Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im HIV-Bereich zu beantworten, wie die Identifizierung der Determinanten der Virusübertragung und Pathogenese innerhalb von zwei der am stärksten von der Infektion bewirkten Organe. In der Tat, die wichtigsten fortgeschrittenen Antriebskrankheit Progression finden in Geweben. Die Merkmale und die Komplexität der Infektion werden schlecht durch Zellen im Umlauf reflektiert oder isoliert und infiziert in vitro.
Der Hauptvorteil der Ex-vivo-Gewebekultur zur Untersuchung der HIV-Pathogenese besteht darin, dass sie ihre ursprünglichen räumlichen und funktionellen Beziehungen zwischen den Zellen behält, wenn auch für zwei bis drei Wochen. Zu Beginn füllen Sie eine 100 Millmeter x 20 Millimeter Petrischale mit 20 bis 30 Milliliter CMT. Übertragen Sie Gelatineschwämme mit steriler Zange in die Petrischale.
Befeuchten Sie die Schwämme auf beiden Seiten und lassen Sie die Schwämme für eine Minute aufsaugen. Drücken Sie die Schwämme mit einem sterilen Spachtel etwa zwei Minuten lang gegen den Boden der Petrischale. Verwenden Sie eine sterile Schere, um die rehydrierten Gelatineschwämme in Stücke gleicher Größe von etwa einem Quadratzentimeter zu schneiden.
Dann verwenden Sie Zange, um ein Schwammstück in jeden Brunnen einer Kulturplatte zu übertragen. Fügen Sie drei bis vier Milliliter CMT in jeden Brunnen einer 6-Well-Platte für die Mandeln und einen Milliliter pro Brunnen in eine 12-Well-Platte für den Gebärmutterhals. Legen Sie die Platten in den Inkubator, auf 37 Grad Celsius, 5% CO2 und größer oder gleich 90% Luftfeuchtigkeit, bis die Gewebeexplants bereit sind, auf die Schwämme geladen zu werden.
Übertragen Sie die Mandeln aus dem Transportbehälter in eine 100-Millimeter-Petrischale mit 10 bis 20 Milliliter CMT mit sterilen Zangen. Verwenden Sie den Deckel der Petrischale als Schnittfläche, um das Gewebe zu sezieren. Halten Sie das Gewebe vorsichtig mit Zangen, schneiden Sie jede Mandel in verschiedene, große Stücke mit einem sterilen Skalpell und Klinge.
Verwenden Sie Zangen und ein Skalpell, um kauterisiertes, blutiges und fibroidfarbenes Gewebe sowie alle Teile zu entfernen, die Tonsillolithen oder grünlich-braune Farbe enthalten. Schneiden Sie jedes Gewebestück in Scheiben von etwa zwei Millimetern Dicke. Entfernen Sie alle unerwünschten Teile wie im vorherigen Schritt.
Dann schneiden Sie die Gewebescheiben in zwei Millimeter dicke Streifen. Schließlich schneiden Sie die Gewebestreifen in zwei Millimeter dicke Blöcke. Übertragen Sie die Explanten in eine neue 100-Millimeter-Petrischale mit 10 bis 20 Milliliter CMT, um gewebevernichtenung zu vermeiden, während Sie mit der Zerlegung fortfahren.
Am Ende der Sezierung wirbeln Sie die Platte, um die Explantationsverteilung zu randomisieren. Legen Sie neun Gewebeexplantationen auf jedem Gelatineschwamm in eine 6-Well-Platte mit Zangen, so dass Raum zwischen ihnen. Bringen Sie die Platten an den Inkubator zurück.
Typischerweise werden Explants über Nacht kultiviert. Die Impfung mit HIV wird am nächsten Tag durchgeführt. Damit soll sichergestellt werden, dass sich in der Kultur keine bakterielle oder pilzliche Kontamination entwickelt.
Auch, Zellen neigen dazu, Gewebe explantieren unmittelbar nach der Zerlegung zurück. Das Medium in der 6-Well-Platte mit einer Pipette ansaugen und in einem Behälter mit Desinfektionslösung entsorgen. Neigen Sie die Platte und drücken Sie die Gelatineschwämme vorsichtig auf den oberen Teil des Brunnens, damit sich das Medium am Boden sammeln kann.
Aspirieren und entsorgen Sie das Medium. Dann fügen Sie drei bis vier Milliliter CMT zu jedem Brunnen. Tauen Sie nun die HIV-1-Virus-Vorbereitung im Wasserbad bei 37 Grad Celsius.
Pipette das Virus inoculum direkt auf jeder der neun Explants auf einem Gelatineschwamm. Geben Sie die Platte an den Inkubator zurück. Verwenden Sie den Deckel der Petrischale als Schnittfläche, um das Gewebe zu sezieren.
Halten Sie das Gewebe sanft mit Zangen, trennen Sie die Schleimhaut des Ektocervix und/oder Endocervix von der unter stromalen und Submucosa mit einem Skalpell und einer Klinge, um Schleimhautstreifen zu erhalten. Die Schleimhaut in zwei Millimeter breite Streifen schneiden. Entfernen und entsorgen Sie so viel Submucosa wie möglich, so dass nur eine zwei Millimeter dicke Gewebeschicht übrig bleibt.
Dann schneiden Sie die Streifen in zwei Millimeter dicke Blöcke. Übertragen Sie Gewebeexplantationen in eine neue 100-Millimeter-Petrischale mit 10 bis 20 Milliliter CMT, um Gewebeaustrocknung zu vermeiden, während Sie mit der Zerlegung fortfahren. Am Ende der Sezierung wirbeln Sie die Platte, um die Explantationsverteilung zu randomisieren.
Mit sterilen Zangen die Expflanzen in sterile 1,5 Milliliter konische Schläuche übertragen. Entfernen Sie ein beliebiges Medium im Rohr mit einer Pipette. Für optimale Ergebnisse sollten Explantationen des Gebärmutterhalses so schnell wie möglich nach der Operation, idealerweise am Tag der Operation, verarbeitet und infiziert werden.
Alternativ können Gewebe über Nacht bei 4 Grad in CMT gelagert und unmittelbar nach der Zerlegung infiziert werden. Das HIV-1-Präparat in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auftauen. Nach dem Auftauen das Virus in die Röhren mit den Explants übertragen.
Die Rohre in einen Thermoshaker geben und bei 300 U/min zwei Stunden bei 37 Grad Celsius schaukeln. Die Rohre alle 30 bis 60 Minuten vorsichtig umkehren. In der Zwischenzeit füllen Sie eine 6-Well-Platte mit drei bis vier Milliliter pro Brunnen steriler Phosphat gepufferte Kochstoff.
Verwenden Sie am Ende der Inkubation mit HIV-1 eine Pipette, um alle Viruspräparationen in den Rohren, die die Expflanzen enthalten, in einen Behälter mit Desinfektionslösung zu entsorgen. Dann verwenden Sie Zange und eine Pipette, um die Expflanzen in die 6-Well-Platte mit PBS zu übertragen. Nachdem die Explants eine Minute bei Raumtemperatur in PBS ruhen lassen, waschen Sie sie, indem Sie das PBS zwei- bis dreimal sanft in den Brunnen ein- und auspfeifen.
Entsorgen Sie dann die PBS mit einer Pipette in einen Behälter mit Desinfektionslösung. Fügen Sie drei bis vier Milliliter neue PBS zu jedem Brunnen hinzu. Wiederholen Sie zwei weitere Male für insgesamt drei Wähbe.
Entsorgen Sie das PBS kurz vor der Übertragung der Expflanzen auf die Schwämme, um Gewebeaustrocknung zu vermeiden. Verwenden Sie nun Zangen, um fünf bis acht Expflanzen auf jedem Gelatineschwamm in eine 12-Well-Platte zu übertragen. Geben Sie die Platte an den Inkubator zurück.
Sammeln Sie eine Probe von Kulturmedium mit einer Pipette, und übertragen Sie es in sterile 1,5 oder zwei Milliliter Schraubverschluss Rohre für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius. Ernten Sie die Gewebeexplanten mit sterilen Zangen und übertragen Sie die Expflanzen in sterile 1,5 oder zwei Milliliter Schraubkappenrohre. Verarbeiten oder lagern Sie die Gewebeproben, wie es das Experiment erfordert.
Mit einer Pipette das Restkulturmedium im Brunnen ansaugen und in einen Behälter mit Desinfektionslösung entsorgen. Neigen Sie die Platte und drücken Sie die Gelatineschwämme vorsichtig auf den oberen Teil des Brunnens, damit sich das Medium unten sammeln kann, und dann ansaugen und entsorgen. Fügen Sie nun drei bis vier Milliliter Kulturmedium zu jedem Brunnen hinzu.
Mit sterilen Zangen alle Gewebeexplanten, die in das Medium fielen, in den Gelatineschwamm zurück, bevor sie die Platte an den Inkubator zurückgeben. Entsorgen Sie am Ende der Kultur alle biologischen Abfälle in entsprechenden Behältern nach den Vorschriften des Instituts zum Umgang mit gefährlichen Biologischen sowie der spezifischen Risikobewertung. Die Variabilität zwischen DenSpendern kann sich auf die HIV-1-Replikation auswirken, gemessen an der Konzentration des HIV-Kernproteins p24-Gag simmieren, wie für Gebärmutterhalsgewebe von drei verschiedenen Spendern, die mit demselben Virus inoculum infiziert sind, nachgewiesen wird.
Für den Erstspender deutet die Anhäufung von p24-Gag im Kulturmedium von mit HIV-1 BaL infizierten Explanten eindeutig auf eine Produktinfektion hin. Das antiretrovirale Medikament 3TC, das die HIV-Replikation vollständig abhebt, wurde als Negativkontrolle verwendet. Die Menge an p24-Gag, gemessen im Kulturmedium von 3TC-behandelten Explanten, zeigt den Anteil des Virus inoculum, das speziell absorbiert und von Gewebeexplanten während der Kultur freigesetzt wird.
Bei Gewebeexplanten des zweiten Spenders führt eine HIV-1-Darminfektion zu einer stetigen Abnahme der Konzentration von p24-Gag im Laufe der Zeit, was auf einen Abtschlag der Infektion oder nicht nachweisbar durch p24-Gag-Quantifizierung hindeutet. Dies wird durch 3TC-behandelte Kontrollexate bestätigt, die eine ähnliche HIV-Replikation kinetisch zeigen. Die Infektion von Gewebeexplantationen des dritten Spenders führt zu einer geringen Virusmenge.
In diesem Fall ist die Einbeziehung der 3TC-Behandlung als Negativkontrolle erforderlich, um das Vorhandensein einer Infektion mit der Produktion von De-Novo-Viren festzustellen. Nach diesem Verfahren können analytische Methoden wie Durchflusszytometrie oder Immunfärbung zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt werden, um Fragen über Phänotyp, Proportion oder Gewebeposition der zellabhängigen Zellpopulation zu beantworten. Bei der Gestaltung des Experiments ist es wichtig, die Auswirkungen der Variabilität zwischen den Spendern auf die experimentelle Auslesung der Wahl abzuschätzen.
Die Variabilität zwischen den Spendern kann teilweise durch die Festlegung strenger klinischer und möglicherweise experimenteller Inklusions- und Ausschlusskriterien kontrolliert werden. Ex vivo menschliche Gewebekulturen können verwendet werden, um die Pathogenese von Mikroben außer HIV zu untersuchen, wie z. B. Impfvirus oder Herpesviren. Sie wurden auch als präklinische Plattform für antimikrobielle Toxizität und Ethicacy-Studien verwendet.
Bitte beachten Sie, dass alle menschlichen Exemplare, auch von gesunden Individuen, Infektionserreger beherbergen können. Für den Umgang mit menschlichen Geweben sind angemessene Schulungen, Schulungen und Schutzmaßnahmen erforderlich, um die Sicherheit von Ihnen und Ihren Mitarbeitern zu gewährleisten.
