Dieses Protokoll ist wichtig, weil es verwendet werden kann, um das Vorhandensein von Gliom-Biomarkern durch eine Methode zu untersuchen, die die 3D-Struktur von Tumorneurosphären bewahrt. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass die Morphologie von Neurosphären im Vergleich zur Cytospin-Methode beibehalten wird, bei der Zellen einer belastenden Manipulation unterzogen und abgeflacht werden. Diese Methode kann auf alle anderen Gewebekultursysteme angewendet werden, in denen Zellen in 3D kultiviert werden und die Erhaltung der Struktur wichtig ist.
Zu Beginn, Kultur Tumor Neurosphären oder NS in einem T-25 Kolben, bis die Zellen konfluent sind. Wählen Sie den Tumor NS in einem 15 Milliliter konischen Rohr. Impellet die NS bei 300 Gs für fünf Minuten.
Danach das Pellet in einem Milliliter 10%formalin wieder aufhängen und das Rohr bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubieren. Fügen Sie dem erneut suspendierten NS fünf Milliliter HBSS hinzu. Impellet die Zellen wie zuvor beschrieben. Legen Sie das Rohr mit dem Pellet auf Eis.
Das gewaschene NS-Pellet in 500 Mikroliter n2 Prozent warmer Flüssigagarose wieder aufhängen. Und mischen Sie durch ein sanftes Pipettieren oder Rühren. Legen Sie die agarose eingebettete NS auf Eis, bis die Agarose polymerisiert.
Entfernen Sie dann das Stück Agarose und halten Sie die NS. Legen Sie das Stück Agarose in eine Kassette für die Gewebeverarbeitung. Stellen Sie ein Wasserbad auf 42 Grad Celsius. Und legen Sie die Klinge vorsichtig in das Mikrotom ein.
Dann legen Sie den Paraffinblock in das Mikrotome. Drücken Sie mit einer Hand auf den Hebel, der die Dicke jedes Abschnitts auf der linken Seite der Maschine steuert. Drücken Sie den Hebel auf den zweiten Anschlag, um das Mikrotome auf eine Dicke von 30 Mikrometern einzustellen.
Drehen Sie das grobe Handrad, um mit dem Trimmen des Blocks zu beginnen. Sobald die Oberfläche der Probe fast freigelegt ist, stellen Sie den Hebel, der die Dicke steuert, auf fünf oder zehn Mikrometer. Beenden Sie das Trimmen, wenn die Oberfläche der Probe erreicht ist.
Füllen Sie eine Eiskiste mit Eis und gerade genug Wasser, um den Paraffinblock vor dem direkten Berühren des Eises zu schützen. Entsorgen Sie das alte Mikrotom-Blatt und legen Sie eine neue für die Schnitte ein. Trocknen Sie den Paraffinblock mit Gaze und legen Sie ihn auf das Mikrotome.
Drehen Sie das grobe Handrad, um mit der Schnittung des Paraffins zu beginnen. Dann verwenden Sie einen feuchten Pinsel, um das Paraffinband in das 42 Grad Celsius Wasserbad zu übertragen. Platzieren Sie die Zangen mithilfe der Kurve der Zange zwischen zwei Paraffinabschnitten und schieben Sie die Abschnitte sanft auseinander.
Verwenden Sie den feuchten Pinsel, um die getrennten Abschnitte auf positiv geladene Haftmikroskop-Dias zu schieben. Schmelzen Sie zunächst das Paraffin, indem Sie die Dias in einem Metallgestell bei 60 Grad Celsius für 20 Minuten inkubieren. Anschließend deparaffinisieren Sie die Dias über inkubation in einem Rehydrationszug bei Raumtemperatur nach dem Textprotokoll.
Bewahren Sie die Dias im Leitungswasser auf, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern. Danach die Dias im Citratpuffer bei 125 Grad Celsius für 30 Sekunden und 90 Grad Celsius für 10 Sekunden inkubieren. Lassen Sie die Dias abkühlen, bevor Sie sie fünfmal mit destilliertem Wasser abspülen.
Als nächstes inkubieren Sie die Dias bei Raumtemperatur in 0,3% Wasserstoffperoxid für 20 Minuten. Dann waschen Sie die Rutschen für fünf Minuten, dreimal in Waschpuffer mit sanfter Rührung. Inkubieren Sie die Dias über Nacht in einer befeuchteten Kammer, die auf vier Grad Celsius mit verdünntem Primärantikörper eingestellt ist.
Danach die Rutschen dreimal fünf Minuten lang mit sanfter Rührung waschen. Als nächstes inkubieren Sie die Dias in verdünnten biotinylierten Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur für eine Stunde. Waschen Sie die Rutschen dreimal für fünf Minuten in Waschpuffer mit sanfter Rührung.
Dann inkubieren Sie die Dias in avidin-biotinylierten Meerrettich peroxidase Komplex bei Raumtemperatur in der Dunkelheit für eine Stunde. Wiederholen Sie die Wäsche wie zuvor beschrieben. Danach die Dias mit DAB-Hydrogenperoxidsubstratmarken für zwei bis fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Spülen Sie die Dias mit Leitungswasser und tauchen Sie die Dias in Hämatoxylin-Lösung, um sie zu verstellen. Dann spülen Sie die Rutschen gründlich in Leitungswasser, bis das Wasser klar läuft. Dehydrieren Sie die Dias gemäß dem Textprotokoll.
Schließlich die Dias mit einem Xylol-basierten Montagemedium abdecken und auf einer ebenen Oberfläche bei Raumtemperatur trocknen lassen. In diesem Protokoll sind NS fixiert und in Agarose und Paraffin eingebettet. Und dann werden sie für bestimmte Gliom-Biomarker gefärbt.
Die Expressionsstufe von ATRX, einem Chaperonprotein, das die Chromatinstruktur vermittelt, ist niedrig. Ki67, ein Biomarker der Zellproliferation, ist positiv im Gliom NS. Schließlich sind die NS auch positiv für OLIG2, ein Transkriptionsfaktor, der Oligodendrozytendifferenzierung vermittelt. Das Wichtigste, was man sich merken sollte, ist, die Zellen in der warmen Agarose wieder zu suspendieren, bevor man auf Eis überträgt, um eine gleichmäßige Verteilung der Neurosphären zu gewährleisten.
