Diese Arbeit wurde vom Hermelin Brain Tumor Center, Henry Ford Hospital, finanziert.

1. Einzelzellsuspension von frischem chirurgischen Glioblastom-Exemplar für Neurosphärenkultur
<ol><li>Mit schriftlicher Zustimmung der Patienten und in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien, sammeln Tumorproben für die Zellkultur unmittelbar nach Resektionsoperation von hochgradigem Gliom.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Diagnose der Tumorprobe durch Histopathologie. Transportieren Sie die Probe sofort aus dem Operationssaal zur laminaren Strömungsgewebekulturhaube, um sie innerhalb von 1 Stunde von der Operation zu verarbeiten. HINWEIS: Bei Operationen an einem abgelegenen Ort die Tumorprobe in kleinere Fragmente schneiden und in ein Rohr mit DMEM/F12 legen (auf Eis bleiben). Der Tumor kann mehrere Stunden nach der Operation verarbeitet werden.</li>
	<li>Beginnend mit 200-500 mg Gewebe (optimal), Hacken sie die Tumorprobe mit einer Skalpellklinge und übertragen sie in ein 15 ml-Rohr mit 10 ml DMEM/F12-Serum-freien Medium. Mischen Sie durch Mehrmalsinvertieren, lassen Sie die Tumorstücke Sediment durch Schwerkraft, entfernen Medium, und wiederholen Sie bei Bedarf.</li>
	<li>Bereiten Sie die Enzymatische Gewebedissoziationslösung und die Stop-Lösung frisch vor.<ol>
<li>Enzymatische Gewebedissoziationslösung: 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA, 2,5 ml Hank es Balanced Salt Solution (HBSS) calcium- und magnesiumfrei, 2,5 ml Collagenase IV-Stammlösung (2.000 U/ml in HBSS mit Calcium und Magnesium).</li>
		<li>Stop-Lösung: 5 ml Trypsin-Hemmer-Lösung, 5 ml DMEM/F12, 2 l 5.000 U/ml DNAse I (hergestellt in HBSS calcium- und magnesiumfrei).</li>
	</ol></li>
	<li>Entfernen Sie das Medium und fügen Sie der gehackten Tumorprobe eine Lösung für die Enzymatische Gewebedissoziation hinzu, wobei 2 ml für jedes 0,5 g Gewebe verwendet werden. Sanft durch Invertieren mischen.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Gewebe in Lösung bei 37 °C in einem Gewebekultur-Inkubator unter Rotation für 30 min.</li>
	<li>Trituieren Sie mit einer 2 ml Pipette und stoppen Sie die Verdauung oder kehren Sie in den Inkubator für eine weitere 15-30 min Inkubation in Abhängigkeit vom Grad der Verdauung.</li>
	<li>Beenden Sie die Verdauung, indem Sie 2 Bände Stop Solution hinzufügen und mechanisch mit einer 5 ml serologischen Pipette trituieren.</li>
	<li>Filtern Sie das unverdaute Material durch ein 40-m-Zellsieb heraus. Pellet die Zellen bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur, gefolgt von waschen 3x in 10 ml DMEM/F12.</li>
	<li>Das letzte Zellpellet in 5 ml DMEM/F12 wieder aufhängen.</li>
	<li>Die Zellsuspension über 5 ml Lympholyt-M und Pellet bei 1.300 x g für 20 min bei Raumtemperatur langsam schichten.</li>
	<li>Übertragen Sie die Schnittstellenschicht, die die nukleierten Zellen enthält, in eine 15 ml Tube mit 10 ml DMEM/F12.</li>
	<li>Pellet die Zellen bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie die Wäsche mit DMEM/F12 2x mehr.</li>
	<li>Cryopreserve die resultierenden Einzelzellen für die weitere Verwendung durch Wiederaussetzung des Pellets in Recovery Cell Freezing Medium, Aliquoting in Kryovials, langsames Einfrieren, und Lagerung in flüssigem Stickstoff.</li>
	<li>Um Kultur zu sein, setzen Sie die Zellen in Neurosphere Medium, ergänzt mit Growth Factors (NMGF), und Platte mit relativ geringer Dichte (<1 x 105 Zellen/ml) in einem regelmäßigen T25 Gewebekulturkolben unter Standardbedingungen, 5%CO2, 37 °C, befeuchtete Gewebekultur Inkubator (Abbildung 1A).<ol>
<li>Bereiten Sie NMGF mit dem folgenden Rezept vor<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="384">
<colgroup>
<col>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;width:188px;">Für 500 ml DMEM/F12</td>
					<td style="width:79px;"></td>
					<td style="width:117px;"></td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">Lagerlösung</td>
					<td>Volumen</td>
					<td>Endkonzentration</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">N2-Ergänzung (10x)</td>
					<td>5 ml</td>
					<td>1x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">250 mg/ml BSA Stofflösung</td>
					<td>1 ml</td>
					<td>0,5 mg/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">10 mg/ml Gentamicin-Reagenz</td>
					<td>1,25 ml</td>
					<td>25 g/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100x Antimykotik</td>
					<td>2,5 ml</td>
					<td>0,5x</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td>100 mg/ml bFGF</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">100 mg/ml EGF</td>
					<td>0,1 ml</td>
					<td>20 ng/ml</td>
				</tr>
</tbody>
</table>
</li>
	</ol></li>
	<li>Übertragen Sie Neurosphären, die sich über 1-3 Wochen bilden (Abbildungen 1B-E) auf frische Kolben, um sich von angeschlossenen Zellen und Ablagerungen zu trennen. Führen Sie alle 3-4 Tage teilweise Medienänderungen durch. HINWEIS: Wenn orthotopische Xenograft-Tumormitn mit dem obigen Protokoll getrennt werden, können die Schritte 1.11-1.13 weggelassen werden.</li>
</ol>2. Glioblastom Neurosphäre Kultur Pflege und Downstream Anwendungen
<ol><li>
Dissoziation: Überwachen Sie die Neurosphärenkulturen und führen Sie alle 3-4 Tage partielle mittlere Veränderungen durch. Wenn die meisten mehrzelligen Neurosphären im Kolben einen Durchmesser von 100 m erreichen, lösen Sie sich in eine einzellige Suspension auf:<ol>
<li>Übertragen Sie das Medium, das die Neurosphären enthält, auf eine 15 ml-Röhre, Gravitationssediment der Neurosphären für ca. 5 min, entfernen Sie das Medium und setzen Sie das Zellpellet in 10 ml Calcium- und Magnesium-freien DPBS wieder auf.</li>
		<li>Mischen und inkubieren für 10 min bei Raumtemperatur, wie die Zellen Sediment durch Schwerkraft.</li>
		<li>Entfernen Sie 7-8 ml DPBS und dissoziieren Sie die Neurosphären mechanisch mit einer vorgewetteten serologischen Pipette.</li>
		<li>Pellet die dissoziierten Zellen bei 800 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaging: Setzen Sie die dissoziierten Zellen (Schritt 2.1.) in NMGF wieder aus und teilen Sie sie in die erforderliche Anzahl von Kolben (1:3) auf und inkubieren Sie sie unter Standardbedingungen. Sekundäre Neurosphären bilden sich und sollten anschließend für die Bildung tertiärer Sphären dissoziiert werden.</li>
	<li>
Beurteilung der langfristigen Selbsterneuerung:Wiederholen Sie das Dissoziationsverfahren, bis die Neurosphärenkultur mindestens 10 Passagen erreicht, was einem Minimum von 2 Monaten in der Kultur entspricht.</li>
	<li>
Einfrieren: Um die Neurosphären kryokonservieren, die Neurosphären (Schritt 2.1.) zu dissoziieren und das Zellpellet in Recovery Cell Freezing Medium wieder auszusetzen, aliquot in Kryovials, langsames Einfrieren und in flüssigem Stickstoff lagern.<ol>
<li>Um Neurosphärenzellen aus einem gefrorenen Bestand zu kultitopfen: die Zellen bei 37 °C auftauen und sofort in eine 15 ml Tube mit 10 ml DMEM/F12 übertragen. Mischen Sie das Rohr sanft und drehen Sie die Zellen dann bei 800 x g für 5 min bei 4 °C. Waschen Sie das Zellpellet noch einmal und suspendieren Sie die Zellen in NMGF und übertragen Sie es in einen T25-Gewebekulturkolben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zellsuspension für intrakranielles Implantat in immungeschwächter Maus:<ol>
<li>Dissoziieren Sie die Neurosphären (Schritt 2.1.) und setzen Sie das Zellpellet in kalzium- und magnesiumfreien DPBS wieder auf. Zählen Sie lebensfähige Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau-Ausschluss.</li>
		<li>Berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die für das Implantat benötigt werden, in der Regel 3 x 105 Zellen/Maus, übertragen Sie die gewünschte Anzahl von Zellen in eine Durchstechflasche, und pellet die Zellen bei 1.000 x g.</li>
		<li>Setzen Sie das Zellpellet in einem für das Implantat geeigneten Volumen (5 l/Maus) wieder auf, indem Sie vorsichtig auf das Mikrozentrifugenrohr tippen. Legen Sie die Zellsuspension auf Eis und verwenden Sie sie innerhalb von 2 Stunden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Alternatives Protokoll zur Kultivierung tumorigener Glioblastomzellen (für die Fälle, in denen die Neurosphärenkultur versagt)
<ol><li>Ergänzen Sie das NMGF-Medium mit fetalem Rinderserum auf eine Endkonzentration von 2% FBS/NMGF.</li>
	<li>
Beginnend mit Zellen in der NMGF-Kultur: Ernte lebensfähige Zellen aus dem NMGF-Kolben (Abbildung 1F), Resuspend in 2% FBS/NMGF und Platte mit relativ geringer Dichte (<1 x 105 Zellen/ml) in einem normalen T25-Gewebekulturkolben und Kultur unter Standardbedingungen, 5%CO2,37 °C, befeuchteter Gewebekultur-Inkubator (Abbildung 1G).</li>
	<li>
Beginnend mit gefrorenen nie kultivierten Zellen (Schritt 1.14.): Die Zellen auftauen, in serumfreiem Medium waschen und in 2% FBS/NMGF und Kultur, wie in Schritt 3.2 beschrieben, waschen. Culturing in NMGF für 3 Tage vor der Übertragung lebensfähiger Zellen auf 2% FBS/NMGF ist eine Alternative zur Vorauswahl differenzierter Zellen.</li>
</ol>4. Morphologische und molekulare Analyse von Neurosphären durch Immunhistochemie
<ol><li>Kultur die Neurosphären, bis die meisten schwimmenden mehrzelligen Sphäroide erreichen 100 m Durchmesser.</li>
	<li>Entfernen Sie Kulturkolben aus dem Inkubator und pellet sofort die Neurosphären, entfernen Sie Medium und fügen Sie 10 ml DPBS, ohne das Pellet zu stören. DPBS entfernen, in 10% neutral gepuffertem Formalin wieder aufsetzen und 20 min bei Raumtemperatur brüten.</li>
	<li>Pellet die Sphäroide, resuspendieren in 30% Ethanol und inkubieren für 30-45 min.</li>
	<li>30% Ethanol durch 50% Ethanol ersetzen, 15 min brüten und durch frisches 50% Ethanol ersetzen, weitere 30 min inkubieren.</li>
	<li>Wiederholen Sie (Schritt 4.4.) mit 70% Ethanol.</li>
	<li>Ersetzen Sie mit 95% Ethanol zwei Änderungen 10-20 min jeder, und wiederholen Sie mit absolutem Ethanol, bis Sphäroide hellweiß und kondensiert sind.</li>
	<li>Machen Sie einen kleinen Filterpapierkegel aus Linsenpapier und legen Sie ihn in einen kleinen Trichter in einem Becher. Befeuchten Sie das Linsenpapier mit absolutem Alkohol.</li>
	<li>Lösen Sie das Pellet leicht mit frischem 100% Ethanol, gießen Sie überschüssiges Ethanol ab und gießen Sie die Sphäroide durch den Linsenpapierkegel, um sicherzustellen, dass sie an die Spitze des Kegels gehen. Spülen Sie das Rohr mit zusätzlichem absolutem Ethanol und gießen Sie alle verbleibenden Sphäroide durch den Linsenpapierkegel.</li>
	<li>Entfernen Sie den Papierkegel aus dem Trichter und bewegen Sie die Sphäroide vorsichtig in den Boden des Kegels. Falten Sie das Papier in ein Quadrat und stellen Sie sicher, dass die Sphäroide so sicher wie möglich eingeschlossen sind.</li>
	<li>Übertragen Sie die verpackten Neurosphären auf eine Kassette und übertragen Sie sie auf einen automatischen Gewebeprozessor.</li>
	<li>Programmieren Sie den automatischen Gewebeprozessor wie folgt: absolutes Ethanol, 10 min, Xylol, 15 min (2x), Paraffin, 10 min (4x).</li>
	<li>Entfernen Sie die Kassette aus dem Prozessor und legen Sie sie auf den beheizten Teil eines Paraffin-Einbettsystems . Stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche frei von Fragmenten, Staub oder anderen Ablagerungen ist und saugen Sie alle Paraffin aus den Zangen wärmenden Brunnen. Reinigen Sie saubere Paraffinfreie Zangen und fügen Sie eine kleine Menge Paraffin zu einer erwärmten Basisform hinzu.</li>
	<li>Öffnen Sie die Kassette, entfernen Sie das Paket und legen Sie es auf den beheizten Teil des Einbettsystems. Öffnen Sie den Papierkegel vorsichtig, bis die Sphäroide sichtbar sind. So viel Material wie möglich mit vorgewärmten Zangen sammeln und in die flüssige Paraffin in der Grundform übertragen.</li>
	<li>Wiederholen Sie dies bei Bedarf, um so viele Sphäroide wie möglich abzurufen. Kratzen Sie das Tissuepapier vorsichtig mit einer vorgewärmten sauberen Rasierklinge, die mit Ethanol abgewischt wurde, um Restsphäride zu sammeln, ohne Papier in den Block zu bekommen.</li>
	<li>Brechen Sie vorsichtig alle Sphäroidklumpen mit warmen Zangen auf. Verschieben Sie die Sphäroide von den Ecken weg in eine gleichmäßige zentrale Schicht. Bewegen Sie die Basisform in den Kühlbereich, um die Sphäroide an Ort und Stelle zu sichern, fügen Sie die Kassette hinzu, füllen Sie sie langsam mit Paraffin und kühlen Sie gründlich ab.</li>
	<li>Der Neurosphären-Paraffinblock kann für normale Schnitte und Immunhistochemie verwendet werden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors.">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Res. 63, 5821-5828 (2003).</li><li>Ignatova, T. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cell+lines+expanded+in+adherent+culture+have+tumor-specific+phenotypes+and+are+suitable+for+chemical+and+genetic+screens.">Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens.</a> Cell Stem cell. 4, 568-580 (2009).</li><li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging.">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li><li>Leder, K., Holland, E. 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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die richtige enzymatische Tumorzelldissoziation ist ein kritischer Schritt in diesem Protokoll. Das Gewebe muss vor der Inkubation in der Zelldissoziationslösung bei 37 °C unter Rotation für mindestens 30 min gehackt werden, wenn das Gewebe mechanisch trituiert und die Verlängerung der Dissoziation überprüft werden muss. Je nach Grad des Gewebezusammenhalts kann die Inkubation um weitere 15-30 min verlängert werden, je nach Bedarf, um die Dissoziation in einzelne Zellen zu vervollständigen. Inkubation in Dissoziationslösung länger als 1 Stunde wird aufgrund der verminderten Zelllebensfähigkeit nicht empfohlen. Obwohl die optimale Menge an Startgewebe 200-500 mg beträgt, hat dieses Protokoll zu erfolgreichen Neurosphärenkulturen von nur 50 mg Tumorgewebe geführt.
Serumfreies NMGF ist ein selektives Medium, und ein Prozentsatz der neoplastischen Zellen, die den Großteil des Tumors sowie Wirtszellen umfassen, wird nicht überleben, während andere nach der Beschichtung an den mit der Gewebekultur behandelten Kolben anhaften. Es ist entscheidend, dass die Neurosphären, die sich über 1-3 Wochen bilden (Abbildungen 1B-E) auf frische Kolben übertragen werden, um sich von differenzierten Tumorzellen und Ablagerungen zu trennen.
GBM-Zellen enzymatisch dissoziiert und nie kultiviert (Schritt 1.10) können als Backup-Quelle von Zellen zur Kultur in alternativen Medien kryokonserviert werden, falls die Neurosphärenkultur versagt. Wir haben erfolgreich Neurosphärenkulturen aus solchen gefrorenen Beständen gewonnen, sowie Monolayer-Zellen, die in 2% FBS/NMGF wachsen.
Konzeptionell ist "Krebsstammzelle" eine Arbeit in Arbeit und dieses aufstrebende Feld wird von zusätzlichen Klärung profitieren, da die klinischen Implikationen erheblich sind, insbesondere bei der Erzeugung von Tumorheterogenität, Plastizität, und Resistenz gegen Therapie19,20. Die Neurosphärenkulturen sind nicht nur für die Erzeugung patientenspezifischer GBM-Tiermodelle von entscheidender Bedeutung, sondern auch für In-vitro-Studien wie die Veränderung der Zellsignalisierung und der Genexpression als Reaktion auf Wachstumsfaktoren, Hypoxie und pharmakologische Wirkstoffe11,21. Wir haben uns für die Verwendung von Querschnitten von formalin fixierten und paraffinintegrierten Neurosphären entschieden, um die 3D-Architektur zu erhalten, um die Proteinexpression und posttranslationale Modifikationen durch Immunhistochemie11zu untersuchen, aufgrund der überlegenen subzellulären Lokalisation in Bezug auf die häufigere Methode der Kennzeichnung und Abbildung der gesamten Sphäre.
Es hat sich gezeigt, dass nicht alle Zellen innerhalb von Neurosphären aus adulten Säugetiergehirn abgeleitet sind Stammzellen22. In ähnlicher Weise sind die Neurosphären, die von GBM-Tumoren kultiviert werden, wahrscheinlich nicht klonal, aufgrund der Anwesenheit von differenzierteren Krebsvorläuferzellen und Selbstaggregation, bekannt, bei hohen Zelldichten auftreten23, die eine Einschränkung dieser Methode von einigen betrachtet wird. Um die Anreicherung für langfristige, sich selbst erneuernde Stammzellen zu begünstigen, im Gegensatz zu nur Vorläufern, die vorübergehend als Neurosphären wachsen können22, werden die primären Neurosphären für die sekundäre Neurosphärenbildung dissoziiert und für mindestens 10 Passagen weitergeführt, was in etwa 2 Monaten in der kontinuierlichen Kultur entspricht, was ein Hinweis auf eine in Stammzellen angereicherte Populationist 22. Unserer Erfahrung nach können GBM-Neurosphärenkulturen, die diese Marke erreichen, auf unbestimmte Zeit als Neurosphären erweitert werden. Tumor-Grade ist wichtig, da wir erfolgreiche Kulturen von GBMs und anaplastischen Astrozytomen, WHO-Grad IV bzw. III, aber nicht von niedrigeren Gliomen erhalten haben.
Die am weitesten verbreitete Methode zur Kultivierung von Glioblastomzellen, in traditionellen Wachstumsmedium mit 10% FBS ergänzt, führt zu erheblichen genomischen und phänotypischen Divergenz von den ursprünglichen Tumoren 4. Auf der anderen Seite sind Neurosphärenkulturen eine stabile und langfristige Quelle von Zellen, die Krebsstammzellphänotyp4präsentieren. Die Neurosphärenmethode ist für die Anreicherung von CSC in Langzeitkulturen für orthotopische Maus-Xenograft-Modelle immer beliebter geworden, obwohl sie nicht für alle hochwertigen Astrozytomproben erfolgreich ist, was die Hauptschwäche dieser Methode darstellt. Studien, um zu verstehen, wie molekulare Eigenschaften der elterlichen Tumoren die Bildung der Neurosphäre beeinflussen können, sind im Gange. Die Erforschung praktischer alternativer Methoden zu kulturhochwertigen Gliomen, gefolgt von einer umfassenden Validierung, wird angesichts der bedeutsamen Vorteile patientenspezifischer GBM-Modelle gewährt, während wir in eine Ära der personalisierten Medizin vordringen, die durch die Zugänglichkeit von "omics"-Informationen und eine erhöhte Anzahl potenzieller gezielter Therapien angetrieben wird.

Glioblastom (GBM), ein Astrozytom des WHO-Grades IV, ist der am weitesten verbreitete und aggressivste primäre Hirntumor. Verschiedene Entwicklungsphänotypen werden von GBM-Tumorzellen übernommen, einschließlich Zellen, die "Krebsstammzell"-Eigenschaften (CSC) aufweisen, wie die Expression von neuronalen Stammzellmarkern (NSC), langfristige Selbsterneuerung und das Potenzial, differenziertere Zellen hervorrufen zu können, die astrozytische Marker exzieren und den Großteil des Tumors1-3bilden. Während noch Klärungsbedarf in Bezug auf die molekulare Identität von CSC und die klinischen Implikationen besteht, liegt der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit auf der operativen Definition von CSC: langfristige Selbsterneuerung in vitro und die Fähigkeit, den ursprünglichen Tumor bei orthotopischer Implantation bei immungeschwächten Nagetieren zu differenzieren und zu reproduzieren.
Glioblastom-Zellen werden seit Jahrzehnten in traditionellen Medien kultiviert, die 10% fetales Rinderserum (FBS) und mehrere hochdurchlässige kommerziell erhältliche serumkultivierte GBM-Zelllinien bei immungeschwächten Nagetieren tumorigene, aber es gibt eine erhebliche genomische und molekulare Divergenz vom ursprünglichen Tumor4, die ihre Verwendung als klinisch relevante Modelle einschränken. In jüngerer Zeit wurden In GBMs2Zellen mit Stamm-/Vorläufer-Phänotyp identifiziert, die auf EGF und bFGF reagieren. Anschließend wurden dissoziierte GBM-Tumorproben in einem serumfreien Medium3kultiviert, ursprünglich für die Auswahl und Erweiterung neuronaler Stammzellen aus dem erwachsenen Säugetierhirnformuliert 5. Diese Kulturbedingungen behindern das Wachstum der meisten nichtneoplastischen und differenzierteren Tumorzellpopulationen, während sie das Wachstum von Stamm- und Vorläuferzellen als schwimmende mehrzellige Sphäroide oder Neurosphären3bevorzugen, die das Verhalten von adulten neuronalen Stammzellen imitieren5. Umfassender Vergleich der primären GBM-Zellen, die entweder in Neurosphärenmedium kultiviert werden, ergänzt durch Wachstumsfaktoren (NMGF) oder im traditionellen Wachstumsmedium, ergänzt durch 10% FBS, zeigte, dass die GBM-Neurosphären tumoriogen waren, ein Multilineage-Differenzierungspotenzial darstellten und den Genotyp des ursprünglichen Tumors bewahrten, im Gegensatz zu den 10% FBS-Kulturen, die bei niedrigen Passagen nicht tumoriogen waren und in den späten Passagen erheblich von den ursprünglichen Tumoren abwichen4.
Die Isolierung von CSC von dissoziierten GBM-Tumoren durch Zellsortierung auf der Grundlage der Expression des vermeintlichen CSC-Markers CD133 wurde ebenfalls vorgeschlagen6,7, aber weitere Arbeiten deuteten darauf hin, dass der CSC-Phänotyp nicht definitiv mit der Expression solcher Marker8-10in Verbindung gebracht wird, was die anfängliche Begeisterung für diese Strategie verringert, während neue Marker noch getestet werden10. Die bisher nicht verfügbare eines validierten Satzes von Markern, die CSC definieren, zusammen mit dem Ziel einer großflächigen Verstärkung dieser Zellen für präklinische Studien macht die Verwendung von Zellsortierung für routinemäßige CSC-angereicherte Kulturen unpraktisch. GBM-Zellen, die durch die Fähigkeit ausgewählt wurden, als Neurosphären in NMGF zu wachsen, drücken ausnahmslos neuronale Stammzellmarker aus. Wir haben beobachtet, dass Sox2 und Nestin allgegenwärtig in Neurosphärenkulturen exprimiert werden, während CD133-Protein in einer Teilmenge der GBM-Neurosphären vorhanden ist (unveröffentlichte Daten und Referenz11).
Mehrere Laboratorien verfolgen Neurosphärenkulturen aus Glioblastom-Tumoren mit dem gleichen allgemeinen Ansatz der enzymatischen Dissoziation und Kultivierung in serumfreien Medium mit Wachstumsfaktoren3,4,11-14, während andere Kollegen haben Versuche berichtet, langfristige Neurosphärenkulturen aus GBM-Proben ohne Erfolg wachsen . Die allgemeine Methode für enzymatische Dissoziation und Neurosphärenkultur von hochgradigen Gliomen, die hier vorgestellt wird, ähnelt dem, was in den obigen Veröffentlichungen beschrieben wurde. Wir haben das Protokoll auf der Grundlage unserer Erfahrungen mit der Trennung und Kultivierung von über 100 GBM-Samples optimiert. Die Effizienz der Gewinnung langfristiger Neurosphärenkulturen aus frischen GBM-Proben unter Anwendung des hier vorgestellten Protokolls beträgt über 40 %, ähnlich wie bei den wenigen Berichten, die Effizienzdaten3,15zeigen, was zur Erforschung alternativer Protokolle wie der kontinuierlichen oder zeitweise kultivierenden Zellkultivierung in serumfreiem Medium in Gegenwart von EGF und bFGF als Monolayer n. B. auf Oberflächen führt, die mit ECM-Protein16,17beschichtet sind. Neurosphärenkulturen sind immer noch der am meisten validierte und immer beliebter werdende Ansatz, um GBM-Tumoren molekulare Eigenschaften und tumorigenes Potenzialzuerhalten 3,4,11-14, daher ist unser Ansatz, Neurosphärenkulturen zuerst zu versuchen, während gleichzeitig alternative Methoden zur Kultivierung von GBM-Zellen getestet werden, die keine langfristigen selbsterneuernden Neurosphären bilden ( Abbildung1), um die Darstellung von GBM-Tumoren zu erhöhen, die in Tiermodellen verwendet werden können. Hier stellen wir ein Protokoll zur Kultivierung von Neurosphären aus GBMs vor. Für Zellen, die keine Neurosphären bilden, zeigen wir eine einfache Modifikation im Wachstumsmedium, als erster Versuch, tumorigene Zellen aus nichtneurosphärenden GBMs zu kultivieren, mit vielversprechenden Ergebnissen und noch immer einer umfassenden Validierung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="644">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin - EDTA 0.05%</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14170-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase Type 4</td>
			<td style="width:143px;">Worthington</td>
			<td style="width:119px;">5004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T7659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNase I</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D4527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 Supplement (100x)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Albumin from Bovine Serum, cell culture grade</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gentamicin Reagent Solution</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td style="width:143px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recombinant Human EGF</td>
			<td style="width:143px;">PeproTech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lympholyte-Mouse</td>
			<td style="width:143px;">Cedarlane Laboratories Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">CL5031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12648-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile Cell Strainer, 40 &#956;m</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue Stain, 0.4%</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:143px;">Protocol</td>
			<td style="width:119px;">245-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Histoplex Tissue Cassettes</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-146-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotator</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi BioTec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX&#160;Supplement</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KnockOut D-MEM/F12</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>12660-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stem Pro Neural Supplement&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>A1058-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in  clinically relevant animal models and 3d immunochemistry

Glioblastome, die häufigste und aggressivste Form des Astrozytom, sind feuerfest bis zur Therapie und molekular heterogen. Die Fähigkeit, Zellkulturen zu etablieren, die das genomische Profil der elterlichen Tumoren erhalten, für den Einsatz in patientenspezifischen In-vitro- und In-vivo-Modellen, hat das Potenzial, die präklinische Entwicklung neuer Behandlungen für Glioblastom zu revolutionieren, die auf die molekularen Eigenschaften jedes Tumors zugeschnitten sind.
Beginnend mit frischen hochgradigen Astrozytom-Tumoren, die in Einzelzellen dissoziiert sind, verwenden wir den Neurosphären-Assay als Anreicherungsmethode für Zellen, die Krebsstammzell-Phänotyp darstellen, einschließlich der Expression von neuronalen Stammzellmarkern, der langfristigen Selbsterneuerung in vitround der Fähigkeit, orthotopische Xenograft-Tumoren zu bilden. Diese Methode wurde bereits vorgeschlagen und wird nun von mehreren Ermittlern angewandt. Basierend auf unserer Erfahrung der Dissoziierung und Kultivierung von 125 Glioblastom-Proben gelangten wir zu dem detaillierten Protokoll, das wir hier vorstellen, geeignet für die routinemäßige Neurosphärenkultivierung von hochgradigen Astrozymen und eine großflächige Expansion tumorigener Zellen für präklinische Studien. Wir berichten über die Effizienz erfolgreicher Langzeitkulturen mit diesem Protokoll und schlagen erschwingliche Alternativen für die Kultivierung dissoziierter Glioblastomzellen vor, die nicht als Neurosphären wachsen. Wir beschreiben auch im Detail ein Protokoll zur Erhaltung der Neurosphären 3D-Architektur für die Immunhistochemie. Zellkulturen, die in CSCs angereichert sind und in der Lage sind, orthotopische Xenograft-Modelle zu erzeugen, die die molekularen Signaturen und die Heterogenität von GBMs bewahren, werden immer beliebter für das Studium der Biologie von GBMs und für die verbesserte Gestaltung präklinischer Tests potenzieller Therapien.

Wir haben das oben beschriebene Protokoll auf die Trennung und Kultur 125 frische chirurgische Glioblastom-Proben (Abbildung 1), 88 neu diagnostizierte und 37 wiederkehrende Tumoren (Tabelle 2), mit genehmigter Patientenzustimmung und unter institutionellen Richtlinien angewendet. Die Effizienz des Protokolls zur Etablierung langfristiger Neurosphärenkulturen betrug 41,6 % und ähnlich bei neu diagnostizierten Tumoren und wiederkehrenden Tumoren (Tabelle 2). Für einige GBM-Proben bilden sich in den ersten Tagen Neurosphären (Abbildungen 1B und 1C), während für andere längere Kultivierungszeit erforderlich ist (Abbildungen 1D und 1E).
Die Effizienz der Neurosphärenbildung war nicht ausschließlich vom Grad der Nekrose im Gewebe abhängig, wie die Ergebnisse eines neu diagnostizierten Tumors mit hoher Zelldichte (GBM1) und einem rezidivierenden und nekrotischen Tumor (GBM2) zeigten, der nach den Protokollen 1 und 2 verarbeitet wurde und beide Neurosphärenkulturen nachlieferten (Abbildung 2).
Die Erprobung des tumorigen Potentials jeder Neurosphärenkultur bei immungeschwächten Mäusen ist die entscheidende Validierung dieses Ansatzes zur Anreicherung von CSCs. Unter Verwendung eines Protokolls ähnlich den zuvor beschriebenen18, GBM1und GBM2 Neurosphären wurden in das Gehirn von immungeschwächten Mäusen implantiert, unter institutionellen und IACUC Tierpflegerichtlinien. Die Xenograft-Tumoren zeigen morphologische Eigenschaften von GBMs, wie invasion in das Gehirn Parenchym und Nekrose (Abbildung 2).
GBM3 wurde dissoziiert (Abbildung 1A) und kultiviert in Neurosphärenmedium (Abbildungen 1D und 1E), und in 2% FBS/NMGF (Abbildungen 1D, 1G und 1H). Monolayer-Zellen, die in 2% FBS/NMGF und Neurosphärenzellen kultiviert wurden, wurden in NMGF gekultiviert und die gleiche Anzahl von Zellen wurden in die Nackte Maus implantiert, mit dem gleichen Verfahren wie in Abbildung 2. Zwischen den beiden Präimplantationskulturmethoden wurden keine Unterschiede in Überleben, Tumorwachstumsdynamik oder Morphologie beobachtet (Abbildungen 3A-C). Die Tumorwachstumseigenschaften ändern sich nicht bis zur letzten getesteten Passage, P20 für Neurosphären und P10 für 2% FBS/NMGF. Während neuronale Stammzellmarker, einschließlich Sox2, in den meisten primären GBM-Zellen, die in 10% FBS 3,4,11kultiviert sind, nach unten reguliert werden, ermöglicht NMGF, ergänzt durch 2% FBS, die Beibehaltung der Sox2-Expression (Abbildung 3D).
Neurosphären wurden gemäß Protokoll 4 verarbeitet und mit H&E (Abbildung 4A), Anti-Sox2-Antikörper, gekennzeichnet, die die Kernlokalisierung zeigen (Abbildung 4B), und EGFR-Antikörper, Zellmembranlokalisierung (Abbildung 4C). Dieses Protokoll wurde angewendet, um auf Reize abhängige Änderungen in der Expression von Nestin, GFAP und dem Proliferationsmarker Ki6711zuzugreifen.
Tabelle 2. Effizienz der Ableitung langfristiger selbsterneuernder Neurosphärenkulturen aus GBMs.
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>Pathologie</td>
			<td>N</td>
			<td>Prozentsatz der Proben, die langfristige selbsterneuernde Neurosphären ergeben (n)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastom - unbehandelt, erste Operation</td>
			<td>88</td>
			<td>42.0% (37)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glioblastom - rezidivierend</td>
			<td>37</td>
			<td>40.5% (15)</td>
		</tr>
<tr>
<td>gesamt</td>
			<td>125</td>
			<td>41.6% (52)</td>
		</tr>
</tbody></table><img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig1.jpg"> Abbildung 1. Zellkultur aus frischen Glioblastom chirurgischen Proben. Frische Tumoren werden enzymatisch in einzelne Zellen zerlegt. Die Nukleat-Zellschnittstelle aus dem Dichtetrennmedium wird dann in NMGF plattiert. Dissoziierte Neurosphären sind in NMGF plattiert, und in der Regel 1 Tag nach der Beschichtung gibt es tote Zellen, Trümmer, angehängte Einzelzellen und gelegentliche Teilen von Zellen in Suspension (A). Neurosphärenbildung ist in einigen Fällen schneller (B,C), und langsamer für andere (D,E). Alle Neurosphären sind dissoziiert und für mindestens 10 Passagen neu plattiert, 41,6% GBMs ergeben langfristige selbsterneuernde Neurosphären. Lebensfähige GBM-dissoziierte Zellen, die nicht wachsen, da Neurosphären (F) auf alternative Kulturbedingungen übertragen werden können, z. B. 2% FBS/NMGF (G,H). Bar (A), 100 m, gilt für alle Bilder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig1highres.jpg" target="_blank"> Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig2.jpg"> Abbildung 2. Neurosphären-Generierung und orthotopische Maus-Xenografts aus GBM-Tumoren. Eine Tumorprobe mit hoher Zelldichte (GBM1) und ein Tumor mit hohem nekrotischen Gehalt (GBM2) wurden dissoziiert und Neurosphären für 10 Passagen gemäß den Protokollen 1 und 2 kultiviert. Immungeschwächte Mäuse wurden mit 3 x 105 dissoziierten Neurosphärenzellen implantiert und bei Moribund geopfert. Mausgehirne wurden formalin fixiert und Paraffin für H&E-Färbung und Immunhistochemie-Detektion von menschlichen Markern, menschlichen Mitochondrien (hMit) oder der großen Histokompatibilitätsklasse I Untereinheit HLA-A (MHC-I) eingebettet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig2highres.jpg" target="_blank"> Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig3.jpg"> Abbildung 3. Ähnliches Tumorwachstum bei Mäusen, die intrakraniell mit GBM3-Zellen implantiert wurden, die als Neurosphären in NMGF oder als Monolayer in 2% FBS/NMGF kultiviertwurden. (A) Kaplan-Meier-Überlebenskurven für GBM3, die entweder als Neurosphären in NMGF oder monolayer in 2%FBS/NMGF (beide Passage <10) kultiviert werden, zeigen keinen Überlebensunterschied (n=10, p=0,7174, Log-Rank-Test). (B) Das durch live beobachtete Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) zeigt keinen signifikanten Unterschied in der Tumorwachstumsdynamik zwischen den beiden Gruppen. (C) Tumormorphologie ist nicht zu unterscheiden für 4 GBM3 Xenografts, 2 kultiviert in NMGF und 2 kultiviert in 2% FBS/NMGF. MHC-I-Färbung wie in Abbildung 2beschrieben . Skala, 600 m. (D) Western Blot zeigt den Stammzellhersteller Sox2-Expression, die in 2% FBS/NMGF-Kulturen beibehalten wird, die zur Initiierung der Xenograft-Tumoren verwendet werden (A-C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig3highres.jpg" target="_blank"> Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51088/51088fig4.jpg"> Abbildung 4. Analyse der Proteinexpression in Neurosphärenabschnitten durch Immunhistochemie. Neurosphärenkulturen wurden formalfixiert und Paraffin, wie in Verfahren 4 beschrieben, eingebettet und mit H&E (A), Anti-Sox2-Antikörper (B) und Anti-EGFR-Antikörper (C) gefärbt. DAB Substrat wurde verwendet, um zu visualisieren (B,C). Bar, 20 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51088/51088fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>

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Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Protokoll zur Verbreitung von dissoziierten hochgradigen chirurgischen Gliomproben im serumfreien Neurosphärenmedium zur Auswahl für Zellen mit Krebsstammzellphänotyp. Für Proben, die nicht als Neurosphären wachsen, wird ein alternatives Protokoll vorgeschlagen. Eine Paraffin-Einbettungstechnik zur Aufrechterhaltung der 3D-Neurosphärenarchitektur für die Immunzytochemie wird beschrieben.

Optimierung der hochwertigen Gliom-Zellkultur von chirurgischen Proben für den Einsatz in klinisch relevanten Tiermodellen und 3D-Immunchemie

Glioblastomas, the most common and aggressive form of astrocytoma, are refractory to therapy, and molecularly heterogeneous. The ability to establish cell ...

optimization-high-grade-glioma-cell-culture-from-surgical-specimens

Research

JoVE Journal

Medicine

15.0K Aufrufe.  Henry Ford Hospital. Protokoll zur Verbreitung von dissoziierten hochgradigen chirurgischen Gliomproben im serumfreien Neurosphärenmedium zur Auswahl für Zellen mit Krebsstammzellphänotyp. Für Proben, die nicht als Neurosphären wachsen, wird ein alternatives Protokoll vorgeschlagen. Eine Paraffin-Einbettungstechnik zur Aufrechterhaltung der 3D-Neurosphärenarchitektur für die Immunzytochemie wird beschrieben.

Serie: Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in  Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry

Use of Animal Model of Sepsis to Evaluate Novel Herbal Therapies

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several techniques, including infusion of exogenous bacterial toxin (endotoxemia) or bacteria (bacteremia), as well as surgical perforation of the cecum by cecal ligation and puncture (CLP)1-3. CLP allows bacteria spillage and fecal contamination of the peritoneal cavity, mimicking the human clinical disease of perforated appendicitis or diverticulitis. The severity of sepsis, as reflected by the eventual mortality rates, can be controlled surgically by varying the size of the needle used for cecal puncture2. In animals, CLP induces similar, biphasic hemodynamic cardiovascular, metabolic, and immunological responses as observed during the clinical course of human sepsis3. Thus, the CLP model is considered as one of the most clinically relevant models for experimental sepsis1-3.
Various animal models have been used to elucidate the intricate mechanisms underlying the pathogenesis of experimental sepsis. The lethal consequence of sepsis is attributable partly to an excessive accumulation of early cytokines (such as TNF, IL-1 and IFN-&gamma;)4-6 and late proinflammatory mediators (e.g., HMGB1)7. Compared with early proinflammatory cytokines, late-acting mediators have a wider therapeutic window for clinical applications. For instance, delayed administration of HMGB1-neutralizing antibodies beginning 24 hours after CLP, still rescued mice from lethality8,9, establishing HMGB1 as a late mediator of lethal sepsis. The discovery of HMGB1 as a late-acting mediator has initiated a new field of investigation for the development of sepsis therapies using Traditional Chinese Herbal Medicine. In this paper, we describe a procedure of CLP-induced sepsis, and its usage in screening herbal medicine for HMGB1-targeting therapies.

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection, and can be simulated by a surgical technique termed cecal ligation and puncture (CLP). Here we describe a method to use CLP-induced animal model to screen medicinal herbs for therapeutic agents.

Die Verwendung Tiermodell für Sepsis zu neuartigen Therapien zu beurteilen Herbal

Sepsis refers to a systemic inflammatory response syndrome resulting from a microbial infection. It has been routinely simulated in animals by several ...

Forschung

Medizin

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Verbessertes Protokoll für Laser Mikrodissektion Of Human Pankreasinseln Von chirurgischen Proben

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung der Maus Halslymphknoten

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

Verwendung von Ultrahochfeld-MRT in Kleintier Modelle aus Polyzystische Nierenerkrankung für<em&gt; In Vivo</em&gt; Phänotypisierung und Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

Implementierung von<em&gt; In-vitro-</em&gt; Drug Resistance Assays: Maximierung des Potenzials für die Aufdeckung klinisch relevanter Resistenzmechanismen

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to induce reflux of gastric contents, duodenal contents or mixed contents. Surgical procedures and general principles have been described in detail. A researcher with surgical experience should be able to grasp the technique after a short period of practice. After surgery, most mice can survive and develop reflux esophagitis similar to that in humans. However, it should be noted that histological differences between mouse and human esophagus are the inherent limitations of these surgical models. If used for research on Barrett&#8217;s esophagus and adenocarcinoma, these procedures may need to be combined with genetic modifications.

This article demonstrates surgical procedures of gastroesophageal reflux with mice. These models are useful tools for research on mechanisms and treatment of gastroesophageal reflux disease and potentially Barrett&#8217;s esophagus and esophageal adenocarcinoma.

Chirurgische Modelle aus gastroösophagealen Reflux mit Mäusen

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

Kutane Surgical Denervation: eine Methode zur Prüfung der Voraussetzung für die Nerven in Maus-Modellen der Haut-Krankheit

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to hypoxia sensitive organs such as the brain, compensatory circulatory mechanisms help to maintain an adequate oxygen supply. This is mainly achieved by increased cerebral blood flow. Intermittent hypoxia is a commonly seen phenomenon in patients with obstructive sleep apnea. Acute airway obstruction can also result in hypoxia and hypercapnia. Until now, no adequate model has been established to simulate these dynamics in humans. Previous investigations focusing on human hypoxia used inhaled hypoxic gas mixtures. However, the resulting hypoxia was combined with hyperventilation and is therefore more representative of high altitude environments than of apnea. Furthermore, the transferability of previously performed animal experiments to humans is limited and the pathophysiological background of apnea induced physiological changes is poorly understood. In this study, healthy human apneic divers were utilized to mimic clinically relevant hypoxia and hypercapnia during apnea. Additionally, pulse-oximetry and Near Infrared Spectroscopy (NIRS) were used to evaluate changes in cerebral and peripheral oxygen saturation before, during, and after apnea.

Hypoxia simulation in humans has usually been performed by inhaling hypoxic gas mixtures. For this study, apneic divers were used to simulate dynamic hypoxia in humans. Additionally, physiological changes in desaturation and re-saturation kinetics were evaluated with non-invasive tools such as Near-Infrared-Spectroscopy (NIRS) and peripheral oxygenation saturation (SpO2).

Ein Modell Simulieren von klinisch relevanter Hypoxie beim Menschen

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood coagulation. This phenomenon is observed in many clinical situations, like organ transplantation in the presence of pre-formed anti-donor antibodies, including xenotransplantation, as well as in ischemia/reperfusion injury. In order to reduce animal experimentation according to the 3R standards (reduction, replacement and refinement), in vitro models to study the effect of endothelial cell activation on blood coagulation would be highly desirable. However, common flatbed systems of endothelial cell culture provide a surface-to-volume ratio of 1 - 5 cm2 of endothelium per mL of blood, which is not sufficient for natural, endothelial-mediated anticoagulation. Culturing endothelial cells on microcarrier beads may increase the surface-to-volume ratio to 40 - 160 cm2/mL. This increased ratio is sufficient to ensure the &#34;natural&#34; anticoagulation of whole blood, so that the use of anticoagulants can be avoided. Here an in vitro microcarrier-based system is described to study the effects of genetic modification of porcine endothelial cells on coagulation of whole, non-anticoagulated human blood. In the described assay, primary porcine aortic endothelial cells, either wild type (WT) or transgenic for human CD46 and thrombomodulin, were grown on microcarrier beads and then exposed to freshly drawn non-anticoagulated human blood. This model allows for the measurement and quantification of cytokine release as well as activation markers of complement and coagulation in the blood plasma. In addition, imaging of activated endothelial cell and deposition of immunoglobulins, complement- and coagulation proteins on the endothelialized beads were performed by confocal microscopy. This assay can also be used to test drugs which are supposed to prevent endothelial cell activation and, thus, coagulation. On top of its potential to reduce the number of animals used for such investigations, the described assay is easy to perform and consistently reproducible.

We present an in vitro model which allows the study and analysis of coagulation in whole, non-anticoagulated blood. Anticoagulation in the system depends on the natural anticoagulation effect of healthy endothelial cells and endothelial cell activation will result in clotting.

Bewertung der gerinnungshemmenden und entzündungshemmenden Eigenschaften von Endothelzellen mit 3D Zellkultur und nicht-Antikoagulanzien Vollblut

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

Isolierung und Kultur residenter kardialer Makrophagen aus dem murinen sinoatrialen und atrioventrikulären Knoten

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...