Diese Forschung wurde durch die Interne Research Program der NCI unterstützt.

1. Vorbereitung der Master-Aktien <ol><li> Machen Master Aktien der in DMSO-Verbindungen getestet werden. Bereiten Aktien zu einem Standard-Konzentration von 20 mM. Hinweis: jede Konzentration oberhalb von 10 mm verwendet werden. Verbindungen, die als Positivkontrollen verwendet werden kann, um diesen Test zu validieren sind RAL-, EVG und DTG. </li><li> Sicherzustellen, dass die Verbindungen in DMSO durch Vortexen der Lösungen mehrmals für 15 sec und Inkubation bei RT für 1 h gelöst. Bewahren Sie die 20 mM Stammlösungen im Dunkeln bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Vorbereitung der 96-Well-Platten für Komponenten-Screening <ol><li> Wählen Sie die Zelllinie getestet werden (zB HOS oder TZM-bl) und Samen 100 ul dieser Zellen bei einer Dichte von 4 × 10 4 Zellen / ml (4000 Zellen / Vertiefung) in Medien (z. B. Dulbecco-modifiziertem Eagle-oder DMEM-Medium mit 5% (v / v) fötalem Rinderserum, 5% Serum neugeborener Kälber, und Penicillin (50 Einheiten / ml) und Strept ergänztomycin). </li></ol> 3. Erzeugung von Virus-Stocks Erzeugen VSV-G-pseudotypisierten HIV-Zellen durch Transfektion 293 32-34 (wie in Fig. 1, Schritt 1). <ol><li> Am Tag vor der Transfektion Platte 293-Zellen auf 100 mm-Schalen in einer Dichte von 1,5 × 10 6 Zellen. </li><li> Am Tag der Transfektion, Transfektion von 293-Zellen mit 16 ug Wildtyp-oder mutierten HIV (pNLNgoMIVR - ΔLUC) und 4 ug VSV (pHCMV-g) unter Verwendung der Calciumphosphat-Methode 35. </li><li> Etwa 6 Stunden nach der Calciumphosphat-Niederschlag wird aufgenommen, Wasch 293 Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und Inkubation mit frischem Medium für 48 Stunden. [DMEM, ergänzt mit 5% (v / v) fötalem Rinderserum, 5% Serum neugeborener Kälber, und Penicillin (50 Einheiten / ml) und Streptomycin (50 ug / ml)]. </li><li> Ernten Sie den Virus enthaltenden Überstände durch Entfernen der Medien aus dem 100 mm DurchmesserGeschirr, verdeutlichen die Überstände durch Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit bei 3000 rpm für 10 min, die Überstände filtriert durch ein 45 &amp;mgr; m-Spritzenfilter Porengröße, Behandlung der Überstände mit Turbo DNase für 30 min bei RT inkubiert und die Überstände in verdünnten Medien für die Zubereitung in Infektionstests . Bewahren Sie die Virusüberstände eingefroren, aliquotiert, bei -80 ° C Anmerkung: Die Menge an p24 im Überstand wird mit einem HIV-1-p24-Enzym-Immunoassay-Kits bestimmt. Die p24-Konzentration verwendet wird, die Menge des Virus in der Probe zu steuern. Ungefähr 500 ng Virus zu HOS-Zellen auf 60 mm-Schalen plattiert bei einer Dichte von 1,5 x 10 5 Zellen / Schale am Tag vor der Infektion zugesetzt. Nach 48 h Inkubation werden die Zellen geerntet, durch Zentrifugation gesammelt, gewaschen und in 100 &amp;mgr; l PBS resuspendiert. In die gleiche Menge an Lumineszenz Reporter-Gen-Assay-Reagenz und messen Luciferase-Aktivität wie in den Abschnitten 5.4.1 und5.4.2. Daraus kann eine geeignete Verdünnung des Virus, wie in Schritt 4.6 beschrieben werden. </li></ol> 4. Substanz-Screening in 96-Well-Platten Bildschirm jede Verbindung in dreifacher Ausfertigung und der Mittelwert der Ergebnisse. Hinweis: Die Wirkung jeder Verbindung auf die virale Replikation wird durch Normierung auf die Ebene der Replikation in Abwesenheit von Verbindung erhalten wird korrigiert. <ol><li> Bestimmen Sie die Summenkonzentrationsbereich zu sehen sein. Hinweis: in der Regel werden die Bildschirme mit 11 Reihenverdünnungen durch Zugabe der Verbindung zu der Platte Spalte für Spalte und Bildschirme mit sieben serielle Verdünnungen gemacht werden, indem die Verbindung von Zeile vorgenommen. Ein dreifacher Reihe von Brunnen muss für die Verbindung keine Steuer reserviert werden. Darüber hinaus muss eine Spalte oder eine Zeile leer bleiben als negativ / Hintergrundkontrolle handeln. Schließlich sei es eine zelluläre Zytotoxizität oder Infektiosität Assay wird diktieren, ob Virus zugegeben. </li><li> Vorbereitenserielle Verdünnungen von der 20 mM Stammlösung. Die Konzentrationen sind in Abhängigkeit von der empirisch ermittelten Bereich von zu testenden Konzentrationen gewählt (wie in Tabelle 1 gezeigt). Bereiten Sie die Verdünnungen in Medien bei 10x die gewünschte endgültige Konzentration, dh wenn die endgültige Konzentration wird bis 100 um, machen Sie eine 1 mM Arbeits Lager. Anmerkung: Verbindungen mit IC 50 s über 5-10 um üblicherweise nicht gute Kandidaten für die Wirkstoffentwicklung. In den ersten Tests prüfen wir die Verbindungen nur gegen den WT-Vektor. Vielversprechende Verbindungen, die effektiv hemmen die WT-Vektor werden dann gegen eine Auswahl von resistenten Mutanten getestet. </li><li> Entfernen der 96-Well-Platten aus dem Inkubator und fügen die serielle Verdünnungen der zu den Vertiefungen in dreifacher Ausführung getestet werden Verbindungen (wie in Fig. 1, Schritt 2 gezeigt). Hinweis: Der in die Vertiefung gegeben Volumen sollte 1/10 Volumen Endkonzentration sein. So fügen Sie 22 &amp;mgr; l / (Endvolumen pOST-Virus zusätzlich 220 ul) für die Infektiosität Assays. Für Zytotoxizitätsassays, fügen Sie 11 ul / (Endvolumen 110 ul / Vertiefung). </li><li> Geben die 96-Well-Platten in den Inkubator. Für eine zelluläre Zytotoxizität Bildschirm, brüten die 96-Well-Platten 48 h bei 37 ° C und keine weiteren Manipulationen werden in Protokoll Nr. 4 benötigt: gehen Sie zu Protokoll 5 Für Infektiosität Assays, folgen weiter den Anweisungen in Protokoll Nr. 4.. </li><li> Nur Infektiosität Assays. Entfernen der Platten aus dem Inkubator nach einem Minimum von 3 h Inkubation bei 37 ° C mit den Verbindungen zu analysieren. Anmerkung: Dies ermöglicht die Verbindung von den Zellen vor der Infektion mit dem HIV-Vektor aufgenommen werden. </li><li> Bereiten Sie eine Verdünnung der Lager-Virus 33, 34 (in der Regel ca. 01.03 Uhr), die eine Luciferase-Signal zwischen 0,2-1,5 relativen Luciferase-Einheiten (RLE) in unbehandelten Zellen produzieren wird. Eine ganze Platte wird ca. 10 ml Verdünnung nehmented-Virus. Füge 100 &amp;mgr; l Virus zu jeder der Vertiefungen, unter Verwendung von entweder 8 oder 12 Mehrkanalpipette. Sie Virus zu den negativen / Hintergrund-Kontrollvertiefungen nicht hinzu. Rückgabe der Platten an den 37 ° C-Inkubator für 48 Stunden. Hinweis: 1:3 Lager Verdünnung des Virus ist typisch Verdünnung, die eine Luciferase-Signal zwischen 0,2 -1,5 RLUs basierend auf einer p24-Test zeigt, dass die Viruskonzentration im Überstand beträgt ca. 500 ng in 1,0 ml produzieren wird. </li></ol> 5. Vorbereitung und Messung der Zytotoxizität und Infektiosität in 96-Well-Platten <ol><li> Saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen (Phenolrot in den Medien mit der Luciferase-Signal stören). Verwenden Sie eine Glaspipette mit einer 200 ul Pipettenspitze bis zum Ende befestigt. Start an der Spitze der Medien und langsam arbeiten nach unten in Richtung der unteren Ecke des Brunnens. Zu viel Zeit verbringen Sie am unteren Rand des Brunnens, oder Zellen können aus dem Bohrloch entfernt werden. </li><li> 100 l PBS, ergänzt mit 0,5 mM MgCl 2 in jede Vertiefung. Dies muss unmittelbar erfolgen, nachdem das Medium entfernt, so dass die Zellen nicht austrocknen. </li><li> Nur für Zytotoxizitätsassays, 5 ml Substratpuffer von der ATP-Lumineszenz-Nachweistest zu jeder Flasche des gefriergetrockneten Reagenz geliefert. Ein Fläschchen für eine 96-Well-Platte aus. <ol><li> In 50 ul Zelllysepuffer von der ATP-Lumineszenz-Nachweistest in jede Vertiefung. Schütteln der Platte mit 96 Vertiefungen bei 700 Upm bei Raumtemperatur für 5 min unter Verwendung eines kompakten Thermomixer. </li><li> In 50 ul des rekonstituierten ATP Lumineszenz-Nachweis-Assay-Reagenz in alle Vertiefungen mit Ausnahme der Negativkontrolle / Hintergrund-Brunnen. Schütteln bei 700 Upm bei Raumtemperatur für 5 min unter Verwendung eines kompakten Thermomixer. Die Platten bei RT für 20 Minuten inkubieren, um Zeit für Signalentwicklung zu ermöglichen. </li><li> Lesen Sie die 96-Well-Platte mit dem Mikroplatten-Luminometer. Hinweis: Öffnen Sie die SoftMax Pro Mikroplatten-Luminometer Programm. Stellen Sie sicher, das Luminometer Lumi ist zu messenzenz bei einer Empfindlichkeit von 5 Messwerten / gut. </li></ol></li><li> Nur für die Infektiosität Assays, 10 ml Substratpuffer von der Lumineszenz Reporter-Gen-Assay auf jeder Flasche des gefriergetrockneten Reagenz geliefert. Ein Fläschchen ist ausreichend für jede Platte mit 96 Vertiefungen. <ol><li> 100 l rekonstituiert Lumineszenz Reporter-Gen-Assay-Reagenz in jede Vertiefung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 min, um Zeit für Signalentwicklung ermöglichen. </li><li> Lesen Sie die 96-Well-Platte mit Hilfe eines Mikroplatten-Luminometer, wie in Abschnitt 5.3.3 durchgeführt. </li></ol></li></ol> 6. Bestimmung der CC 50 und IC 50-Werte für die Verbindungen <ol><li> Übertragen Sie die Daten aus der Luciferase-Mikroplatten-Luminometer in eine Excel-Tabelle. <ol><li> Durchschnittliche sowohl die Luciferase Daten in dreifacher Ausfertigung und Hintergrund / Steuerdaten. Subtrahieren Sie die durchschnittliche Hinter / Steuersignal von der dreifachen durchschnittlichen Signal für den gesamten Konzentrationsbereich. </li> &lt;li&gt; normalisieren die Hintergrund korrigierten mittleren Signal für die Konzentrationsbereiche gegen die Aktivität, ob es sich um Zytotoxizität oder Infektiosität in Abwesenheit irgendeiner Verbindung, um die prozentuale Inhibierung zu bestimmen. Hinweis: prozentuale Hemmung wird als die Luciferase-Aktivität in Anwesenheit von Arzneimittel in der Abwesenheit von Arzneimittel, multipliziert mit 100 geteilt durch die Luciferase-Aktivität bestimmt. </li></ol></li><li> Verwenden Kaleidagraph Software-Programm zu CC 50 und IC 50-Werte zu erhalten <ol><li> Übertragen Sie sowohl die empirisch ermittelten Konzentrationsbereich und prozentuale Hemmung der Luciferase-Aktivität in Kaleidagraph. </li><li> Zeichnen Sie die Daten mit dem Konzentrationsbereich auf der x-Achse und die prozentuale Inhibierung der Luciferase-Aktivität auf der y-Achse. </li></ol></li></ol>

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Pharmacol. 80, 565-572 (2011).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> J. Virol. 59, 284-291 (1986).</li><li>Kemp, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li><li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo.">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li><li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection.">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li><li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds.">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir beschreiben eine schnelle, effiziente und reproduzierbare Assay zum Screening von Verbindungen, die für die Zytotoxizität und auf ihre Fähigkeit, die Replikation von sowohl WT-und arzneimittelresistenten HIV-1 hemmen, verwendet werden können. Die Fähigkeit, schnell Verbindungen zu identifizieren und prüfen ihre Wirksamkeit und Zytotoxizität bei der Entwicklung von neuen und verbesserten Arzneimitteln gegen HIV-1 wichtig. Sobald Bleiverbindungen identifiziert werden, können Analoga der Bleiverbindung hergestellt werden und unter Verwendung des gleichen Assays. Der Test ist relativ einfach. Es gibt sowohl positive und negative Kontrollen, die dem Benutzer die häufigsten Probleme (toxische Verbindungen, Probleme mit dem Vektor stock) Diagnose zu ermöglichen. Die Verwendung eines Dreifachsatzes von Vertiefungen ohne zugesetzte Verbindung zeigt, dass die Virusinfektion aufgetreten. Die Tatsache, dass die Cytotoxizität in einem unabhängigen Test gemessen vermeidet Fehlinterpretation einer Verringerung der Luciferase von Zytotoxizität als eine spezifische Wirkung auf die virale Replikation verursacht werden. Die kritischen Schrittein dem Protokoll werden die Platten vorbereitet, so dass die Zellen gleichmäßig in den Vertiefungen verteilt sind, daß die Bohrungen über die entsprechenden Konzentrationen der zu prüfenden Verbindungen, indem die gleiche Menge an Virus zu jeder der Vertiefungen, und die Messung der Luciferase-Aktivität Bestimmung der CC 50 und IC 50-Werte. Der Test ist sicher, quantitative und reproduzierbar. Der Test ist sicher, weil der Vektor-Replikation defekt. Der Test ist quantitativ und reproduzierbar, da sie auf einer einzigen Runde Vektor, der Luciferase exprimiert, die genau und bequem untersucht werden kann, nach. In einer mehrjährig Virusreplikation Assay wird die gemessene IC 50 hängt von der Anzahl der viralen Lebenszyklen; dies ist ein besonderes Problem, wenn die Tests umfassen sowohl WT und resistenten Viren, die deutlich unterschiedliche Replikations Kapazitäten haben können. Es wurden mehrere enzymatische Tests zuvor berichtet, dassverwendet werden, um an Inhibitoren screenen. Assays, die Echtzeit-PCR-Technologie beinhalten, um integrierte DNA messen erfordern gereinigt rekombinante Proteine ​​(e) und sind in der Regel sowohl arbeitsintensiv und teuer 36, 37. Obwohl es möglich ist, die enzymatische Assays verwenden, um die Wirkung der Verbindungen auf die andere virale Enzyme (RT und Protease) zu messen, wobei jedes Enzym erfordert eine eigene Testsystem. Die eine Runde Vektor-Assay wie beschrieben, kann verwendet werden, ohne Änderung an für RT-Inhibitoren zu screenen. Ein ähnlicher Test kann verwendet werden, um Protease-Inhibitoren zu screenen; jedoch in einem Protease-Inhibitor-Assay, die Verbindungen müssen auf die die Vektoren verwendet Zellen hinzugefügt werden. Eine verwandte Assay mit verschiedenen Zellen und Vektoren können auch verwendet werden, um Umschlag (env) und das Eindringen von HIV-Fusionsinhibitoren screenen. Schließlich kann der Assay verwendet werden, in einem größeren Maßstab, mit automatisierten Roboterspendern. So kann der Assay verwendet werden, um große Bibliotheken von Verbindungen gegen WT und m screenenutant HIV. Die Tatsache jedoch, kann der Assay einen Inhibitor der HIV-Replikation, die in verschiedenen Stadien des viralen Lebenszyklus weist auf eine Beschränkung in der Interpretation der Daten wirkt, zu erfassen. Von selbst der Test wird nicht definiert, welcher Schritt im Lebenszyklus durch eine Verbindung blockiert. Wenn diese Frage stellt, kann es durch Verwendung der Zeit des Assays zusätzlich 38 gelöst werden, und durch Testen der Verbindung gegen gereinigten rekombinanten viralen Proteinen. Leider trotz des Erfolgs der Anti-HIV-Arzneimittel, gibt es immer noch Probleme mit sowohl Beständigkeit und Toxizität. In Abwesenheit einer wirksamen Anti-HIV-Impfstoff, ist es notwendig, nicht nur neue therapeutische Arzneimittel, die wirksam sein werden anhand der vorhandenen Arzneimittel-resistenten Mutanten, sondern auch zu prophylaktischen Medikamente, die die Ausbreitung des Virus zu reduzieren entwickeln zu entwickeln. Wenn die prophylaktische Anwendung von Anti-HIV-Medikamente incudes die Behandlung von nicht-infizierten Menschen wird dieser Ansatz eine besondere Belastung für die Entwicklung von Medikamenten, haben l sind platzierenittle oder keine langfristige Toxizität.

Die Verfügbarkeit von Medikamenten, die an einige wesentliche Schritte in der HIV-1 viralen Lebenszyklus zu Kombinationstherapie (so genannte hochaktive antiretrovirale Therapie oder HAART), die sich stark verbessert hat die Behandlung von HIV-1-Infektionen, und die langfristige Überlebensrate geführt der Patienten. HAART, die typischerweise verwendet Kombinationen von zwei Nukleosid-Reverse-Transkriptase-(RT)-Hemmer und entweder ein Protease-Inhibitor oder ein Nicht-Nukleosid-RT-Hemmer, wurde jetzt eine tödliche Krankheit umgewandelt in ein Leben lang Zustand 1-5. Trotz der vielen Erfolge von HAART in verzögerter Unterdrückung der Virusreplikation, hat es jedoch Einschränkungen. HAART nicht auszurotten HIV, so dass die Patienten nicht geheilt und Therapie ist das Leben lang. Es gibt Probleme mit Medikamententoxizität und mit der Entstehung von resistenten Sorten. Widerstand kann auf alle zugelassenen Anti-HIV-Medikamente, einschließlich der neu zugelassenen Medikamente, die HIV-Integrase (IN) Ziel kommen. Arzneimittelresistenz entsteht wahrscheinlich becaVerwendung von spontanen Mutationen, die während der viralen Replikation (Fehlerrate von 3 x 10 -5 Mutationen / base / Replikationszyklus) auftreten 6. Wenn Mutationen entstehen in den Genen, die für die Ziele der Anti retrovirale Medikamente codiert, wird eine kleine Teilmenge dieser Mutationen zu einer Verringerung der Empfindlichkeit des Virusstammes, um die Medikamente führen. Um die Entwicklung von Resistenzen zu vermeiden, muss Wirkstoffkonzentrationen auf einem Niveau, das die HIV-Replikation vollständig zu unterdrücken, aufrecht erhalten werden. Schlechte Einhaltung der Therapieregime verschärft das Problem, und kann auf die schnelle Entwicklung von Resistenzen führen 7-9. Obwohl Wirkstoffkonzentrationen bei Patienten aufgrund unterschiedlicher Resorption, Stoffwechsel, Verteilung und Ausscheidung Ebenen variieren können hohe Wirkstoffkonzentrationen, um die Toxizität 10 führen. Seit Therapie weiterhin für das Leben des Patienten, gibt es ernsthafte Sicherheitsbedenken hinsichtlich der langfristigen Toxizität von Antiretroviren. Die antiretrovirale Medikamente häufig in HAART verwendet werden, können negative Auswirkungen haben einnd gab es Fälle, wo die Nebenwirkungen wurden lebensbedrohlich 11-15. Die Probleme, die Patienten stoßen mit der Entwicklung von Widerstand und Toxizität zugrunde liegen, die Notwendigkeit, neue Medikamente, die die Replikation der gemeinsamen resistenten Stämme des Virus mit wenig oder keine langfristige Toxizität effektiv blockieren zu entwickeln. Somit besteht ein Bedarf an einem Assay, der für die Verbindungen, die wesentlichen Schritte schnell blockieren im viralen Lebenszyklus zu screenen kann. Hier beschreiben wir ein effizientes Assay, der verwendet werden kann, um die Zytotoxizität der Verbindungen A und ihre Fähigkeit, die Replikation von sowohl WT-und Arzneimittel-resistente HIV-Stämme schnell und effizient zu blockieren auszuwerten. Der Test wir verwenden, ist ähnlich zu einem Test, der entwickelt wurde, um für eine Arzneimittelresistenz in Virus aus Patienten isoliert 16-18 screenen. Obwohl der Test kann ohne Modifikation zum Screening auf Verbindungen, die HIV reverse Transkription blockieren kann verwendet werden, werden wir describe mit dem Test zu bewerten, IN-Inhibitoren. IN ist ein essentielles virales Enzym, das die virale DNA in das zelluläre Genom 19 einfügt. Obwohl eine Reihe von vielversprechenden IN Inhibitoren entwickelt werden, von denen einige derzeit in klinischen Studien nur Isentress 20, 21 (auch als Raltegravir oder RAL bekannt) und in jüngerer Zeit, Elvitegravir (EVG) 22 und Dolutegravir (DTG) 23 wurden von der FDA zugelassen. Diese Verbindungen sind sowohl gegen HIV-B-B-Subtypen und nicht in Zellkultur und in Patienten 24, 25 aktiv. Die Behandlung mit RAL wählt für Arzneimittel-resistente HIV-1-IN-Mutanten, einschließlich Y143R, N155H und G140S/Q148H 24, 26-31. N155H G140S/Q148H und reduzieren auch die Wirksamkeit von EVG, die die Notwendigkeit, IN Strangtransfer-Inhibitoren (INSTIs), die wirksam gegen diese Resistenz-Mutationen sind Design und Entwicklung der zweiten Generation betont.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="659">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">10-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td style="width:157px;">Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SpectraMax Gemini EM</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KaleidaGraph</td>
			<td style="width:157px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:157px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-566-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Alrich</td>
			<td style="width:119px;">T1442-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Turbo Dnase</td>
			<td style="width:157px;">Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millex HA Filter Unit, 0.45 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLAHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HOS cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TZM-bl cells</td>
			<td style="width:157px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:119px;">8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">pNL4.3&#916;Env.LUC</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">VSV-G</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">0200-310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors

Obwohl eine Reihe von Anti-HIV-Arzneimittel genehmigt wurden, gibt es immer noch Probleme mit der Toxizität und Medikamentenresistenz. Dies zeigt die Notwendigkeit, neue Verbindungen, die Infektion durch die gemeinsame arzneimittelresistenten HIV-1-Stämme mit minimaler Toxizität hemmen kann, zu identifizieren. Hier beschreiben wir ein effizientes Assay, der verwendet werden kann, um schnell zu bestimmen, die zelluläre Zytotoxizität und Wirksamkeit einer Verbindung gegen WT und Mutanten-Virusstämme. Die gewünschte Zielzelllinie wird in 96-Well-Platte ausgesät und nach 24 Stunden Inkubation werden seriell Verdünnungen der zu testenden Verbindungen zugegeben. Keine weitere Manipulationen sind für zelluläre Zytotoxizität-Tests erforderlich; für Anti-HIV-Tests eine vorbestimmte Menge von entweder einer WT oder arzneimittelresistenten HIV-1-Vektor, der Luciferase zu den Zellen gegeben drückt. Zytotoxizität wird unter Verwendung eines ATP-abhängige Lumineszenz-Assay und die Wirkung der Verbindungen auf die Infektiosität gemessen wird durch Bestimmen der Menge des gemessenen luciferase in Gegenwart oder Abwesenheit des mutmaßlichen Inhibitoren. Diese Screening-Test dauert 4 Tage dauern und mehrere Verbindungen parallel untersucht werden. Verbindungen werden dreifach durchmustert, und die Daten sind auf die Infektiosität / ATP-Spiegel in Abwesenheit von Zielverbindungen. Diese Technik ermöglicht eine schnelle und genaue Messung der Wirksamkeit und Toxizität von potentiellen Anti-HIV-Verbindungen.

Wenn der Test (Fig. 1, Schritte 1 und 2) wurde erfolgreich durchgeführt, dann sollte die Luciferase-Werte, die in Tabelle 2 präsentierten Daten ähneln Scannen über den Konzentrationsbereich. eine potenziell starke Verbindung wird zeigen zunehmende Luciferase-Aktivität von links nach rechts, und die Steuerung sollte die höchste Luciferase-Aktivität zu haben. Wenn die Luciferase-Aktivität hat 0,1 Relative Luciferase-Einheiten (RLE) über den Konzentrationsbereich nicht überschreiten, dies in der Regel an, dass die Verbindung der Zellen getötet. Wenn die Luciferase Daten größer als oder gleich 2,0 RLU für alle Serienverdünnungen, dann wurden die Verbindungen nicht in der Lage, HIV-1-Infektionen bei den getesteten Konzentrationen zu inhibieren. Auftragen der Konzentration der Verbindungen im Vergleich zu der prozentualen Inhibition der Luciferase-Aktivität in Kaleidagraph (Tabelle 3, Teil A), nach dem Durchführen einer linearen Regressionsanalyse, werden ähnliche Ergebnisse zu produzieren t<html> Schlauch in Tabelle 3, Teil B gezeigt <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Vorbereitung der HIV-1-Virus-Stocks und dem Aufbau der zelluläre Zytotoxizität und Single-Runde Infektiosität Assays. In Schritt 1 293T-Zellen mit pNL4.3ΔEnv.LUC und VSV-G transfiziert und für 48 Stunden inkubiert, um die Virus-34 produzieren . Das Virus wird geerntet und gelagert (bei -80 ° C in Aliquots eingefroren), bis er in die Infektiosität-Assays verwendet wird. Für Schritt 2 werden HOS-Zellen in einer Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät und 24 h lang inkubiert. Die Zellen werden dann mit seriellen Verdünnungen der für 3 Stunden getestet werden Verbindungen vorinkubiert und dann mit Virus (entweder WT oder resistenten) infiziert. Nach einer 48-stündigen Inkubation wird die Luciferase-Aktivität gemessen. le1.jpg &quot;width =&quot; 300 &quot;/&gt; Tabelle 1. Drug Screening Verdünnungs Prototype. Eine strengere Screening beinhaltet 11 Verdünnungsreihen, die in der Regel beginnen bei 10 uM und endet um 0,0005 uM. Die serielle Verdünnungen vorbereitet 10x; es gibt 100 ul Zellen und 100 &amp;mgr; l Virus pro Vertiefung). In diesem Volumen und nach diesen Berechnungen werden die seriellen Verdünnungen genug für 3 Zeilen eines gesamten 96-Well-Platte sein. Die Zytotoxizität-Tests werden auf ähnliche Weise hergestellt; aber die 11 serielle Verdünnungen beginnen bei 250 uM und am Ende bei 0,05 uM. Nur 11 ul der Verdünnungen werden in die Vertiefungen in der Platte, die 100 ul Zellen enthalten aufgenommen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; Tabelle 2. Luciferase-Signal Datenauslesung und Bestimmung der prozentualen Inhibition der Luciferase-Aktivität. Die Datentabelle zeigt einen typischen Satz von Luciferase-Daten für eine erfolgreiche Verbindung. Die Tabelle zeigt auch die weiteren Berechnungen erforderlich, um die prozentuale Hemmung der Luciferase-Aktivität und die CC-50 und IC 50-Werte zu bestimmen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> Tabelle 3. Lineare Regressionsanalyse Datentabelle. Teil A. Grafische Darstellung der Konzentrationsbereich gegenüber der prozentuale Hemmung der Luciferase-Aktivität in Kaleidagraph verwendet wird die entsprechenden Hemmkurven zu produzieren. Teil B, Die Hemmung Kurven durch die parametrische 3 definiertsigmoidale Funktion und Passform auf den Daten, die von linearen Regressionsanalysen 18. Diese Daten-Tabelle wird dann in Verbindung mit Microsoft Excel verwendet, um die Wirkstoffkonzentrationen erforderlich, um Virus-Integration und zelluläre Zytotoxizität von 50%, zB IC 50 und CC 50 hemmen berechnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Hier beschreiben wir zelluläre Zytotoxizität und einzigen Runde Infektiosität Assays, die für die schnelle und genaue Überprüfung von Verbindungen zu erlauben, ihre zelluläre Zytotoxizität (CC 50) zu ermitteln und IC 50-Werte gegen WT-und arzneimittelresistente HIV-1.

Rapid-Screening von HIV-Reverse-Transkriptase und Integrase-Inhibitoren

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

rapid-screening-of-hiv-reverse-transcriptase-and-integrase-inhibitors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K Aufrufe.  National Cancer Institute.  Hier beschreiben wir zelluläre Zytotoxizität und einzigen Runde Infektiosität Assays, die für die schnelle und genaue Überprüfung von Verbindungen zu erlauben, ihre zelluläre Zytotoxizität (CC 50) zu ermitteln und IC 50-Werte gegen WT-und arzneimittelresistente HIV-1. 

Serie: Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

Visualizing Zell-Zell-Transfer von HIV unter Verwendung von fluoreszierenden Klone von HIV und Live-konfokale Mikroskopie

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

In vitro Uncoating von HIV-1-Kerne

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

Reverse-Genetics vermittelte Wiedergewinnung eines infektiösen Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

Hochdurchsatz-Screening für Breitspektrum-Chemische Inhibitoren der RNA-Viren

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocapsid Glühen-vermittelte Elektrophorese (NAME) Assay ermöglicht die schnelle Identifizierung von HIV-1-Inhibitoren Nucleocapsid

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Isolierung der Exosomen aus dem Plasma von HIV-1-positiven Individuen

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.