DNA-Biochips sind eine attraktive Forschungsplattform für die selbstresynthetische Biologie, die ursprünglich von der BASF-Gruppe entwickelt wurde und den Betrieb von In-vitro-Genkreisläufen über einen längeren Zeitraum ermöglicht. Mit diesem Protokoll hoffen wir, diese Technologie einer breiteren Palette von Forschern zur Verfügung zu stellen. Unsere Methode, die als bephore Lithographie bezeichnet wird, stellt eine Strategie zur Immobilisierung der DNA dar, die auf der DNA-Strangverschiebungsreaktion basiert.
Die Stärke dieser Technik liegt in ihren mehrstufigen lithographischen Fähigkeiten, ihrer einfachen Reproduzierbarkeit und der kommerziellen Verfügbarkeit aller Komponenten. Ähnlich wie bei anderen Biochip-Lösungen kann bephore mit verschiedenen Technologien kombiniert werden. Zum Beispiel können funktionelle Genbürsten in Mikrokompartimenten zur Proteinexpression zusammengesetzt werden.
Zunächst bereiten Sie eine RCA-Mischung vor, indem Sie fünf Teile Wasser mit einem Teil einer 30%ammoniak Lösung in einem Glasbecher mischen. Erhitzen Sie die Mischung auf 70 Grad Celsius auf einer heißen Platte unter Rühren. Sobald es 70 Grad Celsius erreicht, fügen Sie einen Teil 30% Wasserstoffperoxid.
Legen Sie dann einen Siliziumwafer mit einem Durchmesser von 100 Millimetern in die Lösung, um organisches Material und Partikel daraus zu entfernen. Nach 30 Minuten das Substrat herausnehmen, gründlich mit Wasser aus einer Waschflasche abspülen und mit einer Stickstoffpistole trocknen. Gehen Sie sofort mit der PEGylation des Substrats fort.
Um dies zu erreichen, zuerst biotin-PEG-Silane in trockenem Toluen auf 5 Milligramm pro Milliliter verdünnen, und Wirbel die Lösung, bis es gut gemischt ist. Mit dem Substrat in einem Glas Petrischale platziert, langsam Pipette die Lösung auf das Substrat, die gesamte Oberfläche abdecken, aber vermeiden Sie, dass die Lösung über die Kante fließen. Sobald die Oberfläche bedeckt ist, schließen Sie die Petrischale, und fügen Sie dann eine zusätzliche Abdeckung hinzu.
Nach 30 Minuten die Abdeckung entfernen und etwa 40 Milliliter Isopropylalkohol in die Petrischale geben. Dann nehmen Sie das Substrat heraus, spülen Sie es wieder gründlich mit Isopropylalkohol ab und trocknen Sie es mit einer Stickstoffpistole. Wenn Sie trocknen, lagern Sie das Substrat im Dunkeln, bis es benötigt wird.
Bereiten Sie ein Substrat vor, indem Sie einen Glasschneider oder ein Skalpell verwenden, um einen Zentimeter mal einen Zentimeter Stücke zu bilden. Fügen Sie dann eine einfache Ausrichtungsmarkierung hinzu, indem Sie einen kurzen Kratzer von der Mitte in Richtung einer Kante des Substrats machen. Blasen Sie alle kleinen Partikel vom Chip mit einer Stickstoffpistole.
Als nächstes mischen Sie zwei Tröpfchen eines Zweikomponenten-Silikonklebers, und tragen Sie den Kleber auf die Oberfläche des Chips auf, so dass der Bereich um die Spitze des Kratzers leer bleibt. Dort sorgt der Kleber für eine hydrophobe Barriere, die wässrige Lösungen auf dem Chip hält. Dies erleichtert nachfolgende Waschschritte und reduziert die Menge an DNA, die für Inkubationen benötigt wird.
In einem späteren Schritt kann der Kleber leicht abgeschält werden. In den folgenden Schritten wird photokleavable DNA nur in einer gelben Lichtumgebung behandelt. Bedecken Sie den Chip mit ca. 10 Mikrolitern einer Bephore-Mischung bei Raumtemperatur, und legen Sie den Chip in eine Box, die teilweise mit Wasser gefüllt ist, um die Verdunstung zu reduzieren.
Waschen Sie den Chip nach einer Stunde mehrmals mit PBS, um alle ungebundenen Bephore-Mix zu entfernen. Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter der Passivierungsmischung zum Chip hinzu. Waschen Sie den Chip nach zwei Stunden mehrmals mit PBS, um die ungebundenen Passivierungsmittel zu entfernen.
Schneiden Sie eine gedruckte Fotomaske auf die entsprechende Größe, um einen geeigneten Maskenhalter zu passen. Legen Sie es an der Position des Feldstopps ein, und verwenden Sie die Ausrichtungsmarkierungen, um die Maske im Halter auszurichten. Wenn das Substrat auf der Mikroskopie-Bühne platziert ist, legen Sie einen roten Filter in den Beleuchtungspfad ein und konzentrieren Sie sich auf die Substratoberfläche.
Navigieren Sie dann zum Bereich des Substrats, der freigelegt wird. Als Nächstes legen Sie den Maskenhalter ein, blockieren die Beleuchtung, und wechseln Sie zum UV-Filter. Öffnen Sie bei geringer Lichtintensität den Verschluss, und verwenden Sie die Kamera, um die Maske schnell auf das Substrat zu fokussieren.
Wenn das Substrat nun ausgerichtet ist und die Maske im Fokus steht, blockieren Sie den Lichtpfad zur Kamera und beleuchten Sie das Substrat mit hoher Lichtintensität für die gewünschte Belichtungszeit. Nach der Exposition entfernen Sie die Probe aus dem Mikroskop und entfernen Sie vorsichtig so viel Puffer wie möglich aus dem Substrat, ohne es zu trocknen. Fügen Sie dann 10 bis 20 Mikroliter DNA mit der Sequenz zur Befestigung an der Oberfläche hinzu.
Legen Sie das Substrat in eine nasse Box, um es vor dem Trocknen zu bewahren, und brüten Sie die DNA für zwei Stunden bei Raumtemperatur auf dem Substrat. Um die kompartummierte Genexpression auf einem invertierten Mikroskop zu beobachten, bereiten Sie zunächst die beiden Teile des Probenhalters getrennt vor. Beginnen Sie mit dem Kleben eines Bephore-Chips mit einer immobilisierten Genbürste auf den Chiphalter mit doppelseitigem Klebeband.
Als nächstes fügen Sie etwas Vakuumfett um das zentrale Loch des unteren Teils des Halters, und legen Sie den Spanhalter. Montieren Sie nun den oberen Teil des Halters. Schneiden Sie einen dünnen PDMS-Chip mit so kleinen Fächern wie möglich, so dass ein Kanal zur Seite offen bleibt, um später den Austausch von Abfällen und Vorläufermolekülen durch Diffusion zu ermöglichen.
Platzieren Sie den PDMS-Chip unmittelbar nach der Behandlung in der Mitte des Glasschlittens, wobei die Fächer nach oben zeigen. Dann backen Sie das Glas mit dem PDMS für eine Stunde bei 70 Grad Celsius. Kurz vor der Montage des gesamten Probenhalters den Glasschlitten wie bisher mit dem PDMS-Chip zu behandeln.
Fügen Sie dann etwas Vakuumfett um das große Loch des oberen Halters hinzu und legen Sie den Glasschlitten mit dem PDMS darauf. Drücken Sie das Glas vorsichtig auf das Fett. Entfernen Sie den Puffer vorsichtig vom Chip und waschen Sie ihn einmal mit 10 Mikrolitern Selbstausdruckssystem.
Als nächstes fügen Sie 60 Mikroliter Selbstausdruckssystem auf den Chip, und entfernen Sie den Zweikomponenten-Silikonkleber von den Rändern. Fügen Sie nun 20 Mikroliter des Expressionssystems auf das PDMS ein. Nachdem Sie das Tröpfchen auf das PDMS legen, überprüfen Sie schnell im stereoskopischen Mikroskop, ob die Fächer gut nass und ohne Luftblasen sind.
Wenn es Luftblasen gibt, versuchen Sie, sie wegzuwaschen. Um die beiden Teile des Halters zu montieren, und um Kammern und DNA-Pinsel auszurichten, arbeiten Sie unter einem stereoskopischen Mikroskop. Immobilisieren Sie den unteren Halter mit einem Greifarm, so dass die beiden Schrauben und Flügelmuttern mit beiden Händen leicht zugänglich sind.
Setzen Sie den oberen Halter in den unteren Halter ein, und senken Sie ihn, bis die Tröpfchen des Zellfreien Ausdrucks systems verschmelzen. Überprüfen Sie dann, ob sich die Fächer und die Ausrichtungsmarkierung in einem ähnlichen Bereich in der XY-Ebene befinden. Von unten die Wingnuts verschrauben, bis sie die Unterseite des Halters berühren.
Ziehen Sie beim Ausrichten der Fächer und des Chips in der XY-Ebene die Wingnuts vorsichtig fest. Dieser Schritt erfordert einige Erfahrung und hängt von der Konstruktion des Probenhalters ab. Das PDMS sollte nur mit sanfter Kraft auf den Chip gedrückt werden.
Als nächstes einen Schwamm in das Anti-Verdunstungsgehäuse mit Wasser sprühen und den Halter in die Box einlegen. Dann füllen Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze mit Zweikomponenten-Silikonkleber, und verwenden Sie es, um die Box zu versiegeln. Übertragen Sie schließlich die Box an ein temperaturgesteuertes Mikroskop und stellen Sie die DNA-Pinsel und die Reaktion mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie ab.
Ein zweistufiger lithographischer Prozess, der hier auf einer bephore Glasrutsche durchgeführt wird, ergibt sich überlappende Muster fluoreszierend markierter DNA-Stränge. Bei dieser Demonstration der On-Chip-Genexpression wird die DNA in der Kammer auf der linken Seite immobilisiert. Wenn das gelbe fluoreszierende Protein YPet dem Expressionsmix ausgesetzt ist, wird es aus der immobilisierten DNA synthetisiert.
Um die Aktivität des Genexpressionssystems zu bewerten, wird die Wiederherstellung der Fluoreszenz nach einem Bleichschritt beobachtet. Nach zwei Stunden erholte sich die Fluoreszenzintensität schnell. Nach vier und sechs Stunden erholte sie sich jedoch nicht, was darauf hindeutet, dass die Reaktion ohne eine neue Zufuhr des Ausdrucksmixes um Stunde vier endete.
Obwohl die Genexpression in einem geschlossenen System begrenzt ist, kann sie über längere Zeiträume aufrechterhalten werden, indem die Expressionskompartimente über Mikrofluidik mit zusätzlichen Vorläufermolekülen versorgt werden. Die Bephore-Methode wird verwendet, um Oligonukleotide oder Genlängen-DNA zu immobilisieren, die angewendet werden können, um Systeme interagierender DNA-Pinsel für die Selbst-Re-Gen-Expression zu konstruieren. Die Technik kann auch für andere Anwendungen in der Biophysik verwendet werden, wie z. B. Fluoreszenzstudien mit Einzelmolekülen.
Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie in der Lage sein, Bephore-Biochips aus Wafern oder Glasdias herzustellen und in Ihre Forschungsprojekte zu integrieren.
