Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse R01 CA107469, R01 CA125577 und U01CA154224 CG Kleer, der University of Michigan Cancer Center Support unterstützt.

1. Herstellung von Materialien und Kultur Medien <ol><li> Tauwetter Wachstumsfaktor reduziert (GFR) Matrigel bei 4 ° CO / N. </li><li> Warm up für komplette Medien erforderlich Zelllinie bei 37 ° C MCF10A-ATCC angegebenen Medien; Die HME-Ham F-12-Medium, ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum, 1 ug / ml Hydrocortison, 5 ug / ml Insulin, 10 ng / ml epidermalen Wachstumsfaktor, und 100 ng / ml Cholera-Toxin; Die SUM149-Ham F-12 Medium mit 5% FBS, 2 &amp;mgr; g / ml Hydrocortison und 5 ug / ml Insulin; und MDA-MB-231-10% haben FBS-DMEM </li><li> Vorkühlung eine 8-Well-Kammer-Folie auf Eis. </li><li> Bereiten Gewebekultur Kapuze und Zubehör. </li></ol> 2. Dreidimensional Kultur in 8-Well Chamber Slide <ol><li> Mantel jedes Well der 8-Well-Objektträger mit 40 ul GFR Matrigel. Fügen Sie den Matrigel in der Mitte der Folie und dann verteilt mit einem P200 Pipettenspitze. Versuchen Sie, so gleichmäßig wie möglich zu verbreiten, die Vermeidung von Blasen und Überspreizung, die dazu führen könnenMeniskusbildung. </li><li> Die Objektträger bei 37 ° C unter 5% CO 2. Während die Matrigel verfestigt, trypsinize die Zellen, sammeln und Spin bei 150 xg in Gewebekulturzentrifuge für 4 min. </li><li> Zählen Sie die Zellen und mit Wasser auf 12.500 Zellen / ml in kompletten Medien der jeweiligen Zelllinie. In GFR Matrigel bis 2%, und fügen Sie 400 ul in jede Vertiefung einer Matrigel schwemmt Kammer Rutsche. </li><li> Inkubieren Sie die Folien in der CO 2-Inkubator. Geben frisch komplette Medien ändert sich jeden 4. Tag bis 15 Tage. </li><li> Behandlung mit pharmakologischen Inhibitoren: Bei Inhibitorstudien hinzuzufügen Kleinmolekül-Inhibitoren der vollständigen Medien zum Zeitpunkt der Beschichtung, gefolgt von frischem Medium wechselt mit den Inhibitoren ergänzt alle drei Tage während der Anzucht der Zellen auf Matrigel GFR. </li><li> Behandlung mit gereinigtem Protein: <ol><li> Platte die Zellen folgende Schritte 2.1-2.3. Ermöglichen, dass die Kulturen für 4 Tage, gefolgt von Serum wachsen starvatiauf 16 Stunden. </li><li> Am Tag 5, behandeln Sie die Zellen mit entsprechenden Konzentration von gereinigten Protein in 0,1% FBS Medien, um den Serumversorgten Zellen. Geben frisch Medienwechsel mit gereinigtem Protein nach 2 Tagen. </li><li> Am Tag 10 ersetzen den konditionierten Medien mit kompletter HME Medien. Lassen Sie die Kulturen für weitere 5 Tage wachsen. </li></ol></li><li> Immunfluoreszenzfärbung von auf Matrigel gewachsen acinar Strukturen: <ol><li> Herstellung von 2% Paraformaldehyd, 0,5% Triton X-100 und 100 mM Glycin in 1 × PBS, pH 7,4. Vorbereitung Immunpuffer (IF-Puffer), der aus 1x PBS, enthaltend 0,1% aufweist Rinderserumalbumin, 0,2% Triton X-100, 0,05% Tween-20. </li><li> Verwenden Sie ein P200 Pipettenspitze sorgfältig absaugen konditionierten Medien. </li><li> Befestigen Sie die acinar Strukturen mit 2% frisch zubereitet Para bei Raumtemperatur (RT) für 20 min. </li><li> Permeabilisierung der Zellen mit 0,5% Triton X-100 für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Kulturs dreimal mit 100 mM Glycin, 10-15 Minuten für jede Waschung. </li><li> Blockieren der Zellen mit 10% Ziegenserum in IF-Puffer, genannt Primärblock, für 1 h bei RT. </li><li> Die Kulturen mit 20 &amp;mgr; g / ml Ziege-anti-Maus F (ab &#39;) 2-Fragment in der Grundblock-Puffer für 30 min inkubieren. Dieser Schritt ist wichtig, um die Maus-IgG immunreaktive Spezies in dem Matrigel blockieren. </li><li> Inkubieren mit primärem Antikörper in der zweiten Blockierlösung (Primärblock +20 ug / ml Ziege-anti-Maus F (ab &#39;) 2-Fragment) O / N bei 4 ° C. </li><li> Dreimal für jeweils unter leichtem Schütteln 10-15 min mit IF-Puffer waschen. </li><li> Inkubation mit fluoreszierenden konjugierten Sekundärantikörper in IF-Puffer für 45 min. </li><li> Wash 3x für jeweils 10 Minuten mit IF-Puffer unter leichtem Schütteln. </li><li> Montieren Sie die Folien mit Anti-Fade Reagenz, das DAPI, um die Kerne zu visualisieren. </li><li> Lassen Sie die Folien in O / N bei RT trocknen. </li><li> Bildaufnahme: Erfassung von konfokalen Bildern in der Kolonie midsection von Zellen auf Matrigel gewachsen. Für weitere Informationen zu erwerben eine Reihe von optischen Abschnitten über die gesamte Länge der Azinus-Struktur durch Z Stapeln. </li></ol></li></ol> 3. Dreidimensional Kultur in 2-Kammer und Objektträger für Immunoblotting <ol><li> Vorkühlung eine 2-Kammer und Schlitten auf Eis. Befolgen Sie die Schritte 2.1-2.4 Aufstockung der Reagenzien für die 2-Kammer auch Dia zB Mantel mit 160 ul Matrigel und fügen Sie 1,6 ml Zell / Matrigel mischen, um jede Vertiefung der 2-und Rutsche. </li><li> Ernten Sie die acinar Strukturen aus dem Matrigel Verwendung des kommerziell erhältlichen 3D-Kultur der Zellernte Kit folgenden Anweisungen des Herstellers. </li><li> Verdünne die Zellen zu waschen und Zellernte Puffer 1x und Vorkühlung auf 4 ° C Waschen und Verdrängen von Matrigel sollten auf Eis durchgeführt werden. </li><li> 3x mit dem Zellwaschpuffer waschen acinar Strukturen. </li><li> Sammeln Sie die Acini in 15 ml Zentrifugenröhrchen mit Zellernte buffer durch 30 min Inkubation auf einem Schüttler bei 4 ° C, gefolgt Mix Suspension auch mit einer 1 ml Pipette. Dadurch wird die Matrigel in kleine Stücke brechen und die meisten der Zellen in der Zellernte-Puffer. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen bei 200 × g in einer Kultur zentrifugiert. Entfernen Sie die Schwimmschicht aus Hydrogel aus den pelletierten Zellen mit einem P200 Pipettenspitze. </li><li> Resuspendieren der Lysate in SDS-Probenpuffer mit dem Kit bei. RIPA Lysepuffer können ebenfalls verwendet werden. </li></ol> 4. Quantifizierung von malignen vs Gutartige Brust Phänotyp <ol><li> Wachsen Zellen in dreifacher Ausführung für jede Behandlung Satz folgende Schritte 2.1-2.4. </li><li> Nehmen Phasenkontrastbilder von acinar Strukturen aus jeder Vertiefung bei 5X oder 10X Auflösung mit einem Phasenkontrastmikroskop zu einer Folie Schieber und einen Computer angeschlossen ist. Nehmen die Bilder durch Bewegen des Schiebers von einem Rahmen zum anderen und somit über die gesamte Vertiefung der Kammerobjektträger. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der acinar Strukturen,die Anzahl der einzelnen runden flachen Acini und der Anzahl der multiacinar Strukturen oder planlos gewachsenen Strukturen fehlen Organisation und Prozesse mit Verzweigung von ihr ausgeht. </li><li> Berechnen Sie den prozentualen Anteil der einzelnen runden flachen Strukturen acinar vs malignen Strukturen und Grundstück als Säulendiagramm. Berechnen Sie die Bedeutung von Student-t-Test. </li></ol>

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	<li>Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroma+in+breast+development+and+disease.">Stroma in breast development and disease.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li><li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. 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P., Rosen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rosen's breast pathology. , (2008).</li><li>Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+the+microenvironment+in+breast+cancer+progression:+recapitulation+of+mammary+tumorigenesis+using+a+unique+human+mammary+epithelial+cell+model+and+a+three-dimensional+culture+assay.">The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay.</a> Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).</li><li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression.">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li><li>Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCN6+modulates+BMP+signaling+via+the+Smad-independent+TAK1/p38+pathway,+acting+to+suppress+metastasis+of+breast+cancer.">CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer.</a> Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).</li><li>Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCN6+knockdown+disrupts+acinar+organization+of+breast+cells+in+three-dimensional+cultures+through+up-regulation+of+type+III+TGF-&#946;+receptor.">CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-&#946; receptor.</a> Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+reversion+or+death+of+cancer+cells+by+altering+signaling+pathways+in+three-dimensional+contexts.">Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts.</a> J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).</li><li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+co-culture+models+to+study+prostate+cancer+growth,+progression,+and+metastasis+to+bone.">Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).</li><li>Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+model+of+differentiation+of+immortalized+human+bronchial+epithelial+cells.">A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells.</a> Differentiation. 74, 141-148 (2006).</li><li>Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mammary+gland+branching+morphogenesis+by+the+extracellular+matrix+and+its+remodeling+enzymes.">Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes.</a> Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).</li><li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype,+gene+expression,+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines.">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8, 1-11 (2013).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Wir haben hier die dreidimensionale Kultur von Brustepithelzellen auf einer rekonstituierten Basalmembran und die Nützlichkeit des Systems, zwischen bösartigen gegen gutartige Brust Phänotyp differen beschrieben. Dieses System kann auch zur Bildung verschiedener Zelltypen anderer Drüsengewebe verwendet werden, und es wurde berichtet, um erfolgreich zu Kultur Prostata-Epithelzellen, bronchiale Epithelzellen und Schilddrüsen-Epithelzellen verwendet haben, um nur einige zu nennen 12-14. Die Bedeutung der 3D...

Dreidimensionale Kultur (3D) von Brust-Epithelzellen auf rekonstituierte Basalmembran ist ein wichtiges Modellsystem, um die komplexe Phänotyp und zugehörige Signalisierung der normalen Brust und Brustkrebs 2,3 studieren. Die funktionelle Einheit der Brust ist der Endkanal lobulären Einheit (TDLU), die von einer kleinen Leitung, die Verzweigungen in Acini besteht. Die Acini sind hochorganisierten Strukturen, zwei Zellschichten, Epithel und Myoepithelzellen, die durch eine Basalmembran 5 umgeben sind, besteht. Die prägnantesten Merkmale des normalen Azini sind zelluläre Polarisation, Anbringung an der zugrunde liegenden Basalmembran und spezialisierten Zell-Zell-Kontakten. Dieses komplizierte Organisation ist in invasiven Karzinomen gestört. Die weit verbreiteten 2D Kulturen, in denen Zellen werden als Monoschichten gezüchtet, nicht für die Bildung der Acini zu ermöglichen. Somit wird die Monoschichtkultur fehlen in der Bereitstellung eines Systems, um die komplexen Beziehungen zwischen Epithelzellen zu erfassenin normalen Brust und ihre Deregulierung bei Brustkrebs. Funktionelle monotypic epithelialen Kulturen der Brustzellen wurden in mehreren Laboratorien 2,3 entwickelt. 3D-Kultur geht das Wachstum von Brust-Zellen auf Matrigel, die eine gelösten Extrakt aus Engelbreth-Holm-Swarm-Maus-Sarkom-Zellen abgeleitet ist und im Handel erhältlich. Andere 3D-Substrate wie Kollagen I werden ebenfalls verwendet. Die Brust-Zellen in 3D mit 3D-Embedded-Test, bei dem Zellen kultiviert in Matrigel 2 eingebettet sind kultiviert werden. Alternativ können Zellen durch 3D auf Assay kultiviert werden, die auch als 3D-Overlay-Assay, die kostengünstig ist, wie es erfordert weniger Volumen von Matrigel und erleichtert Zeitraffer-Überwachung der Koloniebildung durch Phasenkontrast-Bildgebung und ist ideal für in situ-Bildgebung 2 -3. Die 3D auf Test ist verwendet worden, um die Korrelation zwischen der acinar Phänotyp und Genexpressionsprofil 7 definieren. 3D-Kultur kann effektiver werdenEly verwendet, um normale und benignen Zellen von invasiven Karzinomen zu unterscheiden. Normal-und gutartigen Brustzellen bilden Wachstum verhaftet polarisierten Strukturen mit einem gut definierten Hohlraum in der Mitte auf der Erwägung, dass Matrigel invasiven Karzinomzellen überaus produktiv und planlos wachsen ohne Lichtung des Lumens. E6/E7 verewigt menschlichen Brust Epithelzellen und MCF10A Zelllinie, die eine spontan immortalisierte Zelllinie aus einem 36-jährigen Patienten mit Mastopathie isoliert, wurden erfolgreich eingesetzt, um die gutartige Brust Phänotyp in 3D 3,8 zurückzuerobern und wurden als serviert wird, ist ein Modellsystem, um die onkogene und Tumor-Suppressor-Funktion von mehreren Molekülen 8,9 studieren. Diese gutartigen Zellen können verändert werden, um Gen (e) von Interesse durch die Einführung von Lentiviren / Retrovirus manipulieren. Wenn das Gen (e) von Interesse ist ein Tumorsuppressor, werden shRNA-vermittelten Knockdown zu einer malignen Transformation wohin führen, wenn das Gen von Interesse ist ein Onkogen-Überexpression in benignen Zellensollte einen malignen Phänotyp zeigen. In beiden Fällen sind die in 3D gebildet acinar Strukturen können die maligne Transformation zu erfassen. Gutartige Einzelzellen in 3D vernickelt beginnen sich zu vermehren und bilden runde kugelförmige Strukturen. 5-8 Tage nach dieser sphärische Aggregat von Zellen wird in eine Umgebung polarisierte Schicht von Zellen, die in Kontakt mit dem Matrigel ist, und einer inneren Masse von weniger polarisierten Zellen, die Kontakt mit dem Matrigel fehlt unterscheiden. In den nächsten 10 bis 15 Tagen werden die inneren Zellen werden beginnen, durch Apoptose bildet eine klare Lumen sterben. Die malignen Zellen wachsen ihre Polarität planlos zu verlieren. Sehr bösartige Zellen bilden in der Regel Verzweigungsstrukturen. Diese Unterschiede im Phänotyp kann durch Zeitablauf Phasenkontrast-Bildgebung und durch in situ-Immunfärbung mit relevanten molekularen Marker erfasst werden. Die am häufigsten verwendeten Marker sind alpha 6-Integrin, eine basale Polaritätsmarkierung, in Verbindung mit dem Proliferationsmarker Phospho-Histon-3 und der apoptotic Marker Caspase-3 gespalten. Letzteres ist wichtig, um zu bestimmen, ob die Lumenbildung in der Mitte der Acini einem Merkmal der normalen und benignen Zellen. Andere Polarität und Zell-Zell-Kontakt Marker umfassen GM130, Laminin, ERM, E-Cadherin. Abwechselnd die Brustkrebszelllinien konstruiert werden, um das Gen von Interesse manipulieren. In diesem Fall wird eine Rückkehr zu mehr Wachstum verhaftet kann gutartig Phänotyp verwendet werden, wie ein ausgelesen, um von der Krebs-Phänotyp unterscheiden. 3D-Kultur kann auch verwendet werden, um sorgfältig die Signalwege in der malignen Transformation beteiligt 10-11 abzugrenzen. Mit Hilfe der oben genannten Lese-outs, pharmakologische Inhibitoren, blockierende Antikörper oder rekombinante Proteine ​​kann auf molekularer Signal die zu malignen Transformation ermitteln werden kann. Mit anhaltenden Bemühungen von verschiedenen Labors ist es möglich, die Zellen zu extrahieren, um aus 3D-RNA isolieren und bereiten auch Lysate für Immunoblotting und Immunnoprecipitation. Diese Strategien werden in einer schrittweisen und detailliert in dem Protokoll beschrieben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="585">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Growth Factor Reduced matrigel</td>
			<td style="width:83px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354230</td>
			<td style="width:167px;">Avoid repeat freeze thaw&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Lab-Tek glass hamber slides 8-well</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">177402</td>
			<td>Precool on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Lab-Tek glass chamber slides 2- well&#160;</td>
			<td style="width:83px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">177380</td>
			<td>Precool on ice&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">goat anti mouse F(ab&#180;)2 fragment</td>
			<td style="width:83px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:119px;">115-006-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:83px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:119px;">005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fluorescent conjugated Alexa antibodies</td>
			<td style="width:83px;">Molecular probes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Please look at molecular probes website</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Prolong gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td style="width:83px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">3D Culture Cell Harvesting kit</td>
			<td style="width:83px;">Trevigen</td>
			<td style="width:119px;">3448-020-k</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-Apha-6-integrin</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientifics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MAB1378</td>
			<td>1:00 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-GM130</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610822</td>
			<td>1:00 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientifics&#160;</td>
			<td style="width:119px;">16-222</td>
			<td>1:100 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)</td>
			<td style="width:83px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">9661s</td>
			<td>1:50 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Anti-E-cadherin</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">610181</td>
			<td>1:200 dilution for IF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells

Invasive Mammakarzinome sind eine Gruppe von malignen epithelialen Tumoren gekennzeichnet durch die Invasion von benachbarten Geweben und Neigung zu metastasieren. Das Zusammenspiel von Signalen zwischen Krebszellen und ihrer Mikroumgebung übt einen starken Einfluss auf das Wachstum von Brustkrebs und biologischen Verhalten ein. Die meisten dieser Signale aus der extrazellulären Matrix verloren gehen oder ihre Relevanz under wird, wenn Zellen in einem zweidimensionalen Kultur (2D) als Monolayer gezüchtet. In den letzten Jahren hat dreidimensionale (3D) Kultur auf einer rekonstituierten Basalmembran als Methode der Wahl, um die Gewebearchitektur von benignen und malignen Brustzellen rekapitulieren entstanden. Zellen in 3D gewachsen behalten die wichtigen Signale aus der extrazellulären Matrix und einen physiologisch relevanten ex vivo-System 2,3. Zu beachten ist, gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass Zellen verhalten sich anders, wenn im Vergleich zu 2D in 3D 4 gewachsen. 3D-Kulturkann effektiv als ein Mittel, um die malignen Phänotyp von der gutartigen Brust Phänotyp zu differenzieren und für die Untermauerung der zellulären und molekularen Signal verwendet werden 3 beteiligt. Eines der charakteristischen Merkmale von gutartigen epithelialen Zellen ist, dass sie polarisiert sind, so daß die apikale Zytoplasma zu dem Lumen und der basalen Zytoplasma ruht auf der Basalmembran. Diese apikal-basalen Polarität in der invasiven Mammakarzinome, die durch zelluläre Desorganisation und Bildung anastomosierenden und Verzweigung Tubuli, die planlos infiltriert das umgebende Stroma gekennzeichnet sind verloren. Diese histopathologischen Unterschiede zwischen gutartigen Drüse und invasives Karzinom in 3D 6,7 reproduziert werden. Mit den entsprechenden Lese-outs, wie die Quantifizierung der einzelnen Runde acinar Strukturen oder differentielle Expression von validierten molekulare Marker für Zellproliferation, Apoptose Polarität und in Kombination mit anderen molekularen und zellbiologischen Techniken, 3D-culturE kann ein wichtiges Instrument, um die zellulären Veränderungen während der malignen Transformation und für die Abgrenzung der zuständigen Melde besser zu verstehen ist.

3D Kultur effektiv zur malignen Phänotyp von menschlichen Brustepithelzellen von gutartigen Brust unterscheiden. Einzel benignen Zellen auf Matrigel vergoldet wachsen, wie organisiert kugelförmige Gebilde, die leicht als einzige runde, flache Acini in einer Ebene mit Phasenkontrast-Abbildung abgebildet werden kann. Die einzelnen malignen Zellen auf Matrigel vergoldet wachsen planlos, zeigen sehr hohen Brechungsindex und sind in einer Ebene schwer zu Bild. Wie in Fig. 1 gezeigt, ist die benigne HME und...

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Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Dreidimensionale Kultur von Säugetier-Epithelzellen auf einem rekonstituierten Basalmembran ist eine nützliche Methode, um die in vivo-Architektur der gutartigen Brust rekapitulieren und den malignen Phänotyp von gutartigen Brust Phänotyp zu differenzieren. Wichtiger ist, kann dieses System angewandt werden, um invasive Karzinome in anderen Geweben zu untersuchen.

Dreidimensional Kulturen: Ein Werkzeug, um Architektur zu studieren Normale acinar gegen maligne Transformation von Brustzellen

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

three-dimensional-cultures-tool-to-study-normal-acinar-architecture

Research

JoVE Journal

Medicine

19.8K Aufrufe.  University of Michigan Comprehensive Cancer Center.  Dreidimensionale Kultur von Säugetier-Epithelzellen auf einem rekonstituierten Basalmembran ist eine nützliche Methode, um die in vivo-Architektur der gutartigen Brust rekapitulieren und den malignen Phänotyp von gutartigen Brust Phänotyp zu differenzieren. Wichtiger ist, kann dieses System angewandt werden, um invasive Karzinome in anderen Geweben zu untersuchen. 

Serie: Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Menschliche neuroendokrinen Tumor-Zelllinien als dreidimensionales Modell für das Studium der menschlichen neuroendokrinen Tumor-Therapie

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Forschung

Medizin

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods rely on the ability of cells either to attach to a solid substratum of a tissue culture dish or to grow in suspension in liquid medium. Multiple immortal cell lines have been created and grown using such approaches, however, these methods frequently fail when primary cells need to be grown ex vivo. Such failure has been attributed to the absence of the appropriate extracellular matrix components of the tissue microenvironment from the standard systems where tissue culture plastic is used as a surface for cell growth. Extracellular matrix is an integral component of the tissue microenvironment and its presence is crucial for the maintenance of physiological functions such as cell polarization, survival, and proliferation. Here we present a 3-dimensional tissue culture method where primary bone marrow cells are grown in extracellular matrix formulated to recapitulate the microenvironment of the human bone (rBM system). Embedded in the extracellular matrix, cells are supplied with nutrients through the medium supplemented with human plasma, thus providing a comprehensive system where cell survival and proliferation can be sustained for up to 30 days while maintaining the cellular composition of the primary tissue. Using the rBM system we have successfully grown primary bone marrow cells from normal donors and patients with amyloidosis, and various hematological malignancies. The rBM system allows for direct, in-matrix real time visualization of the cell behavior and evaluation of preclinical efficacy of novel therapeutics. Moreover, cells can be isolated from the rBM and subsequently used for in vivo transplantation, cell sorting, flow cytometry, and nucleic acid and protein analysis. Taken together, the rBM method provides a reliable system for the growth of primary bone marrow cells under physiological conditions.

In standard culture methods cells are taken out of their physiological environment and grown on the plastic surface of a dish. To study the behavior of primary human bone marrow cells we created a 3-D culture system where cells are grown under conditions recapitulating the native microenvironment of the tissue.

Eine dreidimensionale Zellkulturmodell zu primären humanen Knochenmark und seine Malignome Studieren

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantifizierung der Brustkrebs-Zelle Invasivität Mit einem Drei-dimensionale (3D) Modell

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Orthotopische Injektion von Brustkrebszellen in das Brustfettpolster von Mäusen, das Tumorwachstum zu studieren.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Verwendung Adeno-assoziierte Virus als Werkzeug Retinal Barrieren in Disease Study

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

Nutzung der Koloniebildung in Weichagar-Assay auf Inhibitoren der Tumorigenität in Brustkrebs-Zellen zu identifizieren

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Dreidimensionale Alginat-Perle Kultur der Menschen Hypophysenadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

Mit Saccadometry mit Deep Brain Stimulation Normale und Pathologische Funktion des Gehirns zu studieren

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

A Clinical Trial Assessing the Safety, Efficacy, and Delivery of Olive-Oil-Based Three-Chamber Bags for Parenteral Nutrition

Limited evidence exists to precisely estimate efficacy and safety differences between parenteral nutrition (PN) prepared using olive-oil-based three-chamber bags (3CBs) and soybean-oil-based compounded bags (CoBs) in hospitalized adult patients. We designed a multicenter, randomized, prospective, open-label, noninferiority protocol to compare the efficacy, safety, and distribution of olive-oil-based 3CBs and soybean-oil-based CoB formulations in adult Chinese patients requiring PN during surgical intervention. Subjects were randomized to receive either one of the study treatments using an interactive voice or web-based recognition system in accordance with the randomization code. Randomization was further stratified based on the study site and surgical category. Both treatment groups received similar amounts of calories and protein. In addition, the two study treatments contained a similar composition of the amino-acid component. The only difference between the two PN formulations was the lipid constitution. The duration of administration of study treatments was a minimum of 5 days up to a maximum of 14 days after the surgical procedure. The primary efficacy endpoint was serum prealbumin levels on day 5 of the study. Noninferiority was proved if the anti-log of the lower bound of the 95% confidence interval (CI) of the treatment difference was at least 0.80. Other efficacy measures included treatment preparation time; duration to achieve tolerability of oral nutrition; associated infectious complications; length of hospitalization; and laboratory assessment of markers of nutrition, inflammation, metabolism, and oxidative stress. A total of 458 patients were enrolled in the study. The results showed that olive-oil-based 3CBs were non-inferior to soybean-based CoBs, besides being well tolerated. The infection rate was found to be significantly lower in the olive-oil-based 3CB group. Thus, this study may be used as a reference for future research on lipid emulsion and 3CBs.

Here, we present a protocol for a study comparing the efficacy, safety, and delivery of olive-oil-based 3CB and soybean-oil-based CoB formulations in adults requiring parenteral nutrition. The results revealed that olive-oil-based 3CBs is non-inferior and well tolerated compared to soybean formulations.