Dieser Proteomik-Workflow ermöglicht die unvoreingenommene Identifizierung und Kartierung endogener Protein-Protein-Wechselwirkungen mit subzellulärer Auflösung. Diese Technik ist besonders vorteilhaft bei der Untersuchung von Köderproteinen, die dosierempfindlich sind, geringe Häufigkeit, oder mehrere subzelluläre Lokalisationen haben. Diese Methode könnte auf die Kartierung endogenes Proteinwechselwirkungen angewendet werden, vorausgesetzt, es ist ein geeignetes Affinitätsreagenz verfügbar.
Dies ist besonders wichtig für viele der Tausenden von Proteinen, die unbekannte Funktion haben, von denen viele mit menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht wurden. Diese Methode kann an jede Zelllinie oder jedes Gewebe angepasst werden, das für eine subzelluläre Fraktionierung geeignet ist. Jedes Protein mit einem geeigneten Affinitätsreagenz könnte gezielt eingesetzt werden.
Ein gemeinsames Ergebnis für Affinitätsreinigungsexperimente ist oft kein Ergebnis. Wirklich gute Reagenzien, das Sammeln von QC-Daten durchgängig und die Begrenzung der Probenhandhabung sind wirklich wichtig. Wissen Sie, dass Sie ein Beispiel haben.
Zunächst die vorbereiteten Zellpellets 15 Minuten lang im 1X Pelletvolumen des Kaltpuffers A mit Proteasehemmern oder Phosphataseinhibitoren auftauen. Legen Sie das Rohr mit dem Zellpellet auf einen Nutator bei vier Grad Celsius, um bei der Resuspension für 30 Minuten zu helfen. Dann legen Sie das Rohr in einer Zentrifuge bei 2 000 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten zu Pellet.
Dekantieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit dem 5-fachen der gepackten Zellvolumen mit Puffer A.Incubate auf Eis für 20 Minuten wieder auf. Als nächstes pellet wieder bei 2.000 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Den Puffer dekantieren und mit dem 2X original verpackten Zellvolumenpuffer A mit Protease-Inhibitoren oder Phosphatase-Inhibitoren wieder aufsetzen.
Etwa sieben Mal mit dem lockeren Stößel A.Zentrifuge das Lysat für 10 Minuten bei 2 000 mal g und vier Grad Celsius abprallen. Übertragen Sie den Überstand vorsichtig auf ein neues Rohr und blitzen Sie ihn mit flüssigem Stickstoff einfrieren. Bewahren Sie das Lysat bei minus 80 Grad Celsius auf.
Das Pellet mit 0,9-fachem Pelletvolumen des Puffers B mit Proteasehemmern oder Phosphatase-Inhibitoren aussetzen und fünf Minuten bei vier Grad Celsius auf einem Nutator mischen. Um die Kerne zu lysieren, 20 Mal mit dem Titerpestle B.Mix das Kernlysat auf einem Nutator für 30 Minuten bei vier Grad Celsius, so dass es homogen ist. Dann zentrifugieren Sie das Kernlysat für 30 Minuten bei 21.000 mal g bei vier Grad Celsius.
Pipette aus dem Überstand und speichern als löslicher Kernproteinextrakt. Um den löslichen Kernextrakt zu dialysieren, schneiden Sie zunächst eine entsprechende Länge von 24 Millimeter breite Dialyseschläuche mit einem acht Kilodalton Molekulargewicht Cutoff. Klemmen Sie eine Seite des Schlauches und laden Sie das Nukleoplasma in den Schlauch.
Nach dem Laden des Lysats das andere Ende einklemmen und in einen sauberen Glasbehälter mit Puffer C mit Proteaseinhibitoren eintauchen. Dialyze für drei Stunden bei vier Grad Celsius. Danach den dialysierten Kernextrakt Nukleoplasma in ein Rohr und zentrifugieren bei 21.000 mal g bei vier Grad Celsius für 30 Minuten.
Übertragen Sie drei 20 Mikroliter Aliquots des Kernextrakts auf neue Mikrozentrifugenrohre zur Fraktionierungsvalidierung durch Western Blot. Mit Pipettenspitzen, die an der Spitze geschnitten wurden, bereiten Sie eine Protein-A/G-Perlenmischung für jede Replikation vor, indem Sie 12,5 Mikroliter Perlenvolumen von Protein A Sepharose mit 12,5 Mikroliter Protein G Sepharose in Mikrozentrifugenröhren kombinieren. Waschen Sie das Protein A/G Perlengemisch zweimal mit 300 Mikroliter IP-Puffer I.Spin die Perlen bei 1, 500 mal g bei vier Grad Celsius für eine Minute und dekantieren Sie den Puffer.
Als nächstes bereiten Sie das Antikörperprotein A/G Perlen vor. Um den Antikörper an die Perlen zu binden, fügen Sie dem Rohr 300 Mikroliter IP-Puffer I und 10 Mikrogramm des gewünschten Antikörpers hinzu. Lassen Sie die Perlen-Antikörper-Mischung über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Nutator schaukeln.
Jetzt aliquot entsprechende Volumen der kernnuklearen Lysate in niedrig retentionsarme Mikrozentrifugenröhren für ein Milligramm Proteineinsatz pro Replikation. Drehen Sie das Lysat 30 Minuten lang bei 16.000 mal g und übertragen Sie den Überstand auf ein neues Rohr. Fügen Sie einen Mikroliter Benzonase bei 250 Einheiten pro Mikroliter für jedes Milligramm des Kernlysats und Gesteins auf einem Nutator bei vier Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten hinzu.
Um Perlen für die Vorklärung des Lysats vorzubereiten, fügen Sie 12,5 Mikroliter jedes Proteins A und Protein G Perlen zu 1,5 Milliliter Niedrigretentionsröhrchen hinzu. Waschen Sie zwei Mal mit IP-Waschpuffer I mit Proteasehemmern. Dekantieren Sie den Puffer und fügen Sie ein Milligramm des vorbereiteten Kernlysats zu den Perlen hinzu.
Eine Stunde lang bei vier Grad Celsius auf einem Nutator schaukeln. Zentrifuge die vorgeklärten Lysate bei 1, 500 mal g und vier Grad Celsius für eine Minute. Dann waschen Sie das Antikörperprotein A oder G Perlen zweimal mit IP-Puffer I mit Proteasehemmern.
Nach zentrifugieren bei 1, 500 mal g und vier Grad Celsius für eine Minute, dekantieren Sie den Puffer. Übertragen Sie nun das vorab gereinigte Kernlysat auf das Antikörperprotein A oder G Perlen. Vier Stunden lang beim Schaukeln auf einem Nutator bei vier Grad Celsius inkubieren.
Nach der Inkubation zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 1, 500 mal g und vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand in Rohre, die als Durchfluss für jede Replikation gekennzeichnet sind. Waschen Sie das Antikörperprotein A oder G mit einem Milliliter IP-Puffer II mit Proteaseinhibitoren viermal.
Dann waschen Sie die Perlen zwei Mal mit einem Milliliter IP-Puffer I mit Proteasehemmern. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Puffer nach der letzten Wäsche entfernt wird. Elute Protein aus den Perlen durch Inkubation mit 20 Mikroliter 0,1 Molarenglycin bei pH 2,75 jeweils für 30 Minuten auf einem Nutator.
Dann drehen Sie bei 750 mal g und vier Grad Celsius für eine Minute und Pipette aus dem Überstand. Wiederholen Sie diese Inkubation mit Elutionspuffer ein zweites Mal. Nach der Zubereitung des Proteinpellets mit 30 Mikroliters SDS-Alkylierungspuffer wieder aufsetzen.
Inkubieren Sie die Probe auf einem 95 Grad Celsius Hitzeblock für fünf Minuten. Dann bei Raumtemperatur 15 Minuten abkühlen lassen. Fügen Sie 300 Milliliter UA-Lösung und 30 Mikroliter 100 Millimolar TCEP zu jeder Probe hinzu.
Laden Sie die Lösung auf einen 30K-Zentrifugalfilter. Nach dem Spinnen des Zentrifugalfilters bei 21.000 mal g bei Raumtemperatur für 10 Minuten, halten Sie den Durchfluss durch, falls es ein Problem mit dem Filter gibt. Nach dem Waschen des Filters nach dem Manuskript, fügen Sie drei Mikroliter eines Mikrogramms pro Mikroliter Lyse C resuspended in 0,1 Molar Tris pH 8,5.
Füllen Sie die Filter bis zur 100-Mikroliter-Marke mit 0,1 Molaren Tris pH 8,5. Lassen Sie es für eine Stunde bei 37 Grad Celsius verdauen, während auf einem Nutator schaukeln. Als nächstes fügen Sie einen Mikroliter von einem Mikrogramm pro Mikroliter MS-Grade Trypsin hinzu.
Mischen Sie sanft und lassen Sie das Trypsin mit der Probe über Nacht bei 37 Grad Celsius beim Schaukeln auf einem Nutator inkubieren. Am Morgen zentrifugieren Sie mehrmals bei 21.000 mal g für 20 Minuten, um die Peptide aus dem Filter in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr mit geringer Retention zu löschen. Nach der Entsalzung der Peptide mit C18-Spin-Säulen, setzen Sie die lyophilisierten Peptide in sieben Mikrolitern von 0,1%TFA in 5%Acetonitril aus.
Beschallen Sie die Probe für drei Minuten, um sicherzustellen, dass die Peptide resuspendiert wurden, und drehen Sie dann bei 14.000 mal g für 10 Minuten. 15 bis 30 % der Probe zur Analyse auf das Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometriesystem laden. In dieser Studie, Dreifach-Immunpräzipitationen wurden aus fünf Milligramm HeLa Kernextrakt unter Verwendung einer Perle-nur-Kontrolle analysiert.
Der Köder DYRK1A zählte zu den drei topierierten Proteinen über die Kontrolle, was darauf hindeutet, dass das durchgeführte IP-MS-Experiment zuverlässig war. Es wurde eine klare Trennung zwischen den interinierten Interaktoren mit hohem Vertrauen gezeigt, und mehr als 95 % der korifizierten Proteine wurden als unspezifisch identifiziert. Für das Beispiel-DYRK1A-Dataset haben IREF-Interaktionspartner FC-A-Werte von nur 0,45 angezeigt, was eine sehr geringe Anreicherung über die Steuerung darstellt.
Dementsprechend sind viele dieser zuvor gemeldeten Interaktionen falsche Negative innerhalb dieses Datensatzes, indem sie unter den FC-A-Schwellenwert von drei fallen. Die berechnete absolute Kopiernummer jeder IREF-Interaktion zeigte keine Korrelation zu den Erkennungsstufen eines Interaktionspartners durch IP-MS. Die kombinierte Verwendung von FC-A größer als drei und Heiliger größer als 0,9 reduzierte die Liste der hochvertrauensigen Interaktoren auf sechs Proteine.
Bei der Anwendung eines FC-A-Cutoffs von mehr als drei isolierten Dateien wurden dem Netzwerk jedoch acht zusätzliche Proteine zugesetzt. Der wichtigste Teil dieses Protokolls ist die Auswahl von Antikörperreagenz gegen Immunpräzipation. Vor Abschluss dieses Workflows wird die Validierung der Selektivität durch Western Blot oder Coomassie empfohlen.
Belege für Protein-Protein-Wechselwirkungen können durch Co-IP-Western-Blotting identifizierter Interaktoren gefunden werden. Proteinchemische Vernetzung, obwohl komplexer, kann Interaktionsbereiche von Interaktoren offenbaren. Mit dieser Methode hat meine Forschungsgruppe neue Funktionen für DYRK1A entdeckt, eine Proteinkinase, die für die Entwicklung des Gehirns von Säugetieren erforderlich ist und mit der Neuropathologie der Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht wird.
