger Stimulator (TAPS), that applies spatially structured stimuli to the skin, controlling for onset velocity, contact force, and contact duration. TAPS is a versatile, programmable system, capable of efficiently conducting a variety of psychophysical procedures. We describe the components of TAPS, and show how TAPS is used to administer a two-interval forced-choice tactile grating orientation test.
Corresponding Author: Daniel Goldreich

A Tactile Automated Passive-Finger Stimulator TAPS

We describe a computer-controlled device for investigating the sense of touch: the Tactile Automated Passive-finger Stimulator (TAPS). We describe the components of TAPS, and show how TAPS is used to administer a two-interval forced-choice tactile grating orientation test.

Ein taktiles Automated Passive-Finger-Stimulator (TAPS)

Although tactile spatial acuity tests are used in both neuroscience research and clinical assessment, few automated devices exist for delivering ...

Measurement Of Neuromagnetic Brain Function In Pre-school Children With Custom Sized MEG

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain generates electric fields  - that can be recorded using electroencephalography (EEG)- and their concomitant magnetic fields  - detected by MEG. MEG signals are detected by specialized sensors known as superconducting quantum interference devices (SQUIDs). Superconducting sensors require cooling with liquid helium at -270 &deg;C. They are contained inside a vacumm-insulated helmet called a dewar, which is filled with liquid. SQUIDS are placed in fixed positions inside the helmet dewar in the helium coolant, and a subject's head is placed inside the helmet dewar for MEG measurements. The helmet dewar must be sized to satisfy opposing constraints. Clearly, it must be large enough to fit most or all of the heads in the population that will be studied. However, the helmet must also be small enough to keep most of the SQUID sensors within range of the tiny cerebral fields that they are to measure. Conventional whole-head MEG systems are designed to accommodate more than 90% of adult heads. However adult systems are not well suited for measuring brain function in pre-school chidren whose heads have a radius several cm smaller than adults. The KIT-Macquarie Brain Research Laboratory at Macquarie University uses a MEG system custom sized to fit the heads of pre-school children. This child system has 64 first-order axial gradiometers with a 50 mm baseline[2] and is contained inside a magnetically-shielded room (MSR) together with a conventional adult-sized MEG system [3,4]. There are three main advantages of the customized helmet dewar for studying children. First, the smaller radius of the sensor configuration brings the SQUID sensors into range of the neuromagnetic signals of children's heads. Second, the smaller helmet allows full insertion of a child's head into the dewar. Full insertion is prevented in adult dewar helmets because of the smaller crown to shoulder distance in children. These two factors are fundamental in recording brain activity using MEG because neuromagnetic signals attenuate rapidly with distance. Third, the customized child helmet aids in the symmetric positioning of the head and limits the freedom of movement of the child's head within the dewar. When used with a protocol that aligns the requirements of data collection with the motivational and behavioral capacities of children, these features significantly facilitate setup, positioning, and measurement of MEG signals.

The advent of MEG systems sized for young children opens important new opportunities to study brain development. The new system, together with a protocol that aligns experimental requirements with the capacities of children, can be used to study cognitive and language processes in healthy, awake children aged three to six.

Measurement Of neuromagnetischen Hirnfunktionen Kinder im Vorschulalter mit benutzerdefinierten Sized MEG

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain ...

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1. Complex genomes encode at least hundreds of miRNAs, which primarily inhibit the expression of a vast number of target genes post-transcriptionally 2, 3. miRNAs control a broad range of biological processes 1. In addition, altered miRNA expression has been associated with human diseases such as cancers, and miRNAs may serve as biomarkers for diseases and prognosis 4, 5. It is important, therefore, to understand the expression and functions of miRNAs under many different conditions.
Three major approaches have been employed to profile miRNA expression: real-time PCR, microarray, and deep sequencing. The technique of miRNA microarray has the advantage of being high-throughput, generally less expensive, and most of the experimental and analysis steps can be carried out in a molecular biology laboratory at most universities, medical schools and associated hospitals. Here, we describe a method for performing custom miRNA microarray experiments. A miRNA probe set will be printed on glass slides to produce miRNA microarrays. RNA is isolated using a method or reagent that preserves small RNA species, and then labeled with a fluorescence dye. As a control, reference DNA oligonucleotides corresponding to a subset of miRNAs are also labeled with a different fluorescence dye. The reference DNA will serve to demonstrate the quality of the slide and hybridization and will also be used for data normalization. The RNA and DNA are mixed and hybridized to a microarray slide containing probes for most of the miRNAs in the database. After washing, the slide is scanned to obtain images, and intensities of the individual spots quantified. These raw signals will be further processed and analyzed as the expression data of the corresponding miRNAs. Microarray slides can be stripped and regenerated to reduce the cost of microarrays and to enhance the consistency of microarray experiments. The same principles and procedures are applicable to other types of custom microarray experiments.

A simple procedure of performing custom microRNA microarray experiments is described. The steps include isolating RNA, labeling RNA and reference DNA, hybridizing the samples to microarrays, scanning the microarrays, quantifying and analyzing hybridization signals.

Performing Benutzerdefinierte MicroRNA Microarray-Experimenten

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Maus-Genom-Engineering mit Designer Nukleasen

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell populations.&#160;These cultures contain the cells of interest, but are also contaminated with undifferentiated ESCs, non-neural derivatives and other neuronal subtypes.&#160; This limits their use in in vitro and in vivo applications, such as in vitro modeling for drug discovery or cell replacement therapy. To help overcome this, reporter cell lines, which offer a means to visualize, track and isolate cells of interest, can be engineered.&#160;However, to achieve this in human embryonic stem cells via conventional homologous recombination is extremely inefficient.&#160;This protocol describes targeting of the Pituitary homeobox 3 (PITX3) locus in human embryonic stem cells using custom designed zinc-finger nucleases, which introduce site-specific double-strand DNA breaks, together with a PITX3-EGFP-specific DNA donor vector. Following the generation of the PITX3 reporter cell line, it can then be differentiated using published protocols for use in studies such as in vitro Parkinson&#8217;s disease modeling or cell replacement therapy.

Reporter cell lines offer a means to visualize, track and isolate cells of interest from heterogeneous populations.&#160;However, gene-targeting using conventional homologous recombination in human embryonic stem cells is extremely inefficient. Herein, we describe targeting CNS midbrain specific transcription factor PITX3 locus with EGFP using zinc-finger nuclease enhanced homologous recombination.

Zinkfinger-Nuklease Verbesserte Gene Targeting in humanen embryonalen Stammzellen

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

Direkter Protein Lieferung Säugerzellen mit Zellpermeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Zink-Finger-Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

Genome Editing in<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Verwendung von Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Assessing Mineral Availability in Fish Feeds using Complementary Methods Demonstrated with the Example of Zinc in Atlantic Salmon

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a systematic approach combining different methodologies to assess the availability of zinc (Zn) in Atlantic salmon (Salmo salar). Considering that several Zn chemical species can be present in an Atlantic salmon feed, it was hypothesised that Zn availability is influenced by the Zn chemical species present in the feed. Thus, in this study, the first protocol is about how to extract the different Zn chemical species from the feed and to analyze them by a size exclusion chromatography-inductively coupled plasma mass spectroscopy (SEC-ICP-MS) method. Subsequently, an in vitro method was developed to evaluate the solubility of dietary Zn in Atlantic salmon feeds. The third protocol describes the method to study the impact of changing Zn chemical species composition on the uptake of Zn in a fish intestinal epithelial model using a rainbow trout gut cell line (RTgutGC). Together, the findings from the in vitro methods were compared with an in vivo study examining the apparent availability of inorganic and organic sources of Zn supplemented to Atlantic salmon feeds. The results showed that several Zn chemical species can be found in feeds and the efficiency of an organic Zn source depends very much on the amino acid ligand used to chelate Zn. The findings of the in vitro methods had less correlation with that outcome of the in vivo study. Nevertheless, in vitro protocols described in this article provided crucial information regarding Zn availability and its assessment in fish feeds.

This article explains in detail a systematic approach to assess micro-mineral availability in Atlantic salmon. The methodology includes tools and models with increasing biological complexity: (1) chemical speciation analysis, (2) in vitro solubility, (3) uptake studies in cell lines, and (4) in vivo fish studies.&#160;

Bewertung der Verfügbarkeit von Mineralien in Fischfuttermitteln mit komplementären Methoden, die am Beispiel von Zink im Atlantischen Lachs demonstriert wurden

Assessing the availability of dietary micro-minerals is a major challenge in mineral nutrition of fish species. The present article aims to describe a ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.