Wir geben besonderen Dank an Yves Couder für viele hilfreiche Diskussionen. Wir danken Atef Asnacios zur Kalibrierung der Ausleger und Diskussion. Wir danken Lisa Willis, Elliot Meyerowitz und Oliver Hamant für das kritische Lesen. Diese Arbeit wurde zum Teil von Human Frontier Science Program RGP0062/2005-C Zuschuss finanziert werden; der Agence Nationale de la Recherche-Projekte Growpec&#39;&#39;,&#39;&#39; und&#39;&#39;&#39;&#39; Mechastem.

1. Bereiten Glasobjektträger für die Montage Proben <ol><li> Bereiten Einbettung Agarose Mittel: 0,7% niedrig schmelzender Agarose in 10% Mannit (in Wasser). </li><li> Mit einem starken Metallinstrument (zB Bohrerspitze, Kalk), ätzen ein 0,5 x 0,5 cm-Bereich in der Mitte eines Mikroskopie Glasträger. Oder statt, kleben Sie ein kleines Stück der Glaslamelle (ca. 20 x 200 um) auf die Glasobjektträger mit Araldite Leim. ANMERKUNG: Diese raut die Oberfläche, um die Haftung der Agarose zu erleichtern, damit die Agarose Medien Sticks oder Korrekturen an der Folie. Diese Folie kann wiederverwendet werden. </li><li> Positionieren eines Tröpfchens von 20 &amp;mgr; l Agarose-Einbettungsmedium auf dem geätzten Bereich des Objektträgers. Dies ergibt eine Dünnschicht aus Agarose. </li><li> Bewahren Sie die Glasobjektträger in einer feuchten Box und warten, bis die Agarose-Medien zu verfestigen. </li></ol> 2. Zergliedern und Montage Meristem Proben <ol><li> Microdissect Meristemen für konfokale Phantasieng: Entfernen Sie die Blütenknospen eines nach dem anderen aus dem Stamm, indem Sie sie mit ultra feinen Pinzette nach unten. Es ist wichtig, alle Blütenknospen an den Knospen, die nicht Kelchblätter nicht aufweisen (dh der P1 Primordia 14) entfernen sich. </li><li> Mit einer Rasierklinge oder die Spitze der Pinzette, schneiden Sie den Meristem vom Stamm. Der Schnitt sollte parallel zu dem Bereich der Meristem Oberfläche, die mit dem AFM gemessen werden soll. Das erhaltene Spitze sollte zwischen 300 &amp;mgr; m und 600 &amp;mgr; m hoch, unter der AFM-Spitze zu passen. </li><li> Drücken Sie die Spitze in den Film der in Schritt 1.1.4 vorbereitet Agarose-Medien. Wählen Sie eine Position auf dem Objektträger / Agarose und drücken Sie vorsichtig, so dass das Meristem ist sowohl direkt in Kontakt mit dem Objektträger aus Glas und ragt aus dem Agarose. Es ist entscheidend, die Meristem in der Agarose in den wenigen Sekunden, die seinen Schnitt von dem Schaft folgen positionieren. Hinweis: Dies ist, um das Austrocknen zu verhindern Meristem aus. In dieser Phase wird das Meristem in einem crac zu stehenk, weil die Agarose bei Anwendung von Druck zerbrochen. </li><li> Bereiten mehrere Meristeme diese Weise für Batch-Bildgebung, vorausgesetzt, sie haben die gleiche Höhe aufweisen und weniger als 500 um voneinander auf der Folie angeordnet ist. Halten Sie die vorbereitet Meristeme in der feuchten Feld während Sezieren weitere Proben. HINWEIS: Es begrenzt die Änderung, die von der Kalibrierung. Idealer 2 Proben jeder Bedingung könnte vorbereitet und zufällig gemessen werden. Bisher gibt es keine Wirkung beobachtet von Batch-Bildgebung auf der Messung (Stress-induzierten Antwort). Dies dank der Verdünnung des Spannungssignalmoleküle in den Agar und / oder der Montage Lösung. Alternativ kann die Spannung ist die gleiche, unabhängig auf die Menge der Probe hergestellt. </li><li> Bevor wir zum nächsten Schritt, um sicherzustellen, dass die Grenze zwischen dem Meristem und die Blütenknospen trocken ist. Wenn nicht, entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Wasser mit Filterpapier. Dies sollte in der nächsten Stufe zu verhindern, daß das geschmolzeneAgarose flutet die Probe aufgrund der Kapillarwirkung Kräfte. </li><li> Mit einem 20 ul Pipette genug geschmolzen Montage Agarose in den Riss im Schritt 1.2.3 erstellt zu füllen. und jede Meristem zu umgeben. Die Agarose sollte das Niveau der Narbe des entfernten Blütenknospe (Primordium) zu erreichen. Um dies zu erreichen, kann es notwendig sein, Agarose an jedem Ende des Risses hinzuzufügen. </li><li> Wenn die Agarose hinzugefügt wird, wird es schnell in den Riss überfluten; mit der Pipette absaugen Teil der geschmolzenen Agarose-Montage, um sicherzustellen, dass das Meristem ist der höchste Punkt auf der Folie. Dieser behebt das Meristem, so dass es nicht während der Bildgebung zu bewegen. </li></ol> 3. Montage Root-oder Hypokotyl Proben <ol><li> Für Wurzeln und Keimstengel, keine Präparation erforderlich. In dem dünnen Film aus Agarose auf die vorbereitete Objektträger, einen Nut direkt oberhalb einer Ätzung in dem Glas oder auf einer Glaslamelle. Positionieren Sie die Wurzel oder Hypokotyl in dieser Nut sicherzustellen, dass sie in Kontakt mit der istGlas in seiner ganzen Länge. </li><li> Bevor wir zum nächsten Schritt, um sicherzustellen, dass die Probe trocken ist, an seiner Oberfläche. Wenn nicht, entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Wasser mit Filterpapier. </li><li> Montage Agarose geschmolzen um die Probe, wie in Schritt 1.2.6 hinzufügen. </li></ol> 4. AFM Vorbereitung und Empfindlichkeitskalibrierung (JPK Nanowizard für eine AFM) <ol><li> Montieren Sie einen Ausleger auf der AFM. Der Ausleger sollte mit runder Eindringkörper montiert werden. Der Radius wird die x, y, z-Auflösung und die Eindringtiefe in dem eine genaue Messung archiviert werden konnten bestimmen. <ol><li> Um meso-nanoskalige Messungen an der Epidermis der Oberfläche nehmen, verwenden Sie eine 50 nm Radius runden Stempels; zu mesoskaligen Messungen, verwenden Sie eine 0,5 um Radius rund Eindringkörper; zu Mikro Messungen (über 2-3 Zellen), verwenden Sie eine 2,5 um Radius rund Eindringkörper. </li></ol></li><li> Positionieren Sie den Laser an der Spitze des Auslegers. Ausrichten des Lasers auf die Mittelder Entführer mit dem Spiegel. </li><li> Positionieren Sie ein sauberes Glas unter den AFM. HINWEIS: Das folgende ist eingestellt, um das Signal der Laserposition auf der AFM-Rezeptor in einer Verformung des Auslegers zu verändern und, durch Auswertung der Federkonstante des Cantilevers, um es in eine Kraft umzusetzen. </li><li> Anfahren mit einem Zielkraft &quot;Sollwert&quot; von 1 V. </li><li> Wählen Sie &quot;Kraftspektroskopie&quot;. Tun eine Vertiefung durch Einstellen der maximalen &quot;relative Sollwert&quot; auf 2 V, die &quot;erstrecken Geschwindigkeit&quot; auf 40 um / s, und die &quot;Länge z&quot; bis 5 um. </li><li> Wählen Sie im Menü &quot;Calibration Manager&quot;, wählen Sie den linearen Teil der Terminkurve, um die Empfindlichkeit mit dem &quot;fit Bereich wählen&quot;-Button passen. Die &quot;relative Sollwert&quot; vom &quot;Volt&quot; auf &quot;Meter&quot; umgewandelt werden. </li><li> Wählen Sie im Menü &quot;Calibration Manager&quot;, wählen Sie &quot;Federkonstante&quot;, um die el bewertenasticity des Auslegers mit thermischen Fluktuationen. Drücken Sie auf &quot;Ausführen&quot;, um die spektrale Dichte Grundstück des Auslegers zu erhalten. Finden Sie die Resonanzspitze mit der niedrigsten Frequenz. Setzen Sie es mit dem &quot;fit Bereich auswählen&quot; klicken. Hinweis 1: Für weitere Informationen über die thermischen Fluktuationen Tuning, lesen Koch et al 15. Hinweis 2: Es ist besser, eine direkte Methode verwenden, um die Elastizität des Auslegers bewerten mit Hilfe eines Referenzbiegebalken (oder Material mit bekannten Steifigkeit). Der hier verwendete wurde freundlicherweise von Atef Asnacios 16 gespendet. </li><li> Geben Sie 200 ul 10% Mannit-Lösung unter der Auslegerspitze. Richten des Lasers, um die Mitte der Fänger mit dem Spiegel. </li><li> Kalibrieren Sie die Empfindlichkeit: aus dem Menü &quot;Calibration Manager&quot;, klicken Sie auf den &quot;unbekannten&quot;-Taste; wiederholen Sie die Schritte 2.3 bis zum 2.5. </li></ol> . 5 Datenerfassung: Scheinbarer Elastizitätsmodul Kartographie <ol&gt; <li> Positionieren Sie die montierten Proben unter der AFM und fügen Sie eine 500 ul Tröpfchen von 10% Mannit-Lösung auf die Probe. Die Mannitollösung plasmolyzes die Zellen innerhalb von Minuten. </li><li> Anfahren mit einem Zielkraft (&quot;set point&quot;) von 20 nN (&quot;set point&quot; sollte nicht mehr als 3 V liegen) </li><li> Gedankenstrich mit einer &quot;relativen Sollwert&quot; von 200 nN, ein &quot;erstrecken Geschwindigkeit&quot; von 40 &amp;mgr; m / sec, und &quot;z Länge&quot; 5 um. </li><li> Stellen Sie die &quot;relative Sollwert&quot;, um eine Vertiefung von 100 nm für die 200 nm Freischwinger oder 0,5 um für die 1 um / 5 um montierten Ausleger montiert zu erhalten. </li><li> In &quot;Kraft-Mapping&quot;-Modus, wählen Sie eine Region, um zu scannen: für Meristeme, 70 um x 70 um mit einer Auflösung (&quot;Pixel&quot;) von 64 x 64; für Hypokotylen und Wurzeln, 100 um · 100 um mit einer Auflösung von 64 x 64. </li><li> Drücken Sie Scannen, um die Experimente zu starten. Speichern Sie die Ausgabe. </li&gt; </ol> . 6 Datenanalyse: Scheinbarer Elastizitätsmodul Berechnungen <ol><li> Öffnen Sie die Datei in der Datenanalyse-Software. </li><li> Wählen Sie &quot;Stapelverarbeitung&quot;, um die gleiche Analyse für alle Kurven einer einzigen Karte beantragen. </li><li> &quot;Korrigieren der Höhe der Biegung des Auslegers&quot;, damit die Eindringtiefe zu extrahieren. </li><li> Option &quot;Elastizitätsmodul fit-Funktion&quot;, die annehmen, wird die Kraft ist proportional zu der Fläche der Einbuchtung. Stellen Sie die &quot;Spitzenform&quot; parabolischer anzunehmen, dass die Vertiefung Form ist ein parabolisch. </li><li> Geben Sie den Radius der Spitze. </li><li> Vorzugsweise Wählen Sie die &quot;Rückzugs&quot;-Kurve für die Analyse, weil sie weniger empfindlich auf Topographie als die &quot;extend&quot;-Kurve. Allerdings, wenn es erhebliche Verkleben der Sonde während des &quot;Rückzugs&quot;, benutzen Sie die &quot;verlängern&quot;-Kurve, die unempfindlich gegenüber kleben ist. </li><li> Setdas Poisson-Verhältnis von 0,5. Drücken Sie auf zu analysieren und speichern Sie die Ausgabe. </li></ol>

<ol>
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A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> PLoS. 8, e57813 (2013).</li><li>Asnacios, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanics+behind+cell+polarity.">The mechanics behind cell polarity.</a> Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).</li><li>Meister, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FluidFM:+combining+atomic+force+microscopy+and+nanofluidics+in+a+universal+liquid+delivery+system+for+single+cell+applications+and+beyond.">FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond.</a> Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).</li><li>Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ball+tonometry:+a+rapid,+nondestructive+method+for+measuring+cell+turgor+pressure+in+thin-walled+plant+cells.">Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells.</a> Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).</li><li>Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulator+or+driving+force?+The+role+of+turgor+pressure+in+oscillatory+plant+cell+growth.">Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth.</a> PloS one. 6, e18549 (2011).</li><li>Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. 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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In Pflanzen spielen wechselnden mechanischen Eigenschaften eine wichtige Rolle bei der Leitung Wachstum und Morphogenese. Bis heute hat es große Fortschritte in der Entschlüsselung der genetischen und chemischen Netzwerke, die das Pflanzenwachstum zu kontrollieren, aber unser Wissen, wie diese Netzwerke beitragen, und sind durch Veränderungen der mechanischen Eigenschaften betroffen ist rudimentär. Diese Methode sollte es uns ermöglichen, diese Lücke zu füllen, und so sollte es ein starkes Interesse an Wissenscha...

Wachstum der Pflanzen wird durch die koordinierte Ausdehnung der starren Zellwänden, die jede einzelne Zelle des Organismus umgibt erreicht. Zunehmend Hinweise darauf, zeigt, dass es durch die Modifikation der Zellwand der Chemie, dass Pflanzen lokal diese Expansion zu steuern. Die Expansion wird angenommen, dass in erster Linie durch Druck auf den Zellwänden von hohen Turgor der Zelle verursacht angetrieben zu werden; Dieser Stamm Reaktion auf Turgor wird durch die mechanischen Eigenschaften der Zellwände 1 geregelt. Wenig ist von dieser mechanischen Eigenschaften bekannt und wie sie während der Entwicklung ändern. Weiterhin ist wenig wie diese mechanischen Eigenschaften gesteuert werden, und ob erteilen tragen zur Zellwandchemie in einer Weise, die offensichtlich in einer Gewebe koordiniert verändern bekannt. Wenn wir die Verbindung zwischen chemischen und mechanischen Veränderungen in der Pflanzenzellwände während der Entwicklung, und schließlich, wie diese mikroskopischen Wechselwirkungen regieren ein Werk verstehen&#39;S makroskopischen Wachstums, eine Methode, die die mechanischen Eigenschaften der Zellwände bei der Entwicklung von Organen an der Zell-oder Gewebe Maßstab überwachen erforderlich. Die Rasterkraftmikroskopie (AFM)-Methode hier beschrieben, die auf Mikrometer-oder Nanometergewebekompressionen oder Vertiefungen basiert, wurde entwickelt, um genau die mechanischen Eigenschaften der Zellwände in der Entwicklung gleichzeitig Organe auf subzellulärer Auflösungen und über ganze Regionen des Gewebes zu messen. Andere Methoden entweder eine Auflösung, die zu niedrig oder zu hoch ist: das Extensometer ist nur in der Lage, die durchschnittlichen mechanischen Eigenschaften eines ganzen Gewebes an der Millimeter-Skala 2-4, einer Skala, die beispielsweise zu groß, um in frühen Ereignisse zu messen, ist zu messen Organogenese; die Mikroindenter können Messungen an subzellulärer Auflösung im Nanometerbereich, aber es wird in den Messzellen isoliert und nicht Gruppen von Zellen oder Organen 5-7 beschränkt. Mit der AFM, die erforderlichd Gewebe, Zell und subzellulärer Auflösungen 8-10 erreicht werden. Kürzlich mehrere Protokolle wurden speziell entwickelt, um Mechanismen der Gewebe Pflanzen, die auch verwendet werden könnte, 11, 12 zu messen. Wir werden hier präsentiert, wie die Elastizität des Gewebes durch Messung der scheinbaren Elastizitätsmodul 13 zu beurteilen. Der Elastizitätsmodul wird häufig verwendet, um die Steifigkeit eines Materials zu beschreiben. Während kleine Verformung der erforderlich ist, um ein Material zu verformen Kraft ist proportional zur Fläche des Eindrucks. Der E-Modul ist dieser Koeffizient. Im Fall einer kontinuierlichen homogenen Material die gleichen Koeffizienten unabhängig von der Einrückung Typ (Größe und Form) gemessen werden, jedoch wird mit der Geschwindigkeit der Messung verändern. Im Falle der komplexen Struktur von Pflanzen Gewebe haben wir so weit, dass die Kraft proportional zu der Deformation, die die Bestimmung der beobachtetenein Koeffizient der Verhältnismäßigkeit, die wir nennen &quot;scheinbare Elastizitätsmodul&quot;. Im Gegensatz von kontinuierlichen Medien in den Pflanzen ist diese scheinbare Elastizitätsmodul empfindlich auf die Größe der Vertiefung. Es muss nicht auf die jungen Moduli eines reinen Zellwand entsprechen. Es beschreibt die beste Elastizität des Gerüsts der Zellwand des Gewebes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="850">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">NanoWizard</td>
			<td style="width:167px;">All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM stage</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">CellHesion</td>
			<td>Required for sample withe low topography (les then 11&#181;m between the lowest and the highest point in the aria of force scanning).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM optics</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">Top View Optics&#160;</td>
			<td>Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereo Microscopes&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M125</td>
			<td>Any type of stereo microscopes could do.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">150nm mounted cantilever&#160;</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">R150-NCL-10</td>
			<td>To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1&#181;m mounted cantilever&#160;</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td>SD-Sphere-NCH-S-10&#160;</td>
			<td>to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tipless cantiliver</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td>TL-NCH-20&#160;</td>
			<td>to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5&#181;m mounted cantilever. We attached a 5&#181;m borasilicate bead to a tipless cantiliver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5&#181;m silicon microspheres</td>
			<td style="width:348px;">Corpuscular</td>
			<td style="width:119px;">C-SIO-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aradilte&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Bartik S.A. 77170 Coubet France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;low melting Agarows</td>
			<td style="width:348px;">Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410</td>
			<td style="width:119px;">BP160-100</td>
			<td>34-45 Gelation Temperature</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">D-Mannitol</td>
			<td style="width:348px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA)</td>
			<td style="width:119px;">M4125-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">2&#160; Stainless Steel No. 5 Tweezers</td>
			<td style="width:348px;">Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland&#160;</td>
			<td align="right">951199</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

afm-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions

Wir beschreiben eine kürzlich entwickelte Methode, um die mechanischen Eigenschaften der Oberflächen von Pflanzengeweben für ein JPK AFM-Messung mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie (AFM) Mikro / Nano-Vertiefungen. Insbesondere wird in diesem Protokoll wir das scheinbare Elastizitätsmodul der Zellwände zu messen subzellulären Auflösungen in den Regionen von bis zu 100 &amp;mgr; m × 100 &amp;mgr; m in Blütenmeristemen, Hypokotylen und Wurzeln. Dies erfordert eine sorgfältige Vorbereitung der Probe, die richtige Auswahl der Mikro-Eindringkörper und Eindringtiefen. Um die Zellwand nur Eigenschaften werden Messungen in hochkonzentrierten Lösungen von Mannitol, um die Zellen plasmolysieren beseitigen und damit den Beitrag der Zelle Turgor geführt ausmachen. Im Gegensatz zu anderen vorhandenen Techniken, durch die Verwendung unterschiedlicher Eindringkörpern und Eindringtiefen ermöglicht dieses Verfahren die gleichzeitige Multiskalen-Messungen <em&gt; Dh bei subzellulärer Auflösungen und über Hunderte von Zellen, die ein Gewebe. Dies bedeutet, dass es nun möglich ist, räumlich-zeitlich charakterisieren die Veränderungen in den mechanischen Eigenschaften der Zellwände während der Entwicklung zu nehmen, so dass diese Änderungen mit Wachstums-und Differenzierungs korreliert werden. Damit ist ein wichtiger Schritt, um zu verstehen, wie koordinierte mikroskopischen Zellveränderungen bewirken makroskopischen morphogenetischen Ereignisse. Es bleiben jedoch mehrere Einschränkungen: Das Verfahren kann nur für relativ kleine Proben (etwa 100 um Durchmesser) und nur an äußeren Gewebe verwendet werden; die Methode ist empfindlich, um Gewebe Topographie; sie misst nur bestimmte Aspekte des Gewebes komplexen mechanischen Eigenschaften. Die Technik wird schnell entwickelt, und es ist wahrscheinlich, dass die meisten dieser Beschränkungen werden in naher Zukunft gelöst werden.

In Abbildung 1 stellen wir typische Junge Module Karten Blütenmeristemen (1A und 1B), jung und alt Hypokotylen (1C-F) und Wurzelspitzen (1G und 1H). Bei allen Versuchen der Eindringkörper ist halbkugelförmig, aber seinen Radius unterscheidet, so dass verschiedene räumliche Auflösungen erreicht werden kann 1C und 1D zeigen typische Ergebnisse für meso-nanoskaligen Eindringkörper (...

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AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

AFM-basierte Mapping der elastischen Eigenschaften der Zellwände: auf der Tissue-, Handy-und subzellulärer Beschlüsse

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Aufrufe.  Université Paris Diderot. We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Serie: AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Forschung

Biologie

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Single Molecule Methoden zur Überwachung von Veränderungen in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

Umfassende Analyse der Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwänden (Lignozellulose) Teil II: Kohlenhydrate

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Spannung und Calcium Dual Channel Optical Mapping von Cultured HL-1 Vorhofmuskelzellen Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

Dissektion der Auditory Bulla in postnatale Mäuse: Die Isolierung der Gehörknöchelchen und histologische Analyse

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Analyse der Beta-Zellfunktion mit einzelligen Auflösung Kalzium Imaging im Zebrafisch Inselchen

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Hochauflösende Live-Cell-Bildgebung subzellulärer Strukturen

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic properties. Density is a cell type identifying property, directly related to its metabolic rate, differentiation, and activation status. Magnetic levitation allows a one-step approach to successfully separate, image and characterize circulating blood cells, and to detect anemia, sickle cell disease, and circulating tumor cells based on density and magnetic properties. This approach is also amenable to detecting soluble antigens present in a solution by using sets of low- and high-density beads coated with capture and detection antibodies, respectively. If the antigen is present in solution, it will bridge the two sets&#160;of beads, generating a new bead-bead complex, which will levitate in between the rows of antibody-coated beads. Increased concentration of the target antigen in solution will generate a larger number of bead-bead complexes when compared to lower concentrations of antigen, thus allowing for quantitative measurements of the target antigen. Magnetic levitation is advantageous to other methods due to its decreased sample preparation time and lack of dependance on classical readout methods. The image generated is easily captured and analyzed using a standard microscope or mobile device, such as a smartphone or a tablet.

This paper describes a magnetic levitation-based method that can specifically detect the presence of antigens, either soluble or membrane-bound, by quantifying changes in the levitation height of capture beads with fixed densities.

Quantifizierung zellulärer Dichten und antigener Eigenschaften mittels Magnetschwebebahn

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...