Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, in vitro die Auswirkungen von Latenz-Umkehrmitteln auf die HIV-mRNA-Verarbeitung zu bewerten. Das Protokoll bietet eine einfache effiziente und zuverlässige Methode zur Bewertung, gleichzeitig die Wirkung von LRA auf HIV-Transkription und Spleißen. Diese Technik gab einen Einblick in die Fähigkeit von LRAs, Virusreaktivierung und Clearance des latenten Reservoirs zu induzieren.
Nach dem Anbau von Zellen 20.000 davon in 100 Mikroliter DMEM-Medium, ergänzt mit 10%FBS, und ohne Antibiotika in den Brunnen einer 96-Well-Flachbodenplatte für 24 Stunden. Am nächsten Tag verdünnen Sie das Dual-Color-Reporter-Konstrukt. Tat und Rev DNA in 50 Mikroliter Serum freies Medium, und mischen Sie sanft.
Mischen Sie das Lipidreagenz vorsichtig und verdünnen Sie dann 0,65 Mikroliter davon pro Reaktion in 50 Mikroliter Serumfreies Medium. Mischen Sie sanft, und inkubieren bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Kombinieren Sie das verdünnte Lipidreagenz mit der verdünnten DNA und mischen Sie es sanft.
20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann geben Sie 100 Mikroliter dieses Lipid-Reagenz-DNA-Komplexes weise auf die Zellen in jedem Brunnen. Schaukeln Sie die Platte sanft hin und her, um zu mischen.
Und inkubieren Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator, bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für fünf Stunden. Danach transfezieren Sie zusätzliche Brunnen mit 100 Nanogramm CMV-gesteuertem EGFP und DsRed exprimieren DNA-Plasmid zu Kompensationszwecken. Um zu beginnen, verdünnen Sie jeden Latenz-Umkehrmittel auf den entsprechenden Arbeitszustand mit Wachstumsmedium.
Mit einem Mehrkanal-Rohrkopf, saugen Sie das Transfektionsmedium sorgfältig an und ersetzen Sie es durch 100 Mikroliter Medium, das das entsprechende Latenzumkehrmittel enthält. Inkubieren Sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37%celsius mit 5% Kohlendioxid für 48 Stunden. Um mit der Färbung der Zellen zu beginnen, verwenden Sie einen Mehrkanal-Rohrkopf, um jedem Brunnen 100 Mikroliter PBS hinzuzufügen.
Sanft Rohr Kopf nach oben und unten etwa fünf Mal. Dabei achten Sie darauf, das Aufschäumen zu vermeiden, um die Zellen in die Medien zu lösen. Als nächstes übertragen Sie die Zellen in die Brunnen einer 96-Well-V-Bodenplatte.
Zentrifuge bei 500-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Saugen Sie das Medium und PBS, ohne die Zellen zu berühren. Waschen Sie die Zellen mindestens einmal mit 200 Mikroliter Protein und serumfreiem PBS.
Zentrifuge bei 500-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Neigen Sie die Platte, um den Überstand zu entsorgen, und entfernen Sie den Waschpuffer, ohne die Zellen zu berühren. Nach dieser Verdünnung des festen Lebensfähigkeitsfarbstoffs in protein- und serumfreien PBS im Verhältnis 1 bis 1000, um eine arbeitsrechtliche Lösung vorzubereiten.
Fügen Sie 50 Mikroliter des verdünnten Farbstoffs zu jedem Brunnen hinzu, und Pfeifenkopf nach oben und unten, um sie zu mischen. Bei vier Grad Celsius inkubieren. Während sie 10 bis 15 Minuten mit Folie vor Licht geschützt sind.
Dann waschen Sie die Zellen ein- oder zweimal mit 150 Mikroliter Waschpuffer. Danach zentrifugieren Sie bei 500-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius für fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Um die Zellen zu fixieren, fügen Sie 100 Mikroliter frisch zubereitetes 1%Formaldehyd und Waschpuffer hinzu.
Und bei vier Grad Celsius inkubieren, während sie 10 bis 15 Minuten vor Licht geschützt sind. Danach die Zellen ein- oder zweimal mit 100 Mikroliter Waschpuffer waschen. Zentrifuge bei 500-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 70 Mikroliter Waschpuffer wieder auf. Nach der Überprüfung der Cytometer-Einstellungen Leistung und Empfindlichkeit durch Ausführen von Kalibrierperlen, stellen Sie die vorwärts und seite Streuspannungen mit unbefleckten Probe, so dass die Hauptpopulation auf dem Bildschirm und deutlich erkennbar ist. Führen Sie eine manuelle oder automatische Kompensation durch verwendung der einzelnen gebeizten Proben durch, um eine minimale Überleitung der EGFP-positiven Population in den DsRed-Detektor zu gewährleisten und umgekehrt.
Erstellen Sie mit der Fluoreszenz minus ein Steuerelement Plots und setzen Sie die Tore. Passen Sie als Nächstes die vorwärts- und seitlichen Streuspannungen mit unbefleckter Probe an, so dass die Hauptpopulation auf dem Bildschirm ist und deutlich erkennbar ist. Erfassen und zeichnen Sie mindestens 10.000 lebensfähige Zellereignisse pro Probe auf.
Verwenden Sie anschließend die Software zur Datenanalyse der Durchflusszytometrie, um die im Textprotokoll beschriebenen Daten zu analysieren. Repräsentative Ergebnisse für die Expression von HIV-1, ungeliced und spleißten Produkten, nach der Behandlung mit dem Bromodomain-Hemmer JQ1, zeigen, dass sowohl JQ1 positiv als auch Tat den Anteil der Zellen, die EGFP exzieren, signifikant erhöhen. Was auf unangekte Transkripte hindeutet.
JQ1 positiv wird auch gesehen, um den Prozentsatz der Zellen, die DsRed exemitzen. Und erhöhen Sie den Anteil der gespleißten Produkte auf ein ähnliches Niveau wie Tat. Dies bestätigt die Fähigkeit von JQ1 positiv, DIE HIV-Transkription und das Spleißen zu aktivieren.
Die Behandlung mit einer Stereoisomersteuerung JQ1 negativ, beseitigt jedoch die JQ1 positive Wirkung auf HIV-Transkription und Spleißen. Einmal gemeistert, kann diese Methode mit Medikamenten einzeln oder in Kombination durchgeführt werden. Testen sie auf ihre Fähigkeit, effizient zu synergisieren.
Was zu einer niedrigeren Dosis des Medikaments und Toxizität führen würde. Nach jeder Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Erprobung effizienter Arzneimittelkombinationen in primären Latenzmodellen in Ex-vivo-Patientenproben.
