Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health, National Cancer Institute (1R21CA141039), BD Biosciences Research Grant Award der American Cancer Society Institutional Research Grant (IRG # 58-006-53), an die Purdue University Center for Cancer finanziert Forschung, und die kanadischen Institutes of Health Research und dem Alberta Cancer Research Initiatives Vorstand Programm. MP wurde von der National Institutes of Health, National Cancer Institute, Cancer Prevention Internship Program unterstützt (R25CA128770; PI: D. Teegarden) durch die Onkologische Sciences Center und dem Discovery-Learning Research Center an der Purdue University, verabreicht.

1. Advance-Vorbereitung <ol><li> Halten sterilen serologischen Pipetten und Pipettenspitzen bei 4 ° C Fehlerbehebung: Matrigel Gele bei Raumtemperatur (RT), mit kaltem Pipetten und Tipps werden Matrigel geliert während der Kultur-Setup verhindern. </li><li> Tauen Sie eine Flasche Matrigel bei 4 ° C über Nacht. </li></ol> 2. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li> Vorbereitung von Fibronektin-Stammlösung: Machen Sie eine 1 mg / ml Stammlösung von Fibronektin durch Auflösen von 100 mg humanem Fibronektin in 100 ml destilliertem Wasser. Sobald die Fibronektin gelöst hat, Sterilfilter, aliquote, und bei 4 ° C bis zu 6 Monaten. Fehlerbehebung: Wenn Fibronektin nicht schnell auflösen inkubieren Sie die Lösung für ein paar Minuten in einem Wasserbad Satz bei 37 ° C </li><li> Herstellung von 10x PBS: Man löst 80 g Natriumchlorid NaCl, 14,4 g Na 2 HPO 4, 2 g KCl und 2,4 g KH 2 PO <sub&gt; 4 in 1 l destilliertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4, steril filtriert und bei 4 ° C für bis zu 6 Monate. </li><li> Vorbereitung der Neutralisationspuffer 20: Machen Sie eine Lösung, die 100 mM HEPES 2x in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit 1 M HEPES und 10x PBS-Stammlösungen. Einstellen des pH der Lösung auf 7,0. Lagern bei 4 ° C für 2-3 Monate. </li><li> Herstellung von 2 mg / ml-Lösung von Rattenschwanz-Kollagen Typ I: Einen 2 mg / ml Kollagen-I-Lösung in der Neutralisationspuffer (Schritt 2.3). Mischen Sie die Lösung bei niedriger Geschwindigkeit und vorsichtig durch Pipettieren von oben und unten. Da diese Kollagen sehr zähflüssig ist, zu vermeiden Erzeugung von Luftblasen beim Pipettieren. Es wird empfohlen, Kollagen I-Lösung jedes Mal frisch zubereiten. Die Lösung wird auf Eis bis zum Gebrauch. </li><li> Vorbereitung der endostalen Beschichtung (Rend): Mischen Sie 1 mg / ml Fibronektin-Lager mit 2 mg / ml Kollagen I Lager (Schritte 2.1 und 2.4) bis zu einer Endkonzentration von 77 pg / ml und 29 pg / ml, in 1x &amp;# 160; sterilem PBS. Mischen und bei 4 ° C bis zu 1 Monat. </li><li> Vorbereitung der rekonstruierten Knochenmatrix (RBM): <ol><li> Vorkühlen 1,5 ml Reaktionsgefäße auf Eis. Halten Sie alle Matrix-Lösungen auf Eis zu allen Zeiten. </li><li> Mischung 4 Teile Matrigel (Matrigel-Konzentration variiert von Charge zu Charge, aber die Variationen gefunden vernachlässigbar ist), 2,5 Teile 1 mg / ml Fibronektin und 1 Teil von 2 mg / ml Kollagen I auf Eis durch erste Pipettieren in Matrigel der Schlauch mit kaltem Pipettenspitzen und fügen Sie dann Fibronektin und Kollagen I. Matrigel beginnt Erstarren bei Temperaturen über 4 ° C, so schnell arbeiten beim Pipettieren Matrigel. Mischen Sie die Matrix sehr vorsichtig durch Pipettieren von oben und unten, vermeiden die Einführung Blasen. Halten Sie die Röhrchen auf Eis, während das Mischen der rBM. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Knochenmarkwachstumsmedium (BMGM): Stellen Sie 500 ml BMGM enthält 6,2 x 10 -4 M CaCl 2, 10 -6 M Natrium-Succinat, 10 -6 M Hydrocortison, 20% Humanplasma (normalen oder malignen von gesunden Spendern oder Patienten gesammelt) und 1% Penicillin / Streptomycin in RPMI-1640. CaCl 2, Natrium-Succinat, und Hydroergänzungsmittel können bei -80 ° C für&gt; 6 Monate 1.000 x Stammlösungen aufbewahrt werden. Wenn wachsende Zelllinien können fetales Rinderserum (FBS) für Humanplasma ersetzt werden. </li><li> Herstellung von 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF): In 37% Formaldehyd-Stammlösung PBS bei 10% v / v 1x Gut mischen und bei Raumtemperatur lagern 2-3 Wochen vor Licht geschützt. </li><li> Herstellung von 1% Rinderserumalbumin (BSA): Wiegen geeignete Menge BSA und löst ihn in 1x PBS. Lagerung bei 4 ° C und innerhalb von 1 Woche. BSA-Lösung neigt dazu, verunreinigt, wenn für längere Zeit gehalten gekühlt zu werden. Alternativ können BSA-Lösung aliquotiert und bei -20 ° C eingefroren werden für die Langzeitlagerung. Vermeiden Frost-Tau-Zyklen. </li><li> Herstellung von Zell Recovery-Lösung (CRS): Stellen Sie 5 mM EDTA, 1 mM Natriumvanadat (Na &lt;sub&gt; 3 VO 4) und 1,5 mM Natriumfluorid (NaF)-Lösung in 1x PBS. Sterilfilter und bei 4 ° C bis zu 6 Monaten. </li></ol> 3. Eingebettete 3D-Kultur von nicht-malignen und malignen humanen BM-Zellen <ol><li> Reinige Primär BM mononuklearen Zellen durch Ficoll-Plaque-Zentrifugation den Anweisungen des Herstellers. Optionaler Schritt: Zellen mit 0,25 uM Carboxyfluoresceindiacetat, Succinimidylester (CFSE) den Anweisungen des Herstellers, die Zellproliferation in der gesamten Kulturperiode folgen beschriftet werden. Fehlerbehebung: Wenn Zellen sterben nach CFSE-Färbung titriert die Menge der CFSE die Konzentration hängt vom Zelltyp, 0,25 uM funktioniert gut für Primär BM mononuklearen Zellen. </li><li> In 65 ul Rend-Lösung in jede Vertiefung einer 48-Well-Gewebekulturplatte behandelt. Verbreiten Sie die Lösung gleichmäßig auf die gesamte Fläche der gut decken und Inkubation für&gt; 30min bei RT. </li><li> Vorbereitung der Zellsuspension in einer Dichte von 0,5 × 10 6 Zellen in 10 ul 1x PBS pro Vertiefung einer 48-Well-Platte. In einer 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mischen die Zellsuspension mit 100 ul rBM Matrix pro Vertiefung. Mischen Sie die Zellen und rBM Matrix durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren; vermeiden Einführung Blasen. Halten die Zell / Matrix-Mischung auf Eis, um ein Gelieren der Matrix zu vermeiden. Hinweis: Die rBM System ist vollständig skalierbar, um das System in einem nicht-48-Well-Format einzurichten, passen Sie die Mengen aller Reagenzien (Matrizen und Medium) auf der Grundlage der Fläche der Platte verwendet. Skalieren der Anzahl von Zellen entsprechend beschichtet werden. </li><li> Saugen Sie den verbleibenden zerreißen und fügen Sie die Zell / Matrix-Mischung in der Mitte der Brunnen. Schnell verbreitete die Zell / Matrix-Gemisch, um die gesamte Oberfläche der Wanne gleichmäßig bedecken. Die Platte wird für 30-60 min bei 37 ° C, 5% CO 2-Gewebekultur-Inkubator, damit die Matrix zu verfestigen. Schütteln oder dissiertem die Platte während der Inkubation. Fehlerbehebung: Um ungleichmäßige Verteilung der Zellen in rBM verhindern, gut mischen vor dem Beschichten. Mischen, nachdem jeder 5. Vertiefung ausplattiert, um Zellen sich am Boden des Rohrs zu vermeiden. Sobald zogen, keine Zellen, die nicht auf den Boden des Bohrlochs durch Zug an der Matrixoberfläche sinken. Fehlerbehebung: Um ungleichmäßige Verteilung der Zellen in rBM verhindern, gut mischen vor dem Beschichten. Mischen, nachdem jeder 5. Vertiefung ausplattiert, um Zellen sich am Boden des Rohrs zu vermeiden. Sobald zogen, keine Zellen, die nicht auf den Boden des Bohrlochs durch Zug an der Matrixoberfläche sinken. </li><li> Vorwärmen BMGM in einem Wasserbad auf 37 ° C eingestellt </li><li> Nach 30 Minuten, um zu sehen, dass die Matrix richtig eingestellt, es wird wie ein weiches Gel-Schicht, die sich nicht bewegt, wenn die Platte gekippt bilden. Überlagern der Zell / Matrix-Schicht mit 1 ml warmem BMGM. Reißen der Matrix Pipette das Medium sehr leicht zu vermeiden (Abgabe Tropfen für Tropfen) unter Verwendungeine serologische Pipette. Legen Sie die zusammengebauten rBM Kultur in einem 37 ° C, 5% CO 2 Gewebekultur-Inkubator und Kultur für den gewünschten Zeitraum. Hinweis: die Lebensfähigkeit der Zellen wird für mindestens 30 Tage gehalten, ohne Medium; wenn Mediumwechsel ist erforderlich, jedes Mal ändern, nur 50% des Mediums. Critical Schritt: Es ist entscheidend, dass das Medium nicht kalt wie Kälte könnte den bereits festgelegt Matrix stören. Achten Sie darauf, um das Medium auf der Matrix zu spritzen, es könnte die weiche Matrix-Schicht brechen. Fehlerbehebung: Wenn die Lebensfähigkeit der Zellen in der rBM System niedrig ist, kann die Zelldichte müssen experimentell bei der Arbeit mit anderen als primäre mononuklearen Zellen aus BM saugt Zellen bestimmt werden. Bei der Arbeit mit Zelllinien, verringern Sie die Anzahl der Zellen 10-fach, als immortalisierte Zelllinien vermehren sich schneller als Primärzellen. </li></ol> 4. &#39;In-Matrix &quot;Imaging <ol><li><strong&gt; Lichtmikroskopie <ol><li> Bild die kultivierten Zellen direkt in rBM mit Hellfeld, Differential-Interferenzkontrast (DIC), konfokale oder andere bildgebende Verfahren, Fern Bildgebung zu ermöglichen, wie die Matrix ist etwa 1 mm dick. Verwenden Sie die Z-Stapel-Funktion auf vielen der Mikroskope zur Verfügung, um Bild die gesamte Kultur von oben nach unten. </li></ol></li><li> Immunfluoreszenzfärbung Tipp: Für die Immunfärbung Protokoll unten vermeiden Absaugen Färbung / Waschlösungen, statt die Platte zu kippen und Lösungen zu entfernen mit einer Pipette. <ol><li> Entfernen Sie die BMGM mit Hilfe einer Pipette und waschen 2-3x mit 100 ul / Wäsche / Vertiefung RT 1x PBS. Stellen Sie sicher, dass genügend PBS wird verwendet, um die gesamte Oberfläche des gut abzudecken. </li><li> Zellen in der Matrix zu fixieren, indem 100 ul / Vertiefung (für eine 48-Well-Platte) von 10% NBF für 15 min bei RT. NBF entfernen und waschen die Zellen zweimal mit 100 ul / Wäsche / Vertiefung RT 1x PBS. Anmerkung: Vermeiden Sie kalte NBF, da es die Matrix zu verflüssigen. </li><li> PBS entfernen, fügen Sie 1% BSA für 1 h bei RT oder bei 4 ° C über Nacht, um unspezifische Bindung von Antikörpern zu blockieren. </li><li> Vorbereitung Primärantikörperlösung in 1% BSA in der erforderlichen Verdünnung. Die Verdünnung wird für jeden Antikörper ändern, bitte mit dem Hersteller oder titriert, um die optimale Antikörperkonzentration zu bestimmen. Füge 100 &amp;mgr; l / Vertiefung von primärem Antikörper-Lösung und Inkubation nach den Anweisungen des Herstellers. Kritischer Schritt: Alle Inkubationen mit Antikörpern gegen Fluorophore oder Fluoreszenzfarbstoffe konjugiert im Dunkeln durchgeführt werden. </li><li> Entfernen primären Antikörperlösung und waschen 3x mit 1x PBS für 5 min. </li><li> Für die indirekte Immunfluoreszenzfärbung, Inkubation mit einem sekundären Antikörper, um fluoreszierende Sonde für 1 Stunde bei Raumtemperatur konjugiert. Verdünnte Antikörper in 1% BSA in einer Konzentration vom Hersteller vorgeschlagen. </li><li> Entfernen Sie die Sekundär einntibody Lösung und waschen 3x mit 1x PBS für 5 min. Fehlerbehebung: Um zu vermeiden, hohen Hintergrund während der Bildgebung, titriert die fluoreszenz konjugierten Sekundärantikörper und die niedrigste Konzentration, die eine angemessene Signal liefert. Wenn hohe Hintergrund ist immer noch ein Problem ist, erhöhen Sie die Anzahl und die Dauer der Waschschritte, oder nutzen Sie direkt konjugiert primären Antikörper und überspringen Sie Schritt 4.2.6. </li><li> Um die Kerne färben hinzufügen 4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindol (DAPI) Kernfärbung Lösung, bei der Verdünnung durch den Hersteller empfohlen, und Inkubation für 7-10 min bei RT. </li><li> Entfernen Kernfärbung Lösung und waschen 2x mit 1x PBS für 5 min. </li><li> Entfernen Sie die PBS aus dem letzten Wasch und fügen Sie einen Tropfen Eindeckmedium (regulärer Satz), auf die Probe, um die Fluoreszenz zu bewahren. Bild mit entsprechender Anregung / Emission Einstellungen auf einem Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskop. Hinweis: Imaging sollte innerhalb von 2 Tagen nach der Färbung durchgeführt werden, um den Abbau der Matrix und der Verlust von rBM Integrität und Verlust der Fluoreszenzsignals zu vermeiden. Wenn es nicht sofort abgebildet werden, sollte gefärbten Proben bei 4 ° C aufbewahrt werden, vor Licht geschützt, bis Bildgebung. </li></ol></li></ol> 5. Isolierung von Zellen aus rBM <ol><li> Medium vorsichtig entfernen, ohne die Matrix-Schicht zu stören. Saugen Sie nicht. </li><li> Waschen Sie die Zellen 2x mit sterilem 1x PBS. Saugen Sie nicht. </li><li> 0,5 ml eiskaltem CRS in jede Vertiefung und entfernen Sie die gesamte Matrix-Schicht zusammen mit den Zellen, durch kräftiges Auf-und Abpipettieren. Sammeln Sie die Zellen, Matrix und CRS in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zeigen auf Eis. </li><li> Fügen Sie eine zusätzliche 0,5 ml CRS auf den gleichen gut und sammeln Sie alle verbleibenden Materials. Transfer zum selben Reaktionsgefäß. </li><li> Vortex die Mischung von Zellen, Matrix und CRS und Inkubation auf Eis für 1 Stunde. Vortex-Zellen alle 15 Minuten, um die Freisetzung aus der Matrix zu erleichtern. </li><li> Überprüfen Sie die Mischung nach 1 Stunde, ohne sichtbare Klumpender Matrix vorhanden sein. Fehlerbehebung: Wenn Klumpen von Matrix noch nach 1 Stunde sichtbar, Transfer Zellen / Matrix / CRS Mischung zu einem größeren Rohr, fügen zusätzliche 2-5 ml CRS, und Inkubation für weitere 30 bis 60 min. </li><li> Zentrifuge Zellen in CRS bei 1.000 UpM für 5-10 Minuten bei 4 ° C. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml kaltem PBS 1x. </li><li> Zentrifugieren bei 1.000 rpm für 5-10 min und Überstand. Wiederholen Sie den PBS-Wasch noch einmal. </li><li> Der zweite PBS-Wasch vervollständigt die Wiederherstellung von Zellen von Matrix und isolierte Zellen können für beliebige nachfolgende Anwendungen wie DNA / RNA / Protein-Isolierung verwendet werden, Durchflusszytometrie, in vivo Transplantation usw.. </li></ol>

<ol>
	<li>Carrel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Permanent+Life+of+Tissues+Outside+of+the+Organism.">On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism.</a> J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).</li><li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+living+developing+nerve+fiber.">Observations on the living developing nerve fiber.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).</li><li>Earle, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+malignancy+in+vitro.+IV.+The+mouse+fibroblast+cultures+and+changes+seen+in+the+living+cells.">Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells.</a> J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).</li><li>Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Culture+Studies+of+the+Proliferative+Capacity+of+Cervical+Carcinoma+and+Normal+Epithelium.">Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium.</a> Cancer Res. 12, 264-265 (1952).</li><li>Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional-Differentiation+and+Alveolar+Morphogenesis+of+Primary+Mammary+Cultures+on+Reconstituted+Basement-Membrane.">Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane.</a> Development. 105, 223-227 (1989).</li><li>Lamb, R., Ambler, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+propagated+in+serum-free,+feeder-free+culture+conditions+fail+to+form+stratified+epidermis+in+a+reconstituted+skin+model.">Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model.</a> PloS One. 8, (2013).</li><li>Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3-dimensional+culture+system+as+an+in+vitro+model+for+studying+oral+cancer+cell+invasion.">A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion.</a> Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).</li><li>Kirshner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+three-dimensional+model+for+evaluating+the+impact+of+therapy+on+multiple+myeloma.">A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma.</a> Blood. 112, 2935-2945 (2008).</li><li>Gudjonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+and+tumor-derived+myoepithelial+cells+differ+in+their+ability+to+interact+with+luminal+breast+epithelial+cells+for+polarity+and+basement+membrane+deposition.">Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition.</a> J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).</li><li>Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEACAM1-4S,+a+cell-cell+adhesion+molecule,+mediates+apoptosis+and+reverts+mammary+carcinoma+cells+to+a+normal+morphogenic+phenotype+in+a+3D+culture.">CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).</li><li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Gunn, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+natural+products+parthenolide+and+andrographolide+exhibit+anti-cancer+stem+cell+activity+in+multiple+myeloma.">The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma.</a> Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).</li><li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=384+hanging+drop+arrays+give+excellent+Z-factors+and+allow+versatile+formation+of+co-culture+spheroids.">384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).</li><li>Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment-mediated+drug+resistance:+a+major+contributor+to+minimal+residual+disease.">Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease.</a> Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).</li><li>Golde, D. W., Cline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Human+Bone-Marrow+in+Liquid+Culture.">Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture.</a> Blood. 41, 45-57 (1973).</li><li>Gartner, S., Kaplan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Culture+of+Human-Bone+Marrow-Cells.">Long-Term Culture of Human-Bone Marrow-Cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. Biol. 77, 4756-4759 (1980).</li><li>Caligaris-Cappio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+bone+marrow+stromal+cells+in+the+growth+of+human+multiple+myeloma.">Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma.</a> Blood. 77, 2688-2693 (1991).</li><li>Pike, B. L., Robinson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bone+marrow+colony+growth+in+agar-gel.">Human bone marrow colony growth in agar-gel.</a> J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).</li><li>Bug, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+family+small+GTPases+control+migration+of+hematopoietic+progenitor+cells+into+multicellular+spheroids+of+bone+marrow+stroma+cells.">Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells.</a> J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).</li><li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion.">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4, (2006).</li><li>Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Expression+of+Fibronectin+and+Collagens+I+and+IV+in+Multiple+Myeloma+and+Monoclonal+Gammopathy+of+Undetermined+Significance.">Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance.</a> J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine Interessenskonflikte.

Die rBM Modell bietet ein umfassendes System, in dem zellulären Zusammensetzung des BM wird ex vivo für bis zu 30 Tage gehalten. BM-Zellen in rBM Selbst Schichtung nach ihrer Funktion eng imitiert die BM-Architektur in vivo gefunden gewachsen. Außerdem ist das erste System, das für die Expansion des multiplen Myeloms Klon 8 ermöglicht. Die wichtigsten Schritte für die Gewährleistung der robuste Wachstum der BM-Zellen und den Gesamterfolg der Kultur sind: 1), um eine gesunde Population...

Gewebekultur wurde entwickelt, um das Verhalten der Zelle in einer kontrollierten Umgebung zu studieren, um die Variabilität zu minimieren, wenn systemische Vergleich verschiedener Prozesse in intakten Organismen. Diese Methode wurde erstmals im Jahr 1900 1,2 festgelegt und bezieht sich auf eine Technik, bei der Gewebe-Explantate wurden in eine Glasschale kultiviert ex vivo. In der Mitte der 1900er Jahre wurde das System angepasst, um verstreuten Zellen eher als Fragmente intakter Gewebe wachsen, und die Begriffe &quot;Gewebekultur&quot; und &quot;Zellkultur&quot; wurde zum Synonym für drei. Bei solchen herkömmlichen Zellkultursystemen Zellen auf der Oberfläche der Gewebekultur-Plastik mit Wachstumsmedium mit verschiedenen Wachstumsfaktoren überlagert gewachsen. Adhärenten Zellkultur, in der Zellen anlagern und ausbreiten auf der Gewebekultur-Kunststoff und nicht-adhärenten Kulturen, wo Zellen in Suspension propagiert: Zwei Arten von Kulturen haben auf der Grundlage der Haftfähigkeit von verschiedenen Zellen entstanden. Seit den frühen Tagen des ZellEs wurden Kultur verschiedenen unsterblichen Zelllinien wie HeLa-4, der ersten menschlichen Krebszelllinie. Diese Zelllinien haben die Fähigkeit, auf unbestimmte Zeit in Zellkultur zu vermehren, und die meisten keine spezielle Behandlung erforderlich, um die Lebensfähigkeit zu erhalten. Die reduktionistische Ansatz der ursprünglichen Zellkulturverfahren wurde entwickelt, um das System so weit wie möglich, indem die erforderlich ist, um die Lebensfähigkeit der Zellen und die Proliferation aufrecht Minimum Komponenten vereinfachen. , Vereinfachte Zellkultur Ansätze scheitern jedoch ex vivo meisten primären humanen Zelltypen mit begrenzter Lebensdauer unterstützen. Daher neue Kultursysteme werden entwickelt, um die Gewebemikroumgebung so eng wie möglich anzunähern, wodurch Zell Explantate unter physiologischen Bedingungen zu wachsen. Im Gegensatz zu den herkömmlichen / Reduktionist Zellkulturansätze, 3-dimensionale (3-D) werden nun Kultursystemen zu einem bevorzugten Verfahren, um effizient verschiedene Kulturmenschlichen Zelllinien und Primärzellen anschließend untersuchen Mechanismen in Gesundheit und Krankheit beteiligt sind, im Rahmen einer Mikroumgebung. Solche 3-D-Systeme sind in der Regel mit rekonstruierten Matrizen und / oder Medium mit Wachstumsfaktoren gesetzt, um die Gewebe-Mikroumgebung zu rekapitulieren, um Zelltypen von Interesse studieren. Die erste dieser 3-dimensionalen (3-D) Kulturmodelle entwickelt, um Brustdrüsenentwicklung zu untersuchen. Um die Zellen mit nativen Bedingungen Brustepithelzellen in Matrigel eingebettet, Collagen IV und Laminin-reiche Quelle von extrazellulärer Matrix (ECM) zu schaffen, und bedeckt mit Wachstumsmedium. Unter solchen Bedingungen, bildeten die Mamma-Epithelzellen Cluster ähnlich der Brust Acini und nach Stimulation mit laktogene Hormone, diese Azini sezerniert Kasein, Milchproteine ​​und andere, in den Hohl Lumena der Acini artige Strukturen. Casein-Sekretion wurde nicht in Standard-Kulturen auch nach Zugabe von Prolaktin 5 beobachtetWeitere Betonung der Rolle der Mikroumgebung bei der Erhaltung der morphologischen und phänotypischen Eigenschaften von Zellen. Eine weitere Demonstration der Verlust der normalen Zellfunktion, wenn die Zellen aus dem Kontext ihrer physiologischen Mikroumgebung genommen ist eine Demonstration, dass ohne Mikroumgebung, Keratinozyten nicht, geschichtete Epidermis 6 zu bilden. Eine Anzahl von anderen 3-D-Modelle wurden entwickelt, um die ex vivo Vermehrung von primären Zellen 7,8 erlauben. Die entscheidende Rolle der Mikroumgebung der Zellverhalten wurde elegant in einer Studie, in Brustepithelzellen gebildet &quot;inside-out&quot;, wenn Acini in Kollagen kultivierten I Matrix, verglichen mit dem vollständig polarisiert Acini, die in Matrigel gebildet wurden demonstriert. Dieser Verlust der korrekten Morphologie wurde rückgängig gemacht, wenn Laminin-produzierenden Myoepithelzellen wurden den Kulturen Kollagen I 9 aufgenommen. Darüber hinaus ist die richtige Mikroumgebung für die genaue erforderlichGenotyp Manifestation. In einer Schale gezüchtet, MCF7-Brustkrebszellen mit einem Zell-Zell-Adhäsionsmolekül CEACAM1 transfiziert verhalten sich genau die gleiche wie die nicht-transfizierten CEACAM negativen Zellen. Wenn jedoch in Matrigel kultiviert, in Kontakt mit ECM, Wildtyp MCF7 Form tumorartige Strukturen, während MCF7 Zellen mit CEACAM1 transfiziert wieder zu einem normalen Phänotyp und Form Acini mit Hohl Lumena, wie mit nicht-malignen Brustepithel 10 eingerichtet. Ebenso Sperr β1-Integrin in Brustkrebszellen nicht deren Verhalten unter Standardkulturbedingungen zu ändern, aber der gleiche Versuch in 3-D-Kulturen durchgeführt zeigt, dass die Blockierung β1-Integrin kehrt malignen Zellen zu einem normalen Phänotyp 11. Daher wird das Gewebe-Mikroumgebung nicht nur erforderlich, um die Lebensfähigkeit der Zellen aufrecht zu erhalten, sondern auch um die richtige Zellfunktion beizubehalten. Neben der Bereitstellung eines Systems, wo das Zellverhalten unter physiologischen Zustand untersucht werdens, funktionieren 3-D-Kulturen als robustes und zuverlässiges Medium für die präklinische Testung neuer Therapeutika 8,12,13. Kultivieren von Zellen in 3-D ermöglicht Screening von Verbindungen unter den experimentellen Bedingungen der Umwelt-vermittelte Resistenz-14, wo der Beitrag der Zell-Zell-und Zell-ECM-Adhäsion beurteilt werden konnte. Darüber hinaus können Off-Target-Toxizität neuer Verbindungen, die durch die mehrfache zellulären Kompartimenten verschiedener Gewebe festgestellt werden. Solche Bildschirme können schneller durchgeführt werden und sind kostengünstiger als vergleichbare Studien in vivo 8. Hier präsentieren wir ein Setup von einem 3-D-Modell des rekonstruierten Knochenmark (RBM), wo normalen und malignen Knochenmark (BM)-Zellen vermehren ex vivo in einem System eng imitiert die Mikroumgebung des menschlichen BM. Frühere Versuche zur wachsenden primären humanen Zellen BM in 2-D-Kulturen, flüssigen oder haft Co-Kulturen mit verschiedenen Komponenten des BM StromaOder 3-D, halbfesten Agarkulturen haben mit beschränktem Erfolg aufgrund ihrer Unfähigkeit, die Zellen mit den Komponenten der Gewebemikroumgebung liefern 15-18 erfüllt. In diesen Systemen hatte BM primären Zellen schlechte Rentabilität und nicht zu vermehren ex vivo. Ein anderes System, wo menschliche BM Vorläuferzellen in Sphäroid-Co-Kulturen mit BM Stromazellen gewachsen ist ein 3-D-System, wo hämatopoetischen Stammzelllebensfähigkeit und Proliferation wurde für mindestens 96 Stunden 19 getragen. Obwohl sehr nützlich für das Verständnis der hämatopoetischen Vorläufer Biologie, dieses System nicht getreu rekapitulieren die Mikroumgebung des BM aufgrund der Abwesenheit von ECM-Komponenten, also die Begrenzung ihrer Nützlichkeit. Die hier beschriebene rBM Modell präsentiert ein umfassendes System, wo beide zellulären und extrazellulären Kompartimenten des menschlichen BM werden in vitro rekonstruiert. Wir zeigen, dass rBM Kulturen ex vivo Wachstum von normalen menschlichen BM-Zellen unterstützen, wie wirll als Zellen von Patienten mit verschiedenen hämatologischen Störungen isoliert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry</td>
			<td style="width:239px;">Invitrogen/Life technologies</td>
			<td style="width:108px;">C34554</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NG1884448</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Matrigel basement membrane matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:328px;">Rat tail collagen type I</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354249</td>
			<td style="width:203px;">Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4648</td>
			<td style="width:203px;">For TRAP staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">SigmaFast BCIP/NBT tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5655</td>
			<td style="width:203px;">For alkaline phosphatase staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Zeiss confocal LSM 510 microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Zeiss 510 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Image analysis software for confocal analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Zeiss Axiovert 200M inverted microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">MetaMorph software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Image analysis software for Axiovert 200M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">FACSort flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">CellQuest Pro software&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Software for the analysis of flow cytometry data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies

Gewebekultur ist ein wertvolles Werkzeug, um viele Aspekte der Zellfunktion zu untersuchen, von der normalen Entwicklung für Krankheiten. Herkömmliche Zellkulturverfahren beruhen auf der Fähigkeit von Zellen, entweder an einem festen Substrat einer Gewebekulturschale befestigen oder in Suspension in einem flüssigen Medium wachsen. Mehrere wurden unsterbliche Zelllinien erstellt und aufgewachsen mit solchen Ansätzen, aber diese Methoden häufig scheitern, wenn Primärzellen brauchen, um ex vivo kultiviert werden. Ein solches Versagen ist das Fehlen von geeigneten extrazellulären Matrixkomponenten des Gewebemikroumgebung von den Standardsystemen, bei denen Gewebekultur-Plastik ist als Oberfläche für Zellwachstum eingesetzt zurückzuführen. Extrazelluläre Matrix ist ein integraler Bestandteil der Gewebemikroumgebung und die Präsenz von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der physiologischen Funktionen, wie Zellpolarisation, das Überleben und die Proliferation ist. Hier präsentieren wir eine 3-dimensionale Gewebekultur-Methode, bei der primären Knochenmark-cells sind in der extrazellulären Matrix formuliert, um die Mikroumgebung des menschlichen Knochen (RBM-System) rekapitulieren gewachsen. Eingebettet in der extrazellulären Matrix werden die Zellen mit Nährstoffen durch das Medium, ergänzt mit Humanplasma zugeführt wird, wodurch ein umfassendes System, bei dem das Überleben der Zelle und die Proliferation kann für bis zu 30 Tage aufrechterhalten werden, während die zelluläre Zusammensetzung des primären Gewebes. Mit der rBM System haben wir erfolgreich primäre Knochenmarkszellen von normalen Spendern und Patienten mit Amyloidose und verschiedenen hämatologischen Malignomen gewachsen. Die rBM System ermöglicht direkte, in-Matrix Echtzeit-Visualisierung des Zellverhaltens und Bewertung von präklinischen Wirksamkeit neuer Therapeutika. Darüber hinaus können Zellen aus dem rBM isoliert und anschließend zur in vivo-Transplantation, Zellsortierung, Durchflusszytometrie und Nukleinsäure-und Proteinanalyse. Zusammengenommen stellt die rBM Verfahren ein zuverlässiges System für das Wachstum von primären Knochen marrow Zellen unter physiologischen Bedingungen.

Da primäre Knochenmarkszellen nicht, unter Standard-Zellkulturbedingungen vermehren, wurde die rBM System geschaffen, um genau imitieren die Knochen-Mikroumgebung, die Bereitstellung eines Systems zur Kultur und zu erweitern BM Zellen ex vivo. Die Hauptkomponenten der extrazellulären Matrix BM, Fibronectin, Kollagen I, Kollagen IV, Laminin und 21 wurden in rBM Matrix eingebaut, um die strukturelle Gerüst des 3-D-Kultur bereitzustellen. Endosteum, die Schnittstelle zwischen dem Knochen und dem BM, ...

Watch this Scientific Journal Video about A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies at JoVE.com

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

In Standardkulturverfahren, Zellen aus ihrer physiologischen Umgebung genommen und auf die Kunststoffoberfläche einer Schale gezüchtet. Um das Verhalten von primären humanen Knochenmarkzellen untersuchen wir eine 3-D-Kultur-System, wo Zellen unter Bedingungen rekapituliert die native Mikroumgebung des Gewebes gewachsen erstellt.

Eine dreidimensionale Zellkulturmodell zu primären humanen Knochenmark und seine Malignome Studieren

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

a-three-dimensional-tissue-culture-model-to-study-primary-human-bone

Research

JoVE Journal

Medicine

16.5K Aufrufe.  Purdue University.  In Standardkulturverfahren, Zellen aus ihrer physiologischen Umgebung genommen und auf die Kunststoffoberfläche einer Schale gezüchtet. Um das Verhalten von primären humanen Knochenmarkzellen untersuchen wir eine 3-D-Kultur-System, wo Zellen unter Bedingungen rekapituliert die native Mikroumgebung des Gewebes gewachsen erstellt. 

Serie: A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Menschliche neuroendokrinen Tumor-Zelllinien als dreidimensionales Modell für das Studium der menschlichen neuroendokrinen Tumor-Therapie

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Forschung

Medizin

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

Primäre Kultur der Menschen vestibuläre Schwannome

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Dreidimensional Kulturen: Ein Werkzeug, um Architektur zu studieren Normale acinar gegen maligne Transformation von Brustzellen

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantifizierung der Brustkrebs-Zelle Invasivität Mit einem Drei-dimensionale (3D) Modell

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Oberschenkelknochenmark-Aspiration im Live-Mäuse

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Dreidimensionale Co-Kultur-Modell für Tumor-Stroma-Interaktion

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Dreidimensionale Alginat-Perle Kultur der Menschen Hypophysenadenom Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Dreidimensionale Kulturtest auf Krebszelle Invasivität und Satelliten Tumorbildung erkunden

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit Draht Myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...