Wir danken dem Bloomington Drosophila Stock Center für die Bereitstellung von Flug Aktien. Wir danken auch den Entwicklungs Studies Hybridoma Bank und Dr. Lynn Cooley (Yale University) für die Bereitstellung von Antikörpern. Ein besonderer Dank geht an AhHyun Yoo für ihre Hilfe zum Manuskript. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada (Krieger), die William und Ada Isabelle Steel Fund (Krieger) und der kanadischen Institutes of Health Research (Harden) unterstützt.

1. Körper Wand Vorbereitung HINWEIS: Herstellung der dritten Larvenlarvenkörperwände (zum Studium der NMJs die die Körperwand Muskeln innervieren) wurde durchgeführt, wie zuvor in Brent et al 10 oder Ramachandran und Budnik 11,12 beschrieben, jedoch mit einigen Modifikationen.. <ol><li> Präparation <ol><li> Heben fly Aktien und Kreuzen bei 25 ° C für fünf bis sechs Tage nach Standardverfahren 13. </li><li> Wählen Sie kriechen dritten Larvenstadium von Fläschchen oder Flaschen mit feinen Pinzette. </li><li> Der Larven in eine kleine Petrischale gegeben, die Phosphatpuffer-Saline (PBS), um Essensreste zu entfernen waschen. </li><li> Legen Sie eine einzelne Larve auf eine Sylgard Scheibe und tauchen Sie es in ein paar Tropfen eiskaltem PBS. Mit eiskaltem PBS wird dazu beitragen, zu betäuben die Larve dass es leichter zu manipulieren. Während der gesamten Präparation zu gewährleisten, dass das Präparat immer in PBS eingetaucht, um ein Austrocknen zu verhindern. </li><li> Positionieren Sie den larva mit seiner Rückenseite nach oben, so dass die beiden Luftröhrenwege unter einem Präpariermikroskop (2A) sichtbar sind. Mit der Pinzette eine minutien Stift zu greifen, Pin die Larve sich am hinteren Ende in der Nähe der Luftlöcher (2B). Mit einem anderen Stift, durchbohren durch die Kutikula am vorderen Ende in der Nähe der Mundhaken. Sanft dehnen die Larve der Länge nach, dann stecken Sie es nach unten (2B). </li><li> Mit Mikrodissektion Schere, klemmen Sie das hintere Ende in der Nähe des Stiftes, um eine kleine Öffnung zu schaffen. Der Schnitt sollte oberflächlich genug, nur durch die Kutikula passieren. </li><li> Dass sich die Spitze der unteren Klinge der Schere in den Einschnitt entlang der gesamten Länge der Rückenmittellinie zwischen den beiden Luftröhrenbahnen (2C) zu schneiden. Richten Sie die Scherenblätter leicht nach oben beim Schneiden um eine Beschädigung der ventralen Körperwand Muskeln. </li><li> Machen Sie eine kleine horizontaler Schnitt leicht anterioren zur Posteriorly platzierten Stift (2C). Stellen Sie einen anderen ähnlichen Schnitt etwas nach vorne platzierten Stift (2C) posterior. Die Schnitte sollten nur durch die Kutikula weiterzugeben. HINWEIS: Die drei Schnitte aus den Schritten 1.1.7 und 1.1.8 in Kombination sollte ein ähnlich &quot; <img fo:content-width="0.09in" src="/files/ftp_upload/52139/52139_letter_I.jpg" width="15px" /> &quot;Wenn sie abgeschlossen sind, das heißt, eine linke und rechte Klappe auf der dorsalen Seite der Larvenkörper hergestellt werden soll. </li><li> Sorgfältig reinigen, die inneren Organe mit der Zange. Hinzufügen von ein paar kräftigen Tropfen PBS helfen verdrängen die Organe aus dem Larvenkörper, wodurch es einfacher, sie zu entfernen. Vermeiden Sie stoßen die Larven Körper, wie es zu Schäden an der Körperwand Muskeln führen. </li><li> Rollen Sie das Larvenkörpers offen und stecken Sie die Ecken nach unten (2D). Wenn Pinning, strecken den Körper Wand horizontal und vertikal, um eine gleichmäßige spannte Rechteck bilden (see 2G für die Form), kümmert sich nicht um die Körperwand Muskeln in den Prozess zu reißen. </li><li> Beenden Sie entfernen alle verbleibenden inneren Organe (2E). </li></ol></li><li> Fixierung und Permeabilisierung <ol><li> Tauchen Sie die fixierten Körperwände in mehrere Tropfen Bouin-Lösung. Inkubieren für 15 Minuten auf Eis. Alternativ können Sie auch 4% Paraformaldehyd (PFA) als Alternative Haarfestiger; Inkubation 30 Min. </li><li> Dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Triton (PBT) zu spülen. </li><li> Mit einer feinen Pinzette vorsichtig die Stifte zu entfernen und die Körperwände durch ihre Ecken in eine silikonisierte 0,65 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Bewahren Sie die Körperwände in PBT bei 4 ° C, bis sie für PLA. Für optimale Ergebnisse, starten Sie eine Immunfärbung der Körperwände innerhalb eines Tages oder zwei der Dissektion. ANMERKUNG: Um auf Reagenzien zu sparen und um sicherzustellen, daß alle Körperwände gleichmäßig während des Assays behandelt wird, kann unterschiedlichen Genotypen in einer einzigen gelegt werdenRohr. Genotypen können durch Abschneiden der Ecken der Körperwände unterschiedlich (siehe 2F für Beispiele) unterschieden werden. </li></ol></li></ol> 2. Immunhistochemie HINWEIS: Immunfärbung von dritten Larvenlarvenkörperwänden wurde durchgeführt, wie zuvor in Brent et al 14 und Ramachandran und Budnik 11 beschrieben, jedoch mit einigen Modifikationen 11,14.. HINWEIS: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur und unter leichtem Schütteln sofern nicht anders angegeben. <ol><li> Blockierung <ol><li> Dreimal für jeweils 10 min Waschen Sie die Körperwände mit PBT. </li><li> Blockieren mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) für 1 Stunde. </li></ol></li><li> Immunfärbung <ol><li> Die Körperwände mit Mäusen und Kaninchen primären Antikörper gegen die beiden Proteine ​​von Interesse Inkubieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C (in 1% BSA verdünnt). In diesem Fall verwenden 1.10 Maus-Anti-Dlg und 1: 250 Kaninchen einnti-HtsM 15,16. Antikörper gegen Marker, die nicht in der Maus oder Kaninchen hergestellt werden, können ebenfalls enthalten sein - zB Verwenden von 1: 200 Ziege-Anti-HRP, um die neuronalen Membranen abzugrenzen. </li><li> Für jede 10 Minuten abwaschen mit PBT dreimal. </li><li> Inkubieren mit Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper, die Markierungen (in 1% BSA verdünnt) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C zu erkennen. Als die PLA-Signal wird später mit einem roten Fluoreszenzfarbstoff sichtbar gemacht, muss ein anderer Fluorophore verwendet werden, um den Marker zu erfassen - zB verwenden 1: 200 FITC-konjugiertem Anti-Ziege, die Ziege-Anti-Hrp Antikörper nachzuweisen. Durch die Verwendung von lichtempfindlichen Reagenzien, halten die Rohre in der Dunkelheit ab diesem Zeitpunkt. HINWEIS: Der Kit, der verwendet wird, ermöglicht die PLA zwischen primären Antikörpern in Mäusen und Kaninchen durchgeführt werden, erhöht, wobei das Signal auf dem roten Kanal unter konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht. Auf Wunsch sind weitere Kits zur Verfügung, die der Test mit prima durchgeführt werden könnenry Antikörper in anderen Spezies gezüchtet, und das Signal auf anderen Kanälen sichtbar gemacht. </li></ol></li></ol> 3. Proximity Ligation Assay HINWEIS: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur und unter leichtem Schütteln sofern nicht anders angegeben. <ol><li> PLA Probes <ol><li> Dreimal für jeweils 10 min Waschen Sie die Körperwände mit PBT. </li><li> Inkubieren mit PLA-Sonden (1: 5-Verdünnung jeder in 1% BSA) für 2 Stunden bei 37 ° C. In diesem Fall verwenden 40 ul der PLA-Sonde-anti-Maus MINUS 40 ul PLA-Sonde-anti-Kaninchen PLUS und 120 ul 1% BSA, um die richtige Eintauchen und Mischen von 5-10 Körperwände zu gewährleisten. Bis zu einer 1:25 Verdünnung der PLA-Sonden können weiterhin in einer ausreichenden Signal-zu-Rausch-Verhältnis (dh bei diesem Experiment) führen. </li></ol></li><li> Ligation <ol><li> Die Körperwände mit Waschpuffer A für 5 Minuten jeweils zweimal waschen. </li><li> Inkubation mit Ligation-Lösung (1.40 Verdünnung Ligase in Ligationspuffer) für 1 Stunde eint 37 ° C. In diesem Fall arbeitet man mit 5 ul Ligase, 40 ul 5 Ligationspuffer und 155 &amp; mgr; l von hochreinem Wasser, um das richtige Eintauchen und das Vermischen von 5-10 Körperwände zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Verstärkung <ol><li> Die Körperwände mit Waschpuffer A für 2 min je zweimal waschen. </li><li> Inkubieren mit Verstärkungslösung (1:80 Verdünnung von Polymerase in Amplifikationspuffer) für 2 h bei 37 ° C. In diesem Fall verwenden 2,5 ul Polymerase, 40 ul 5 Verstärkung Puffer und 157,5 ul von hochreinem Wasser, um die richtige Eintauchen und Mischen von 5-10 Körperwände gewährleisten. </li></ol></li><li> Vorbereitung für Imaging <ol><li> Die Körperwände mit Waschpuffer B 10 min je zweimal waschen. </li><li> Mit 0,01x Waschpuffer B einmal für 1 min waschen. </li><li> Äquilibrieren in einigen Tropfen Befestigungslösung für mindestens 30 min vor der Montage, oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Mit einer feinen Pinzette vorsichtig die Körperwände übertragen auf eine Plattform Schiebe with ihre Nagelhaut nach unten. Positionieren der Körperwände in Reihen und in der gleichen Orientierung in ein oder zwei Tropfen mountant. Legen Sie eine 22 mm x 40 mm Deckglas über die Zubereitung dabei nicht um Luftblasen zu erzeugen, dann verschließen Sie die Folie mit klarem Nagellack. </li><li> Bewahren Sie die Folien im Dunkeln bei -20 ° C, bis sie zur konfokalen Abbildung. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieser Bericht zeigt, wie PLA kann dem Drosophila Larven NMJ angewendet werden. Der Test basiert auf Larvenkörper Wandmuskulatur, die zum Zwecke des Erfassens endogenen Protein-Protein-Wechselwirkungen an der NMJ vorliegenden geführt. Mit dieser Technik und dlg Hts sind gezeigt, um in enger Nähe zueinander sind, und somit in einem Komplex vorhanden sind, und zwar an der postsynaptischen Bereich 27. Zur Unterstützung dieses Ergebnis hat eine frühere Studie Beweise ihrer Verbindung mit den folgend...

Drosophila Discs groß (DLG) ist ein konserviertes Mitglied der membranassoziierten Guanylatkinase Familie von Gerüsten Proteine ​​dirigieren die Montage von großen Proteinkomplexen an spezifischen Stellen der Plasmamembran beitragen. Ursprünglich identifiziert als ein Tumorsuppressor-Protein dient Dlg einer wichtigen Determinante der epithelialen apicobasal Polarität 1,2,3. Dlg dient auch als eine Hauptgerüstmoduls an der neuromuskulären Verbindung (NMJ) der glutamatergen Motoneuronen im Larvenentwicklung 4. Dlg spielt verschiedene Rollen bei der Larven NMJ und seine Polyphänie beruht auf seiner Fähigkeit, mit mehreren Proteinen 5,6 assoziieren. Ein solches Protein ist Hu-li tai Shao (HTS), ein Homolog zu den Säuger adducins, die hauptsächlich in Bezug auf ihre Rolle bei der Regulation des Actin-Zytoskeletts Spektrin 7 beschrieben. Es wurde zuvor gezeigt, dass dlg Hts einen Komplex miteinander anhand von in vitro zu bilden </em&gt; Co-Immunopräzipitation Experimente, die gesamte erwachsene Fliege Lysate 8. Ein Nachteil dieser Ergebnisse ist jedoch, dass sie nicht anzeigen, wo diese komplexen Formen. Mit der Verwendung von Immunhistochemie, werden die Verteilungen und dlg Hts beobachtet, an der postsynaptischen Membran der Larven NMJs lappen, aber sie sind in einem Komplex in diesem Bereich 8? Wie kürzlich gezeigt und weiter hier beschrieben wird Proximity Ligation Assay (PLA) verwendet werden, um für eine in situ-Verbindung zwischen Dlg und Hts speziell auf die Larven NMJ 27 aussehen. PLA ist eine relativ neue Technik, vor allem in der Zell- und Gewebekultur, die Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ 9 erkennen kann. In diesem Assay werden primäre Antikörper gegen die beiden Proteine ​​von Interesse mit einem Paar von artspezifischen sekundären Antikörper nachgewiesen, genannt PLA-Sonden, die an Oligonucleotide konjugiert sind (1A, B). Wenn die zwei Proteins sind in unmittelbarer Nähe zueinander befinden (dh innerhalb von wenigen zehn Nanometern), wobei der Abstand zwischen den angebrachten PLA Sonden können durch Hybridisierung von zwei zusätzlichen Anschluß Oligonukleotide (1C) überbrückt werden. In dieser Konformation sind die freien Enden der Stecker Oligonukleotide nahe genug, um einen Kontakt miteinander herzustellen, und einer geschlossenen, ringförmigen DNA-Molekül kann auf in situ-Ligation (1D) ausgebildet werden. Die kreisförmige DNA-Molekül als Matrize für die in situ Wälzkreis Verstärkung, die durch eines der Oligonukleotide an die PLA-Sonden (1E) konjugiert grundiert wird. Sequenzen innerhalb der resultierenden amplifizierten, konkatemeren DNA-Produkt kann dann mit fluoreszenzmarkierten, komplementär Oligonukleotidsonden (1F) visualisiert werden. Da die amplifizierte DNA bleibt an einer der PLA-Sonden, die subzelluläre Lokalisierung des Protein-Protein-Wechselwirkung withi befestigtna Gewebe kann leicht festgestellt werden. Mehrere Verfahren sind häufig verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erkennen, einschließlich In-vitro-Verfahren, wie Co-Immunopräzipitation, Pulldown-Assays und Hefe-Zwei-Hybrid-Screening, und in-vivo-Techniken, wie Förster Resonance Energy Transfer (FRET) und Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation ( BIFC). Ein Problem der in-vitro-Techniken ist, dass sie nicht erkennen, wo die Wechselwirkung endogen vorkommenden, während die zuvor erwähnten in vivo Techniken beinhalten die künstliche Expression von Fusionsproteinen, die das native Verhalten ihrer endogenen Gegen nicht reflektieren kann. Ein wesentlicher Vorteil der PLA ist, dass es in der Lage die Bestimmung innerhalb eines Gewebes die subzelluläre Lokalisation des endogenen Protein-Interaktoren, die in unmittelbarer Nähe zueinander sind, und wahrscheinlich ein Komplex gebildet ist, mit dem Näherungsgrad erforderlich, um ein Signal, das vergleichbar FR erzeugenET und BIFC. PLA kann Wechselwirkungen mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit aufgrund der Kopplung der Antikörpererkennung und die DNA-Amplifikation nachzuweisen. So kann der Assay diskreten strahlend Signale in Form Pünktchen, die die exakte Position der Wechselwirkung offenbaren erzeugen. Außerdem kann kaum sichtbar Antigene nachgewiesen werden. Schließlich ist PLA eine relativ einfache Technik, um durchzuführen, und es nimmt nicht mehr als eine Standard-immunhistochemischen Verfahren abzuschließen. Daher stellt PLA einen technischen Vorteil gegenüber anderen Protein-Protein-Interaktionsassays, die oft mit langen Vorbereitungszeiten und umfangreiche Fehlersuche ein Problem dar. Dieses Protokoll zeigt, wie PLA kann dem Drosophila Larven NMJ zwecks Erfassen endogenes Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ aufgebracht werden. Hier wird PLA auf Larvenkörperwand Muskel Zubereitungen, für Dlg und Hts erweisen sich in der Tat in einer Anlage sind im postsynaptischen Region NMJs geführt. PLA wurde zuvor nicht verwendet werden, um die Larven NMJ untersuchen, und es gibt derzeit nur eine Handvoll von publizierten Arbeiten, das diesen Assay in Drosophila Gewebe verwendet wurden. Es ist zu hoffen, daß eine weitere Belichtung der PLA zu dem Drosophila-Gemeinschaft wird der erhöhten Verwendung als zusätzliches Werkzeug führen zu anderen, üblicherweise verwendeten Protein-Protein Interaktionsassays ergänzen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="630">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:211px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:120px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:191px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:211px;">Forceps (fine #5)</td>
			<td style="width:120px;">Almedic</td>
			<td>A10-704</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="133">
			<td height="133" style="height:133px;width:211px;">Sylgard Disc</td>
			<td style="width:120px;">World Precision Instruments</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td style="width:191px;">Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter)</td>
			<td style="width:120px;">Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">Microdissection Scissors (ultra fine)</td>
			<td style="width:120px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:111px;">15200-00</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">Platform Slides</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a &#60;20mm gap in between for sample mounting.</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">w1118</td>
			<td style="width:120px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:111px;">3605</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:211px;">hts01103</td>
			<td style="width:120px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:111px;">10989</td>
			<td style="width:191px;">Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Bouin&#39;s Solution</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">HT10132</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="114">
			<td height="114" style="height:114px;width:211px;">4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">PFA (Anachemia Science - 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Triton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">BSA (Bioshop Canada - ALB001). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">mouse anti-Dlg (Discs large)</td>
			<td style="width:120px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">rabbit anti-Pak (p21-activated kinase)</td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:191px;">Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">mouse anti-Wg (Wingless)</td>
			<td style="width:120px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:111px;">4D4</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase)</td>
			<td style="width:120px;">Jackson&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ImmunoResearch</td>
			<td style="width:111px;">123-065-021</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">FITC-conjugated donkey anti-goat</td>
			<td style="width:120px;">Jackson&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ImmunoResearch</td>
			<td style="width:111px;">705-095-003</td>
			<td style="width:191px;">Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO92004</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO92002</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ Detection Reagents Red</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92008</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:211px;">1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:211px;">0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82049</td>
			<td style="width:191px;">Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:211px;">Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">DUO82040</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of in situ protein-protein complexes at the drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

In Wildtyp dritten Larvenlarven NMJs wird Dlg überwiegend an der postsynaptischen Membran des Typs I glutamatergen Boutons gefunden, mit Dlg Immunreaktivität Ebenen sein ausgeprägter Typ Ib boutons als Typ Ist boutons (3A) 4. Hts ist im gesamten Muskel vorhanden, aber konzentriert sich an der postsynaptischen Region Hts Immunreaktivität Ebenen sowohl Typ I boutons gleich erscheinen und wird auch präsynaptisch gefunden (3A &#39;) 8,17. Beachten Sie, dass die Ve...

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Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Dieses Protokoll zeigt, wie Proximity Ligation Assay kann verwendet werden, um in situ Protein-Protein-Wechselwirkungen an der Drosophila Larvenneuromuskulären Verbindung nachzuweisen. Mit dieser Technik werden Discs großen und Hu-li tai Shao gezeigt, um einen Komplex an der postsynaptischen Region, eine Vereinigung die vorher durch Co-Immunpräzipitation identifiziert bilden.

Detektion<em&gt; In-situ-</em&gt; Protein-Protein-Komplexe bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuromuskuläre Junction Mit Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

detection-situ-protein-protein-complexes-at-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

13.0K Aufrufe.  Simon Fraser University.  Dieses Protokoll zeigt, wie Proximity Ligation Assay kann verwendet werden, um in situ Protein-Protein-Wechselwirkungen an der Drosophila Larvenneuromuskulären Verbindung nachzuweisen. Mit dieser Technik werden Discs großen und Hu-li tai Shao gezeigt, um einen Komplex an der postsynaptischen Region, eine Vereinigung die vorher durch Co-Immunpräzipitation identifiziert bilden. 

Serie: Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualisierung von Larven segmentalen Nerven in 3 Rd Instar Drosophila Larven Vorbereitungen

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Sequential Photo-Bleiche zur Einzel-Schwann-Zellen an der neuromuskulären Synapse Delineate

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Funktionelle Analyse der Larvenfütterung Circuit in Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

Der neuromuskulären Synapse: Mess Synapse Größe, Fragmentierung und Veränderungen der synaptischen Protein Dichte Mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Warum Quantifizierung von Bedeutung: Charakterisierung von Phänotypen bei der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Neuromuskuläre Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Neuromuskuläre Synapse Messfunktionalität

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

Zwei Algorithmen für den Hochdurchsatz und Multi-parametrischer Quantifizierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromuskuläre Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Fokale Macropatch Aufnahmen der synaptischen Ströme aus der Drosophila larvalen neuromuskulären Synapse

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...