Die Autoren danken allen Kolleginnen und Kollegen, die diese Arbeit möglich gemacht, vor allem Maya Balamane, Elizabeth Johnston Weiß, Sharon Sjoblom, Greg Ording Zakhona Gumede, Xolile Kineri, Phindile Mabaso, Lungisa Ndwandwe, James Garvey, Gavin Cobb, Senzo Maphanga, Terusha Chetty anerkennen , Kevi Naidoo, Andrew Skingsley, Katharine Stott und Lungani Ndwandwe. Die Autoren möchten auch alle Mitarbeiter der Abteilung für Gesundheit und Africa Centre Personal, das Hlabisa HIV-Behandlung und Pflege-Programm arbeiten zu danken.

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<div> Diese Arbeit wurde durch den Wellcome Trust (082384/Z/07/Z), Europäische Union (SANTE 2007 147-790), des US-Zentrums für Krankheiten unterstützt Kontrolle über CAPRISA (Projekttitel: Stärkung der Gesundheitssysteme und HIV Behandlungsfehler (HIV- TFC)) und die Schweizer South African Joint Research Programme (SSJRP) Forschungsförderung mit dem Titel &quot;Swiss Prot / Südafrika: Protein Bioinformatics Resource Development für wichtige gesundheitsbezogenen Krankheitserreger.&quot; RL wird durch den Wellcome Trust unterstützt (Fördernummer 090999 / Z / 09 / Z). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts. Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren. </div>

Mehrere kostengünstige Inhouse-Verfahren wurden in den Bemühungen, versuchen HIV-Arzneimittelresistenz Genotypisierung erschwinglicher 33, 34, 36, um beschrieben. Es besteht kein Zweifel an der Notwendigkeit, Drogenresistenztests in die Kontinuität der Betreuung für Personen, die antiretrovirale Therapie mit beschränkten Ressourcen zu integrieren. Allerdings konzentrieren sich die meisten der berichteten Verfahren über die Anwendung der Arzneimittel-Resistenz Genotypisierung bei der Überwachung der Arzneimittelresistenz bei einer Bevölkerungsebene. Der Saturn / Life Technologies Genotypisierungsmethode ist eine vollständig integrierte Protokoll für die Überwachung und Kontrolle der Medikamentenresistenz. Diese Methode wurde entwickelt, um eine kostengünstige Umsetzung Protokoll meist Open Source und Open Access Bioinformatik-Ressourcen für die Interpretation von Resistenzen und die Erzeugung von Berichten für die klinische Management. Es wurde durch den Vergleich mit der FDA zugelassen ViroSeq Genotypisierungsmethode zu sein gezeigtpräzise bei der Identifizierung von Arzneimittelresistenzmutationen von einem Gremium von ANRS Eignungsprüfungen Proben in 100% der Laborproben Tafel, die erfolgreich verstärkt wurden. Die Genauigkeit wurde auch an klinischen Proben von Subtyp-C-Viren, die dominierende Subtyp im südlichen Afrika untersucht. Das Verfahren wurde so genau auf Subtyp C-Proben wie am Subtyp A und B. Wenn das Verfahren würde in anderen Teilen der Welt weit verbreitet ist, wo CRF02_AG verwendet werden, gibt es einen Bedarf zur Modifizierung der Primer da das Verfahren gegen eine der Plattenproben, die gezeigt wurde, haben CRF02_AG verstärken. Alternativ kann ein degenerierten Primer empfindlich auf alle Viren der Gruppe M 33, 36 könnten in Regionen eingesetzt werden, wo der Subtyp Verteilung heterogener ist 38. Die Empfindlichkeit der reverse Transkription und PCR kann durch Extrahieren von RNA aus höheren Plasmavolumina wie 500 ml erhöht werden. Das Plasma kann CENTRIF werdenbei 21.000 g für 90 min uged, um die Viruspartikel, bevor mit dem Protokoll, wie durch die virale RNA-Extraktion QIAamp Mini Kit beschrieben fortfahren konzentrieren. Wie gezeigt, hat das neue Verfahren den zusätzlichen Vorteil, dass sie umfassende Berichte zur individuellen Patientenbehandlung erzeugt. Diese Berichte sind eine Konsolidierung des Genotyps, der immunologischen und virologischen Überwachungsdaten sowie klinische und Behandlungsgeschichte von RegaDB. Dies wird durch eine detaillierte Interpretation der Laborresistenzprofil, gefolgt von einem ebenso detaillierte Überprüfung der Krankengeschichte des Patienten sowie Behandlungsempfehlungen begleitet. Die Verwendung von einem Facharzt, um die Berichte zu überprüfen und Behandlungsempfehlungen für die Patienten bietet die dringend benötigte Mentoring für Krankenschwester Praktiker sowie unerfahrene Kliniker, die zunehmend die Bereitstellung sind ART in Südafrika als Teil der WHO-Empfehlungen für die Aufgabenverschiebung. Diese klinischenBerichte haben gezeigt, dass effektive Lernhilfen für Ärzte mit wenig oder keiner Erfahrung in der Arzneimittelresistenzmanagement sein. Aus Patientensicht, reduziert unser Verfahren die Notwendigkeit, zur zentralen Standorten reisen, um HIV-Spezialist Dienste zuzugreifen. Somit ist die beschriebene Protokoll als Ganzes bietet eine gute Plattform, durch die HIV-Arzneimittelresistenz-Management integriert werden können, zu einem erschwinglichen Preis, in der Kontinuität der Betreuung für HIV-infizierten Personen in Ermangelung ART. Die erzeugten Daten können für epidemiologische Zwecke verwendet werden, um die Entwicklung und die Übertragung von Resistenzen in der Gemeinde zu beurteilen. Die Größe des pol-Fragment erzeugt wird, ist gut genug für komplexere phylogenetischen Analyse, die ein besseres Verständnis der Epidemie auf die Bevölkerung produzieren wird.

Die HIV-Epidemie im südlichen Afrika wurde rasch entwickelnden 1 mit einer gleichzeitigen exponentiellen Anstieg der Personen, die antiretrovirale Therapie (ART), vor allem in Südafrika, 2, 3. Als Beweise für die epidemiologische Auswirkungen von großen Behandlungsprogramme bei der Verringerung der Inzidenz 4 und der steigenden Lebenserwartung in begrenzten Ressource-Einstellungen (RLS) 5 weiterhin zu akkumulieren, werden Bemühungen um die Abdeckung zu erhöhen ART intensiviert werden. Die Entwicklung von Richtlinien zur Nutzung der Behandlung als Prävention Werkzeug 6, 7 unter der Test-und Behandlungsprogramme bedeutet, dass die absolute Zahl der Personen, auf die Behandlung wird weiter zunehmen. Eine große Anzahl von Personen auf ART für längere Zeit als die durchschnittliche Lebenserwartung der Menschen auf ART nähert, dass der HIV-infizierten Bevölkerung 8 sein. Die Entwicklung und Übertragung von HIV Resistenzen hat always worden, als eine Bedrohung für die Leistungen der ART 12.09. Somit besteht ein Bedarf für eine strengere Überwachung und Kontrolle der Arzneimittelresistenz als mehr Menschen auf ART eingeleitet. Genotypische Resistenztestung Drogen (BRT) wurde erfolgreich in den entwickelten Ländern verwendet worden, sowohl für die Überwachung sowie die Überwachung der HIV-1-Resistenzen in Personen erhalten ART. In diesen Einstellungen hat GRT in die Kontinuität der Betreuung für HIV-1-infizierten Personen integriert. Die meisten internationalen Leitlinien empfehlen BRT für Erwachsene oder pädiatrische Patienten, bei denen ART (First-Line-und Second-Line) 13-15, anschließend infizierte pädiatrische Patienten, die Prävention der Mutter-zu-Kind-Übertragung (pMTCT) Therapien ausgesetzt, sondern 16, und in den Einstellungen mit Hochebenen übertragen Medikamentenresistenz bei akut infizierten Personen 13-15. Allerdings haben die Kosten, Technologie-und Infrastrukturanforderungen der Umsetzung beschränkttation von ähnlichen Ansätzen zur Arzneimittelresistenz Überwachung in RLS. Die südafrikanische HIV-Behandlung und Überwachung von Richtlinien derzeit nicht empfehlen die Verwendung von BRT in Führungs Wahl der ART für Personen, andernfalls First-Line-Regimen 17. Personen überwiegend auf virologische (HIV-1-RNA-Viruslast) Parametern umgeschaltet. Doch im Jahr 2012, veröffentlichte der Southern African HIV Kliniker-Gesellschaft die ersten Southern African ARV Resistenzen Prüfrichtlinien 18. Diese Richtlinien empfehlen GRT Test für alle Erwachsenen in Ermangelung First-Line-und Second-Line-ART und für infizierte Säuglinge und Kinder bis 18 pMTCT ausgesetzt. Es wird jedoch nicht empfohlen GRT 18 für akut infizierten Personen, weil es keine aktuellen Belege für hohe übertragen Medikamentenresistenz im südlichen Afrika 19-29. Es wird erwartet, dass einige dieser Empfehlungen werden im Laufe der Zeit in die nationale tre integriert werdenatment Richtlinien und Überwachung der verschiedenen Länder in der Region. Bereits in den 2013 South African Behandlungsrichtlinien gibt es jetzt Empfehlung des GRT zum Zeitpunkt der Second-Line-Ausfall für Erwachsene und bei der ersten oder zweiten Linie PI-basierten Regime Ausfall für Kinder 30. Es hat sich gezeigt, dass die Einbeziehung in die Behandlungsrichtlinien GRT in Südafrika würde möglicherweise kostenneutral sein. In Anbetracht der Kosten der zweiten Zeile Therapie Medikamente, die relativ teurer als die erste Zeile Drogen sind, mit GRT um Patienten, die wirklich brauchen, um zu Zweitlinientherapie identifizieren schaltet werden nicht führen keine zusätzlichen Kosten für das Programm. Darüber hinaus können GRT auch andere Gründe für das Scheitern zu identifizieren, zu sparen Behandlungsmöglichkeiten und generieren Informationen zu neuen Resistenzmuster 31. Daher ist es notwendig, die Kosten der Arzneimittelresistenz Überwachungsmethoden noch weiter, um den Zugang, die Qualität der Versorgung zu verbessern eine Reduzierungd Ergebnisse. Hier präsentieren wir eine Methode entwickelt, um GRT generische (Open Source) Primer für Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Sequenzierung (Tabelle 1) sowie vor allem Open-Source-Software für die Medikamentenresistenz Interpretation zu verwenden. Für die klinische Management, wird das Protokoll durch eine umfassende Überprüfung und Berichterstattung Verfahren mit Fach Interpretation der Labor Resistenzen Bericht mit engen Einhaltung der nationalen Behandlungsrichtlinien ergänzt. Das Protokoll ist in vier Komponenten unterteilt: 1) HIV-Ribonukleinsäure (RNA)-Extraktion, 2) Reverse Transkription und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Amplifikation von viralen Targets 3) Sequenzierung und 4) Bioinformatics Verfahren zur Analyse von Chromatogrammen, Ausrichtung, Kuration und Interpretation der Sequenzdaten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Superscript III 1st strand Synthesis kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">18080051</td>
			<td style="width:265px;">Reverse Transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">SATURN/LiFE Technologies Custom Primers</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4473517</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Platinum Taq</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">10966026</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PureLink QUICK PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">K310002</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Viroseq</td>
			<td style="width:372px;">ABBOTT</td>
			<td style="width:119px;">4J94-20</td>
			<td>Reverse Transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Agarose Tablets (Dnase/Rnase free)</td>
			<td style="width:372px;">BIOLINE</td>
			<td style="width:119px;">BIO-41027</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">TBE Buffer</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">1.06177.2500</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">O&#39;Range Ruler 200bp DNA Ladder</td>
			<td style="width:372px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">FE SM0633</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Novel Juice</td>
			<td style="width:372px;">GeneDireX</td>
			<td style="width:119px;">LD001-1000&#160;</td>
			<td>PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">MiniBis Bioimaging System</td>
			<td style="width:372px;">DNR Bioimaging Systems Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Documentation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Power Pac 300&#160;</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Gel Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Big Dye Terminator Kit ver 3.1</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4337456</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Arrays</td>
			<td style="width:372px;">Life Technolgies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4319899</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">PoP</td>
			<td style="width:372px;">Life technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4363785</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">10 x EDTA Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">402824</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Formamide</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4311320</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">5 x Sequencing Buffer</td>
			<td style="width:372px;">Life Tecgnologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4336697</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3130 xl Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT/PCR/Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5804</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sample Processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5415D</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>PCR Product Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Centrifuge 5810</td>
			<td style="width:372px;">EPPENDORF</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Picofuge</td>
			<td style="width:372px;">BIORAD</td>
			<td style="width:119px;">C1301-230V</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex Genius 3</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reagent preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:372px;">IKA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">NanoDrop 2000 UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td style="width:372px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA quantification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">3M Sodium Acetate</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td align="right" style="width:119px;">567422</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Absolute Ethanol</td>
			<td style="width:372px;">MERCK</td>
			<td style="width:119px;">SAAR2233540LP</td>
			<td>Sequencing Clean up</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">1.5ml SARSTEDT Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.692.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml SARSTEDT&#160; Tubes</td>
			<td style="width:372px;">BIODEX</td>
			<td style="width:119px;">72.693.005</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">2ml Collection tubes</td>
			<td style="width:372px;">SCIENTIFIC GROUP</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-NC/S</td>
			<td>RNA Extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Optical MicroAmp 96 Well reaction plates</td>
			<td style="width:372px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">N8010560</td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul 8 Strip StarPCR Tubes with attached flat caps</td>
			<td style="width:372px;">STAR Lab - supplied by CELTIC</td>
			<td style="width:119px;">A1402-3700</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">200ul PCR individual tubes</td>
			<td style="width:372px;">Scientific Group</td>
			<td style="width:119px;">CR/3745</td>
			<td>RT and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Geneious&#160;</td>
			<td style="width:372px;">Biomatters</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Internet Access</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Preferrably high speed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;"></td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">Web resources</td>
			<td style="width:372px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">hivdb.stanford.edu</td>
			<td style="width:372px;">Stanford University</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Drug reistance analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za:8080/regadb-ui/RegaDB</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>database</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:372px;">http://bioafrica.mrc.ac.za/tools/pppweb.html</td>
			<td style="width:372px;">SATuRN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence quality tool</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an affordable hiv-1 drug resistance monitoring method for resource limited settings

HIV-1-Resistenzen hat das Potenzial, ernsthaft gefährden die Wirksamkeit und die Auswirkungen der antiretroviralen Therapie (ART). Wie ART-Programme in Afrika südlich der Sahara weiter ausbauen, sollten die Betroffenen auf ART eng für die Entstehung von Resistenzen überwacht werden. Überwachung der Arzneimittelresistenz übertragen, die Übertragung von Virusstämme bereits resistent gegen ART verfolgen ist ebenfalls kritisch. Leider ist Drogenresistenztests immer noch nicht in der Ressourcen begrenzte Einstellungen leicht zugänglich, weil die Genotypisierung ist teuer und erfordert anspruchsvolle Labor-und Datenmanagement-Infrastruktur. Ein offener Zugang genotypische Resistenzüberwachung Drogen Methode, um Personen zu verwalten und zu bewerten übertragen Resistenzen beschrieben. Das Verfahren nutzt kostenlose Open-Source-Software für die Auslegung des Arzneimittelresistenzmuster und die Erzeugung von individuellen Patientenberichte. Die Genotypisierung Protokoll weist eine Verstärkungsrate von mehr als 95% für die Plasmaproben mit avIRAL Last&gt; 1.000 HIV-1 RNA Kopien / ml. Die Empfindlichkeit nimmt deutlich für Viruslast &lt;1.000 HIV-1 RNA Kopien / ml. Das hier beschriebene Verfahren wurde gegen eine Methode der HIV-1-Resistenzen Prüfung durch den US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA), der ViroSeq Genotypisierungsmethode genehmigt validiert. Einschränkungen der hier beschriebenen Verfahren umfassen die Tatsache, daß es nicht automatisiert ist und daß es auch nicht zu den zirkulierenden rekombinanten Form CRF02_AG aus einer Gruppe von Validierungsproben verwendet, obwohl es verstärkt Subtypen A und B aus der gleichen Platte.

Die validierte Verfahren war eine Modifikation eines früher berichteten Verfahren 20. Die ViroSeq Genotypisierung Methode, die von der FDA zugelassen wurde, wurde als Referenzmethode in der Validierung. Ein Panel von Eignungsprüfungsproben aus den Französisch Nationalen Agenturen für Forschung über Aids und Hepatitis (ANRS) erhalten in der Primär Vergleich zwischen den beiden Methoden. Die beiden Genotypisierung Methoden waren bei der Identifizierung aller klinisch relevanten Arzneimittelresistenz-assoziierten Mutationen wie von der HIVDB Programm für die Proben, die erfolgreich von beiden Methoden verstärkt wurden interpretiert 100% übereinstimm. Wie in Tabelle 6 gezeigt, waren die Nukleotidsequenzen der drei Paare 99,5% identisch. Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen zu 100% identisch. Eine Probe von fünf nicht erfolgreich durch ViroSeq verstärkt werden. Neben der Probe nicht durch ViroSeq verstärkt, habe die Hausmethode, eine zweite Probe, die gezeigt wurde, verstärkenein umlauf rekombinanten Virus (CRF02_AG) durch ViroSeq sein. Die drei Proben, die mit beiden Methoden verstärkt waren Subtyp B (zwei Proben) und Subtyp A (eine Probe). <img alt="Figur 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig5.jpg" /> 5. Verwendung eines HKY Nachbar Joining Baum als Teil der Qualitätssicherung Reihenfolge getan. Es gibt vier Paare / Cluster-Sequenz mit sehr kurzen genetischen Distanzen. Der genetische Abstand zwischen RES655 und RES655_1 (gleiche Proben an verschiedenen Tagen sequenziert) beträgt 0,003. Das ist eine potenzielle Fehler mit dem RES637_1/RES638 Paar als ihre genetische Distanz ist zu kurz (0,075) für Proben aus verschiedenen epidemiologisch nicht verknüpften Personen. Es ist ein weiteres RES637 auf dem Baum mit einem Abstand von 0,075 im Vergleich zu RES638_1. Die CQ01/CQ02 Cluster nahe, dass die zwei Probenvon der Platte sind Duplikate der gleichen Probe. Sie Cluster zusammen mit dem Subtyp B Referenzsequenz Bestätigung der Subtyp von der REGA Subtypisierung Werkzeug zugeordnet. CQ05 und CQ04 mit Subtypen A und G jeweils gruppierten, während die REGA Subtypisierung Werkzeug klassifiziert sie als A und CRF02_AG sind. Ein weiteres nützliches Tool für die HIV-Subtypen und Rekombination SCUEL, die an http://www.datamonkey.org ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51242/51242fig5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.</a> Ein Panel von fünf Proben wurde verwendet, um die Genauigkeit der Hausmethode beurteilt. Zehn Wiederholungs Genotypen wurden für jede der fünf Proben erzeugt. Verwendung der Kapillare 16 3130xl Genetic Analyzer, 48 der 50 Genotypen von 24 Läufen erzeugt wird, am gleichen Tag hergestellt. Für alle fünf Proben wurden die vorhergesagten Aminosäuresequenzen zu 100% übereinstimm zwischen Wiederholungen. Für die Nukleinsäuresequenzen, there war&gt; 99% paarweise Ähnlichkeit. Während der ersten zwei Jahre der Anwendung dieses Verfahrens, sechzig Proben wurden zufällig aus RNA-Extraktion zur Sequenzierung wiederholt. Es gab keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen der Sequenz Qualitätsfaktor und der Anzahl der gemischten Basen zwischen den Wiederholungen. Sowohl die Nukleotid-und Aminosäurepaarweise Vergleiche der sechzig Paare waren mehr als 99% identisch ist. So waren die Arzneimittel-Resistenz-Mutationen für alle Paare 100% übereinstimm. Kostenreduzierung Die Reaktionsvolumina für RT-PCR und Sequenzierung wurden mindestens die Hälfte, bezogen auf das ursprüngliche Verfahren 20, 32 reduziert wird, ohne auf die Qualität der erzeugten Sequenzen. Dies ermöglichte eine Verringerung der Kosten von 50% für die RT-und PCR-Stufen. Die neue Methode wurde ursprünglich entwickelt, um mit sechs Sequenzierprimer Sequenz arbeiten<html> Alle 99 Codons des Protease-Gens und die ersten 300 Kodons des Reverse-Transkriptase-Gen 20, 32. Ähnliche Verfahren auch sechs bis acht Primer 33, 34. Einige kürzlich veröffentlichten Methoden sind weniger als sechs Primer verwendet, wenn auch manchmal die Sequenzierung der Protease-und RT-Gene seprately 35, 36. Wir versuchten, die Anzahl von Sequenzierungsprimer von sechs auf vier zu reduzieren (Fig. 6) <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51242/51242fig6.jpg" /> 6. Vergleich von aufeinanderfolgenden Sequenzen von sechs vs vier Sequenzierungsprimer für die Erzeugung des 1197 bp pol-Sequenz, die alle 99 HIV-1-Protease-Codons und die ersten 300 Kodons des Reverse-Transkriptase-Gens.242/51242fig6highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. Sequenzen aus einem Satz von 17 Proben von sechs Primern erzeugt wurden, Sequenzen nach dem Ausschluss von zwei Primern (MAW46 und RTY) erzeugt, verglichen. Die Subtypen waren 14 Subtyp C, zwei Subtyp B und einen Subtyp A. Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Sequenz Qualitätswerte. Auch die durchschnittliche paarweise Identität zwischen den 17 Paaren von Nukleinsäure betrug 99% und 100% auf der Aminosäureebene. Daher ist die Verringerung der Sequenzierprimer von sechs auf vier zu einer Reduktion in der Sequenzierungskosten um fast ein Drittel. Das einzige, proprietäre Software-Tool in diesem Protokoll verwendet wurde, war für Geneious Sequenz Montage. Die Medikamentenresistenz Interpretationswerkzeuge, sowie der Bericht Erzeugung Tools sind alle kostenlos, Open-Access-Tools. Dies verringert die Kosten durch den Wegfall der Kosten, die mit der Verwendung proprietärer Software verbunden. Ferner collectivE Verhandlungen erlaubt die Reagenzien für dieses Protokoll in einem Kit für den einfachen Zugriff von Life Technologies verpackt werden und ist als Saturn / Life Technologies Genotypisierung Verfahren 37 zur Verfügung. Darüber hinaus können Mitglieder Saturn die Reagenzien zu einem vergünstigten Preis zu gelangen. Klinische Einstellung Das beschriebene Protokoll wurde in der Kontrolle und Überwachung der Medikamentenresistenz in einer ländlichen Gemeinde in der Provinz KwaZulu-Natal umgesetzt. Insgesamt 604 Genotypen wurden aus klinischen Proben zwischen Dezember 2010 und Mai 2013 bei einer Verstärkung von 95% für Proben mit Viruslast&gt; 1.000 RNA Kopien / ml erzeugt. Diese klinische HIV-Arzneimittelresistenz Studie wurde von der Ethikkommission Biomedical Research der Universität von KwaZulu-Natal (Ref. BF052/10) und des Gesundheitsforschungsausschuss der KwaZulu-Natal-Abteilung der Gesundheit (vgl. HRKM 176/10) zugelassen. Individuelle Patientenberichte wurden erzeugt und zurück zu den Kliniken geschicktzum Patientenmanagement. Siebzig zwei (72) Genotypen wurden auch als Teil eines Überwachungs der übertragenen Resistenzen Studie erzeugt, innerhalb einer großen prospektiven populationsbasierten Studie HIV-Überwachung verschachtelt. Die primären Proben waren Nadelstich Vollblut in EDTA-Röhrchen gesammelt. Bei Genotypisierung gab es eine Verstärkungsrate von 79% 19. Ethik-Zulassung für die Genotypisierung von Proben aus der Surveillance-Studie wurde von der Universität von KwaZulu-Natal Biomedical Research Ethics Committee (siehe BE066107) erhalten. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Primer Namen </td><td> Folge </td><td> Länge </td><td> Richtung </td><td> HXB2 Position </td><td></td></tr><tr><td> MAW-26 </td><td> TTGGAAATGTGGAAA GGAAGGAC </td><td> 23 </td><td> Vorwärts </td><td> 2028-2050 </td><td> Ersten PCR-Runde </td></tr><tr><td> RT-21 </td><td> CTGTATTTCAGCTATC AAGTCCTTTGATGGG </td><td> 31 </td><td> Umge </td><td> 3539-3509 </td><td> Ersten PCR-Runde </td></tr><tr><td> Pro-1 </td><td> TAGAGCCAACAGCCC cacca </td><td> 20 </td><td> Vorwärts </td><td> 2147-2166 </td><td> 2. Runde PCR </td></tr><tr><td> RT-20 </td><td> CTGCCAATTCTAATTC TGCTTC </td><td> 22 </td><td> Umge </td><td> 3462-3441 </td><td> 2. Runde PCR </td></tr><tr><td> RTC1F </td><td> ACCTACACCTGTCAA CATAATTG </td><td> 23 </td><td> Vorwärts </td><td> 2486-2508 </td><td> Die Sequenzierung </td></tr><tr><td> RTC2R </td><td> TGTCAATGGCCATTG TTTAACCTTTGG </td><td> 27 </td><td> Umge </td><td> 2630-2604 </td><td> Die Sequenzierung </td></tr><tr><td> RTC3F </td><td> CACCAGGGATTAGAT ATCAATATAATGTGC </td><td> 30 </td><td> Vorwärts </td><td> 2956-2994 </td><td> Die Sequenzierung </td></tr><tr><td> RTC4R </td><td> CTAAATCAGATCCTAC ATACAAGTCATCC </td><td> 29 </td><td> Umge </td><td> 3129-3101 </td><td> Die Sequenzierung </td></tr><tr><td> RT-y </td><td> GTGTCTCATTGTTTAT ACTAGG </td><td> 22 </td><td> Umge </td><td> 2967-2946 </td><td> Die Sequenzierung </td></tr><tr><td> MAW-46 </td><td> TCCCTCAGATCACTC TTTGGCAACGAC </td><td> 27 </td><td> Vorwärts </td><td> 2251-2277 </td><td> Die Sequenzierung </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Reverse Transkription, PCR und Sequenzierung individuelle Primer bei der Erzeugung eines 1197 bp pol-Fragment, das alle 99 HIV-1-Protease-Codons und die ersten 300 Kodons des Rückwärts trascriptase Gens verwendet. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> RT21 (5pmol/ml) </td><td> 0,5 </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mM) </td><td> 0,5 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 1 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2. dNTP / Primer mischen für die reverse Transkription Reaktion. <table border= &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; Cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volumen (ml) / Reaktion </td><td> Konzentration / Reaktion </td></tr><tr><td> First Strand Buffer (10x) </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT (0,1 M) </td><td> 1 </td><td> 0,008 </td></tr><tr><td> RNaseOUT (40 U / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Superscript Reverse Transcriptase III (200U/ml) </td><td> 0,5 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 5 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Enzym-Mix für die reverse Transkription Reaktion. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volumen (ml) / Reaktion </td><td> Endgültige Konzentration / Reaktion </td></tr><tr><td> DEPC behandeltem Wasser </td><td> 18,4 </td><td> - &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> PCR-Puffer (10x) </td><td> 2.5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (50 mM) </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> dNTP-Mix (10 mM) </td><td> 0,5 </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> Froward Primer (5 pmol / ml) </td><td> 0,25 </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> Rückwärts-Primer (5 pmol / ml) </td><td> 0,25 </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> Platinum Taq-Polymerase (5 U / ml) </td><td> 0,1 </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> Zwischensumme </td><td> 23 </td><td> - </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. Master-Mix für die verschachtelte PCR. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volumen (ml) / Reaktion </td><td> Konzentration / Reaktion </td></tr><tr><td> DEPC behandeltem Wasser </td><td> 6.1 </td><td></td></tr><tr><td> Sequenzierungspuffer (5x) </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Primer (3,2 pmol / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 0,16 </td></tr><tr><td> Big Dye Terminator Sequencing-Mix </td><td> 0,4 </td><td> - </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 9 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 5. Mastermix für den Sequenzierungsreaktionen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td align="center" colspan="4"> ViroSeq </td><td align="center" colspan="4"> Sonstige Innen </td><td rowspan="2"> NA% Ähnlichkeit </td></tr><tr><td> Proben-ID </td><td> Unterart </td><td> Quality Score </td><td> PR-Mutationen </td><td> RT-Mutationen </td><td> Unterart </td><td> Quality Score </td><td> PR-Mutationen </td><td> RT Mutationen </td></tr><tr><td> CQ01 </td><td> B </td><td> 99,9 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99,2 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ02 </td><td> B </td><td> 99,5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> B </td><td> 99,5 </td><td> M46L, I54L, V82A, L90M </td><td> D67N, T69D, K70R, M184V, T215V, K219Q </td><td> 100 </td></tr><tr><td> CQ03 </td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td></td><td> NA </td><td> NA </td><td></td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ04 </td><td> CRF02_AG </td><td> 98,4 </td><td> I54V, V82F, I84V </td><td> M41L, L74I, L210W, T215Y, V108I, Y181C </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td><td> NA </td></tr><tr><td> CQ05 </td><td> A </td><td> 99,7 </td><td></td><td> K103N </td><td> A </td><td> 93 </td><td></td><td> K103N </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Tabelle 6. Vergleichende Results von einer parallelen Analyse zwischen dem ViroSeq Genotypisierung Methode und der Hausmethode unter Verwendung einer Reihe von Proben durch die ANRS Verfügung gestellt.

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An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

Arzneimittelresistenz Tests für HIV-1-infizierten Personen in Ermangelung einer antiretroviralen Therapie (ART) können zukünftige Therapien führen und die Behandlungsergebnisse zu verbessern. Optimierung der individuellen und der Gesundheit der Bevölkerung Ergebnisse in hoher HIV-Prävalenz, aber mit beschränkten Ressourcen wird letztlich erfordern erschwinglich und zugänglich Resistenzen Genotypisierung und Interpretationsmethoden.

Eine erschwingliche HIV-1 Drug Resistance Überwachungsmethode für Ressourcen Begrenzte Einstellungen

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

18.4K Aufrufe.  University of KwaZulu-Natal, Durban, South Africa.  Arzneimittelresistenz Tests für HIV-1-infizierten Personen in Ermangelung einer antiretroviralen Therapie (ART) können zukünftige Therapien führen und die Behandlungsergebnisse zu verbessern. Optimierung der individuellen und der Gesundheit der Bevölkerung Ergebnisse in hoher HIV-Prävalenz, aber mit beschränkten Ressourcen wird letztlich erfordern erschwinglich und zugänglich Resistenzen Genotypisierung und Interpretationsmethoden. 

Serie: An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Verfahren zur Novel Anti-Cancer Drug Development mit Tumor Explantate von chirurgischen Proben


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Forschung

Medizin

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Ein orthotopen Mausmodell der menschlichen Prostatakrebs-Metastasen

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Techniken für die Verarbeitung Augen mit einer Netzhautprothese für Implantierte Lokalisierte histopathologische Analyse: Teil 2 Epiretinale Implantate mit Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

Encapsulation Thermogenic Präadipozyten für die Transplantation in Fettgewebe Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

Implementierung von<em&gt; In-vitro-</em&gt; Drug Resistance Assays: Maximierung des Potenzials für die Aufdeckung klinisch relevanter Resistenzmechanismen

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Bioluminescence-Based Tumor Quantification Method for Monitoring Tumor Progression and Treatment Effects in Mouse Lymphoma Models

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Bioluminescence imaging is a well-known tool for localizing tumors and metastases, but quantification of these images often requires complex calculations and particular instruments. We describe the easy-to-use luminoscore method, based on precise acquisition conditions, requiring no calculations, and enabling tumor burden and treatment response to be monitored in mouse models.

Biolumineszenz-basierte Tumor Quantifizierung Verfahren zur Überwachung Tumorprogression und Therapieeffekte bei den Maus-Lymphom-Modelle

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

Ein verbessertes Verfahren zur schnellen Intubation der Luftröhre in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, pancreatitis, and pancreatic cancer. All three of these diseases mark active areas of study, not only to develop immediate therapy, but also to better understand their pathophysiology. There are few tools to further these areas of study. Pancreatic duct infusion is an important technique that can allow for lineage tracing, gene introduction, and cell line-specific targeting. The technique requires the intricate dissection of the second portion of the duodenum and ampulla, followed by the occlusion of the bile duct and the cannulation of the pancreatic duct. Although the technique is technically challenging at first, the applications are myriad. Ambiguity in the specifics of the procedure between groups highlighted the need for a standard protocol. This work describes the expression of a green fluorescent protein (GFP) within the pancreas after the pancreatic duct infusion of a viral vector expressing GFP versus a sham surgery. The infusion and therefore expression is specific to the pancreas, without expression present in any other tissue type.

Pancreatic duct infusion is an important technique that can allow for lineage tracing, gene introduction, and cell line-specific targeting. A pancreatic duct infusion technique for drug and viral delivery to pancreatic cells is presented here.

Pankreasgang-Infusion: Eine effektive und selektive Methode der Medikamenten- und Virusabgabe

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Optimierte LC-MS/MS-Methode für die Hochdurchsatz-Analyse der klinischen Proben von Ivacaftor, seinen Hauptmetaboliten und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten von Mukoviszidose-Patienten

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...