Die O9-1-Zelllinie ist ein sehr nützliches Werkzeug zur Untersuchung von neuralen Kammzellen in vitro. Es hat ein großes Potenzial für den Einsatz in einer breiten Palette von Anwendungen in verschiedenen Einsatz von Forschung. O9-1-Zellen haben offensichtliche Vorteile, wie einfachen Zugang, und schnell ausreichende Zellzahlen für Experimente zu erhalten, so dass es eine leistungsfähige Methode kostenlos zu In-vitro-Studien von neuronalen Kammzellen.

Bereiten Sie zunächst Basalmedien für die O9-1-Zellkultur gemäß dem Textprotokoll vor. Filtern Sie dann die Basalmedien und wickeln Sie sie in Folie, um sie vor dem Licht zu schützen. Danach sammeln Sie konditionierte Basalmedien aus aktivierten STO-Zellen gemäß dem Textprotokoll.

Zuerst tauen Sie zwei Stunden lang eine Aliquot von Kellermembranmatrix auf Eis auf. Anschließend die Kellermembranmatrix mit gefiltertem sterilisiertem DMEM mit 10%FBS auf eine Endkonzentration von 0,5mg/ml verdünnen. Beschichten Sie die Platte mit der Kellermembranmatrix bei Raumtemperatur für eine Stunde.

Dann aspirieren Sie die Kellermembranmatrix beim Kippen der Platte. Trocknen Sie die Platten bei 30 Grad Celsius für 30 Minuten. Wenn Sie der Platte die Kellermembranmatrix hinzufügen, stellen Sie sicher, dass die Lösung den Brunnen gleichmäßig abdeckt, um die Zelleigenschaften zu erhalten und unnötige Abweichungen zwischen den Experimenten zu vermeiden.

O9-1-Zellen wiederherstellen, indem Sie eine Kryo-Vial in ein 37 Grad Celsius Wasserbad legen. Langsam die Durchstechflasche wirbeln, bis die Lösung vollständig in Flüssigkeit umschlägt. Danach die Zelllösung von der Kryo-Vial in ein 15ml Zentrifugenrohr übertragen.

Fügen Sie fünf Volumes DMEM mit 10%FBS in das Rohr ein, um die Zellen erneut aufzuhängen. Zentrifugieren Sie die Zellen für drei Minuten bei 180 Gs.Dann, aspirieren Sie die Überstand, achten Darauf, nicht das Pellet zu stören. Als nächstes setzen Sie das Pellet in konditionierten Basalmedien, ergänzt durch LIF und BFGF, wieder auf.

Säen Sie die Zellen in einer sechs Brunnenplatte, und agitieren Sie die Platte, um die Zellen gleichmäßig zu säen. Wenn Sie die Platte aufrichten, tun Sie dies horizontal und vertikal, da das Wirbeln der Platte dazu führt, dass sich die Zellen in Richtung Der Mitte konzentrieren. Und lassen Sie diese Zellen über Nacht in einem Standard-Zellkultur-Inkubator anhaften und wachsen.

Stellen Sie sicher, dass die Zellen angefügt sind, bevor Sie das Medium ändern. Wenn die O9-1-Zellen 80% Konfluenz erreichen, tauen Sie die Kellermembranmatrix auf und bereiten Sie eine Kellermembranmatrix-beschichtete Platte wie zuvor beschrieben vor. Fügen Sie dann Basalmedien, die mit LIF und BFGF ergänzt werden, in die Membranmatrix ein.

Spülen Sie die Brunnen vorsichtig mit 2ml DPBS zweimal ab. Dann dissoziieren Sie die Zellen mit 1ml von 0,05%Trypsin EDTA bei 37 Grad Celsius für drei Minuten. Neutralisieren Sie das Trypsin mit einer gleichen Menge DMEM mit 10%FBS, indem Sie die Flüssigkeit wiederholt über die gesamte Oberfläche des Brunnens pipetieren.

Dann übertragen Sie die Zelllösung in ein Zentrifugenrohr. Und Zentrifuge für drei Minuten bei 180 Gs.Aspirieren Sie das Überstand, ohne das Pellet der Zellen zu stören. Als nächstes, resuspendieren Sie das Zellpellet durch sanft pippetting konditionierte Basalmedien mit LIF und BFGF ergänzt.

Säen Sie die Zellen auf die beschichtete Platte, wie zuvor beschrieben. Lassen Sie dann die Zellen in einem Standard-Zellkultur-Inkubator anheften und wachsen. Bereiten Sie zunächst die 2X Gefriermedien gemäß dem Textprotokoll vor.

Anschließend die Medien filtersterilisieren. Spülen Sie die Wände der Platte zweimal mit DPBS, pipettieren Sie sanft, um Zellverluste zu vermeiden. Als nächstes dissoziieren Sie die Zellen mit 0,05%Trypsin EDTA bei 37 Grad Celsius für drei Minuten.

Neutralisieren Sie das Trypsin mit einer gleichen Menge von 10%FBS und DMEM. Übertragen Sie den Inhalt der Platte auf ein Zentrifugenrohr, und Zentrifuge für drei Minuten bei 180 Gs.Dann aspirieren Sie das Überstand und fügen Sie 2ml PBS, um das Pellet wieder auszusetzen. Zentrifugieren Sie die Zelllösung noch einmal und aspirieren Sie das Überstand.

Passen Sie die Menge der Basalmedien in der Röhre nach Bedarf an, und fügen Sie eine gleiche Menge von 2-fachen Gefriermedien hinzu. Übertragen Sie als Nächstes die Zellen auf die beschrifteten Kryo-Fläschchen. Legen Sie die Kryo-Fläschchen in eine Polystyrol-Box mit Deckel, um eine langsame Abkühlrate bei 80 Grad Celsius für mindestens 24 Stunden zu erreichen.

Um SIRNA-Knockdown in O9-1-Zellen durchzuführen, stellen Sie die Zellen wieder her und säen Sie sie aus. Liposomen in einem entsprechenden Volumen serumfreier Medien verdünnen. Anschließend SIRNA in serumfreien Medien gemäß dem Textprotokoll verdünnen.

Danach fügen Sie die verdünnte SIRNA zu den verdünnten Liposomen hinzu, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Mischen Sie die Lösung durch Pipetten, und inkubieren Sie für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Als Nächstes fügen Sie den Zellen ein entsprechendes Volumen von SIRNA-Lipidkomplex hinzu.

Dann inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden in einem Standard-Zellkultur-Inkubator. O9-1-Zellen können unter spezifischen Differenzierungskulturbedingungen in verschiedene Zelltypen differenzieren. Um O9-1-Zellen in Osteoplaste zu differenzieren, bereiten Sie osteogene Differenzierungsmedien gemäß dem Textprotokoll vor.

Schließlich, erkennen Sie den Osteoplastmarker Osteocalcin in differenzierten Osteoplasten durch Immunfärbung. Um O9-1-Zellen in glatte Muskelzellen zu differenzieren, kultizieren Sie sie unter Differenzierungsmedien gemäß dem Textprotokoll und bewerten Sie die Differenzierung durch glatt-muskelbelische Actin-Immunfärbung. In diesem Protokoll wurden sowohl Knock-out- als auch Knock-down-Experimente durchgeführt, um Yap-Funktionsverlust in O9-1-Zellen zu untersuchen.

Unter glatten Muskelzelldifferenzierung Bedingungen, die meisten wilden Typ O9-1 Zellen führte zu glatten MuskelAkt positive glatte Muskelzellen. Yap Null-Zellen jedoch in der Regel nicht in SMA positive glatte Muskelzellen zu unterscheiden. Dies deutet darauf hin, dass Yap eine entscheidende Rolle bei der Differenzierung von neuralen Kammzellen in glatte Muskelzellen spielt.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die O9-1-Zelllinie während des gesamten Prozesses sanft und sorgfältig zu behandeln. Achten Sie darauf, zu verdünnen und verwenden Sie die Basalmembranmatrix richtig, und verwenden Sie 0,05%Trypsin für die Zelldissoziation. Vergessen Sie nicht, dass während der Vorbereitung auf O9-1 Zellkultur, die Arbeit mit Mitomycin c extrem gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Labormantels und Handschuhe sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.