Die Autoren danken der Rioja Salud Foundation (Fondos FEDER) und dem spanischen Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00). Cristina Romero Aranda wird durch ein Stipendium der AECC (Asociación Española Contra el Cáncer) finanziert.

1. C. elegans auf Petrischalen anbauen
<ol><li>Bereiten Sie NGM-Platten vor und säen Sie sie mit E. coli OP50 als Nahrungsquelle aus (Abbildung 1). Züchten und pflegen Sie C. elegans wie beschrieben17. Die ausgesäten Teller bis zu einem Monat bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Stellen Sie die Platten auf die gewünschte Temperatur ein, bevor Sie die Würmer hinzufügen.<ol>
<li>Um die Würmer zu übertragen, entfernen Sie ein Stück Agar von einem alten Teller und legen Sie es auf einen frischen Teller.</li>
		<li>Alternativ können Sie einzelne Tiere mit einem sterilen Wurmpicker (ein 1-Zoll-Stück 32-Gauge-Platindraht mit abgeflachter Spitze, montiert an der Spitze einer Pasteur-Pipette) fangen und auf die neue Platte legen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Züchten Sie die Würmer bei der gewünschten Temperatur.<ol>
<li>Züchten Sie C. elegans Würmer bei 20 ° C, der Standardtemperatur. Um jedoch die Entwicklung thermosensitiver Mutanten zu analysieren, führen Sie eine Inkubation über Nacht durch, normalerweise bei 25 ° C. Passen Sie die Dauer und Temperatur dieser Inkubation nach Bedarf an, abhängig von der spezifischen Mutante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bereiten Sie die 4D-Mikroskopieaufzeichnung vor, bevor Sie die Embryonen montieren (Abbildung 2)
<ol><li>Richten Sie das Mikroskop und die Temperaturkontrolle ein, bevor Sie den Embryo vorbereiten. C. elegans Embryonen teilen sich sehr schnell. Bereiten Sie sich darauf vor, sofort nach dem Einsetzen der Embryonen mit der Aufzeichnung zu beginnen.</li>
	<li>Stellen Sie die Aufnahmetemperatur entweder auf 15 °C, 20 °C oder 25 °C ein.<ol>
<li>Zeichnen Sie die Embryonen routinemäßig bei 25 ° C auf. Zeichnen Sie thermoempfindliche Mutanten bei der restriktiven Temperatur auf, um ihre Phänotypen zu zeigen. Zeichnen Sie eine WT-Steuerung (wenn sie in einer anderen Vorbereitung durchgeführt wird) bei der gleichen Temperatur wie die Mutanten auf. HINWEIS: WT-Embryonen entwickeln sich schneller bei 25 °C und langsamer bei 15 °C ohne zusätzliche Unterschiede in der Zelllinie. Stellen Sie Mikroskope in einen temperaturkontrollierten Raum. Eine zusätzliche Steuerung durch Kühlen oder Erwärmen des Objektträgers ist sehr wünschenswert. Dies kann erreicht werden, indem Wasser bei einer bestimmten Temperatur durch einen Metallring um das Mikroskopobjektiv und den Kondensator zirkuliert. Das Objektiv und die Aufbereitung stehen in direktem Kontakt durch das Tauchöl und die Temperaturübertragung ist effizient. Dieses System ermöglicht eine präzise Steuerung der Aufzeichnungstemperatur und die Durchführung von Temperaturverschiebungen während der Embryonalentwicklung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definieren Sie die Aufzeichnungsparameter in der Mikroskopie-Software.<ol>
<li>Für eine Standardaufzeichnung von C. elegans (ohne fluoreszierende Scans) wählen Sie: Z-Stacks von 30 Fokusebenen in einem Abstand von jeweils 1 Mikrometer. 30-Sekunden-Intervalle zwischen dem Beginn jedes Z-Stacks. 1500 Z-Stacks (12,5 Stunden Aufzeichnung). HINWEIS: Sowohl kommerzielle als auch Open-Source-Mikroskopsteuerungsprogramme können verwendet werden, um diesen Workflow für die Aufnahme von Bildern zu definieren. Jetzt ist das Mikroskop bereit für die Aufnahme.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Bereiten Sie die Embryonen vor und montieren Sie sie
<ol><li>Bereiten Sie ein dünnes, homogenes Agar-Pad als ersten Schritt vor, um ein schönes Bild zu erhalten (Abbildung 3).<ol>
<li>Bereiten Sie 50 ml einer 4,5% igen Agarlösung in entionisiertem Wasser vor. In der Mikrowelle zum Kochen erhitzen und 0,5 – 1 ml in 3 ml Glasröhrchen gießen.</li>
		<li>Verschließen Sie die Tuben vorsichtig mit Wachsfolie, um eine Austrocknung zu vermeiden. Versiegelte Agarröhrchen können bei Raumtemperatur bis zu zwei Monate gelagert werden.</li>
		<li>Auf dem Labortisch befindet sich ein Heizblock bei 80 °C mit: ein Reagenzglas aus reinem Vaseline (geschmolzen), mit einem feinen Pinsel im Inneren. ein Reagenzglas mit destilliertem Wasser, das eine Pasteur-Pipette enthält. HINWEIS: Dies stellt sicher, dass alle erforderlichen Materialien heiß sind und das Agar bei der Herstellung des Pads nicht erstarrt.</li>
		<li>Entfernen Sie die Wachsfolie von der Oberseite einer der Agarröhrchen und erhitzen Sie sie vorsichtig über einem Alkoholbrenner, um den Agar zu schmelzen. Seien Sie vorsichtig, da heißer Agar, der aus der Glasröhre ausgestoßen wird, Verbrennungen verursachen kann.</li>
		<li>Sobald das Agar geschmolzen ist, legen Sie das Rohr in den Hitzeblock, um das Agar in flüssiger Form zu halten.</li>
		<li>Alternativ können Sie die Agarröhrchen 1 Stunde vor dem Experiment in den Wärmeblock legen, um sie ohne Brenner zu schmelzen. Das geschmolzene Agar sollte nach einem Tag entsorgt werden.</li>
		<li>Legen Sie einen Objektträger (Objektträger A) zwischen zwei andere auf ein Stück Plastik.</li>
		<li>Nehmen Sie eine weitere Folie (Folie B) und halten Sie sie mit den Fingern in einer Hand.</li>
		<li>Legen Sie dagegen einen kleinen Tropfen geschmolzenen Agar mit der warmen Pasteur-Pipette in die Mitte von Folie A.</li>
		<li>Drücken Sie sofort Folie B auf den Agartropfen, um ein sehr dünnes Pad zwischen den Folien A und B zu erzeugen. Halten Sie diese Folien bis Schritt 3.2.3 zusammen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montiere die Embryonen.<ol>
<li>Sammeln Sie 5-10 gravide Hermaphroditen mit dem Pflücker und legen Sie sie in ein mit Wasser gefülltes Uhrmacherglas.</li>
		<li>Verwenden Sie ein Skalpell, um die Hermaphroditennematoden aufzuschneiden und frühe Eier (1-4 Zellen) aus der Gebärmutter unter dem Stereomikroskop zu extrahieren.</li>
		<li>Nehmen Sie die Folie aus Schritt 3.1.10 und schieben Sie Folie B vorsichtig ab, um das Agar-Pad auf Folie A freizulegen.</li>
		<li>Legen Sie ein frühes Ei in die Mitte des Agar-Pads, indem Sie es mit einem Kapillarrohr pipettieren.</li>
		<li>Alternativ können Sie einen Tropfen mit einer Reihe von Embryonen auf das Agar-Pad pipettieren und dann nach Embryonen im Frühstadium suchen. Führen Sie diesen Schritt unter dem Stereomikroskop durch.</li>
		<li>Wenn nötig, bewegen Sie das Ei, indem Sie es mit einer Wimpern anstoßen, die an das Ende eines Zahnstochers geklebt ist.</li>
		<li>Überschüssiges Wasser mit der Kapillarpipette entfernen. HINWEIS: Eine Kapillarpipette kann leicht zubereitet werden, indem eine Pasteur-Pipette über einem Alkoholbrenner erhitzt und von beiden Enden gezogen wird.</li>
		<li>Decken Sie die Zubereitung vorsichtig mit einem Deckglas ab. Um Luftblasen zu vermeiden, legen Sie eine Kante des Deckglases auf den Objektträger und schieben Sie vorsichtig ein Skalpell entlang der angrenzenden Kante, um das Deckglas langsam und schräg auf die Zubereitung zu drapieren.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Pipette, um 3/4 des Raumes, der das Agar-Pad umgibt, mit Wasser zu füllen. Lassen Sie 1/4 des Raumes mit Luft.</li>
		<li>Verschließen Sie das Deckglas mit Vaseline, um eine Austrocknung während langer Aufnahmezeiten zu vermeiden.</li>
		<li>Verwenden Sie die feine Bürste, um eine dünne Schicht geschmolzenes Vaseline um den Rand des Deckglases zu ziehen. HINWEIS: Jetzt ist die Vorbereitung bereit für die Aufnahme.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Stellen Sie den DIC ein und starten Sie die 4D-Mikroskopieaufzeichnung
<ol><li>Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch. Fokussieren Sie den Embryo mit dem Objektiv mit niedriger Vergrößerung (5x oder 10x).</li>
	<li>Wechseln Sie zum 100-fachen Tauchobjektiv.</li>
	<li>Stellen Sie die optischen Komponenten des Mikroskops ein, um ein Nomarski-Bild zu erhalten.<ol>
<li>Fokussieren Sie den Kondensator.</li>
		<li>Öffnen Sie die Öffnung des Kondensators vollständig und schließen Sie die Feldmembran (dies führt zu einer höheren numerischen Apertur und damit zu einer höheren Auflösung).</li>
		<li>Überprüfen Sie, ob beide Polarisatoren auf dem Mikroskop so ausgerichtet sind, dass sie die maximale Lichtextinktion verursachen.</li>
		<li>Drehen Sie das Wollaston-Prisma, um ein schönes dreidimensionales Bild des Embryos zu erhalten, das auf einer Seite beleuchtet ist. Drehen Sie das Prisma in die andere Richtung, um den Effekt zu erzielen, dass der Embryo auf der anderen Seite beleuchtet wird. HINWEIS: Diese Schritte können vor der Aufnahme an einem Prüfmuster durchgeführt werden, so dass nur eine Feinabstimmung an der zu analysierenden Probe erforderlich ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Starten Sie die Bildaufnahme im Mikroskop.</li>
</ol>5. Analysieren Sie den 4D-Film (Abbildung 4).
HINWEIS: Sobald die Aufzeichnung abgeschlossen ist, verwenden Sie eine Software zur Verfolgung der Zelllinie, um die Zelllinie zu rekonstruieren und zu analysieren.
Cell Lineage Tracing Software ist ein leistungsfähiges Werkzeug für detaillierte Analysen der Embryonalentwicklung oder Dynamik in Zellkulturen oder Gewebefragmenten. Das Programm extrahiert und quantifiziert mehrere Datensätze über die Zelldynamik der Probe, die die Generierung der vollständigen Zelllinie jeder einzelnen aufgezeichneten Zelle umfassen, einschließlich Zellteilungen, Zellzykluslänge, Migration oder Apoptose sowie ihrer Kinetik. Darüber hinaus kann die Zelldifferenzierung durch die morphologischen Veränderungen der Zelle oder durch die Expression spezifischer Marker erreicht werden. Grundsätzlich zeigt der Softwarebildschirm zwei Fenster an: Im linken Fenster kann der 4D-Film vorwärts und rückwärts oder auf und ab bis zur oberen oder unteren Ebene abgespielt werden, so dass jede Zelle während der gesamten Aufnahme in Zeit und Raum verfolgt werden kann. Auf der rechten Witwe wird die Zelllinie erzeugt. Ein Klick auf einen Zellkern im 4D-Film erzeugt einen Punkt im Linienfenster, der die Informationen des Zellnamens, des Schicksals und der räumlichen Koordinaten speichert. Die Zelllinie einer bestimmten Zelle wird erzeugt, indem der 4D-Film vorwärts abgespielt und regelmäßig auf den Kern geklickt wird, um die Mitose dieser bestimmten Zelle im Laufe der Zeit zu markieren. Die Wiederholung dieses Prozesses für jede der aufgezeichneten Zellen erzeugt die vollständige Zelllinie des Embryos oder der Probe. Die gespeicherten Informationen für die räumlichen Koordinaten jeder Zelle werden später verwendet, um 3D-Embryonenmodelle und Zellmigrationspfade zu rekonstruieren.
<ol><li>Öffnen Sie die Linienverfolgungssoftware und erstellen Sie ein neues Projekt, indem Sie zum oberen Balkenmenü gehen und Folgendes auswählen: Datei | Neues Projekt.</li>
	<li>Wählen Sie je nach Aufzeichnungstemperatur die Zelllinienvorlage aus: DB08 für die Aufzeichnung bei 25 °C, DB10 für die Aufzeichnung bei 20 °C und DB12 für die Aufzeichnung bei 15 °C.</li>
	<li>Stellen Sie die Aufzeichnungsparameter im sich abzeichnenden Fenster ein: Scananzahl (normalerweise 1500), Zeit zwischen den Scans (30 Sekunden), Pegelanzahl (30) und Abstand zwischen den Pegeln (1 Mikrometer).</li>
	<li>Wählen Sie die Bilddatei und das Format aus.<ol>
<li>Wählen Sie das Bildverzeichnis aus, in dem die Bilder gespeichert wurden.</li>
		<li>Wählen Sie, ob Bilder als Einzelbilder (ein Bild pro Level und Zeit) oder als Multi-Image-Z-Stacks gespeichert werden sollen.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Dateibenennung und das Bildformat. Routinemäßig werden einzelne Bilder unter den folgenden Namen gespeichert: X0000L00C1 (für Scan 0, Level 0, Kanal 1) X0000L01C1 (für Scan 0, Level 1, Kanal 1) X0000L02C1 (für Scan 0, Level 2, Kanal 1) ... X0001L00C1 (für Scan 1, Level 0, Kanal 1) X0001L01C1 (für Scan 1, Level 1, Kanal 1) ... X0300L04C1 (für Scan 300, Level 4, Kanal 1) ... HINWEIS: Das Speichern der Bilder in einem komprimierten Format spart Platz auf Ihrer Festplatte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definieren Sie die Lichtkanäle: 1 für DIC-Optiken, 2 für GFP, 3 für RFP usw. Fügen Sie diejenigen hinzu, die in der 4D-Aufnahme verwendet wurden. Klicken Sie auf "Kanalverarbeitung aktiviert", um sie zu erkennen.</li>
	<li>Beginnen Sie, die Zelllinie des Embryos zu verfolgen. Der Bildschirm enthält jetzt zwei Hauptfenster: das Videofenster und das Zellenlinienfenster.<ol>
<li>Wählen Sie im Linienfenster einen Linienzweig aus und klicken Sie mit der Maus auf den Zellkern, der dieser Zelle im Videofenster entspricht.</li>
		<li>Folgen Sie der Zelle räumlich und im Laufe der Zeit, indem Sie den 4D-Film vorwärts, rückwärts oder eine Ebene höher oder unten mit den Cursortasten abspielen.</li>
		<li>Klicken Sie regelmäßig auf den Zellkern. Dadurch wird ein Punkt im Linienzweig erzeugt und die räumlichen Koordinaten der Zelle zu diesem Zeitpunkt registriert. Infolgedessen schreitet die Zelllinie voran und 3D-Rekonstruktionen des Embryos sind möglich.</li>
		<li>Markieren Sie die Mitose, indem Sie auf die Eingabetaste klicken. Wählen Sie dann eine der Tochterzellen aus und folgen Sie ihr wie zuvor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wiederholen Sie den Vorgang (Schritte 5.6.1 bis 5.6.4) für den Rest der embryonalen Zellen, um die vollständige Zelllinie zu verfolgen oder bestimmten Zellen von Interesse zu folgen, z. B. denen, die sich einer Apoptose unterziehen.</li>
	<li>Vergleichen Sie die Mutantenlinie mit der stereotypen WT C. elegans-Zelllinie.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).</li><li>Mace, D. L., Weisdepp, P., Gevirtzman, L., Boyle, T., Waterston, R. 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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Eine der größten Herausforderungen in der modernen Biologie ist das Verständnis der Entwicklung vielzelliger Organismen. C. elegans hat sich als eines der am besten geeigneten Modelle für die Untersuchung der feinen Koordination zwischen Zellproliferation und Zelldifferenzierung im sich entwickelnden Embryo herausgestellt. Aus optischer Sicht machen sein transparenter Körper und seine geringe Größe diesen Fadenwurm zu einem idealen Exemplar für die DIC-Mikroskopie. Andere Organismen mit ähnlichen Eigenschaften wurden ebenfalls einer 4D-Mikroskopie-Analyseunterzogen 11,12,13,14,15,16.
Für diese Entwicklungsstudien liefert die Geninaktivierung durch Vorwärts- oder Rückwärtsgenetik einen Hinweis auf ihre Beteiligung an der Embryogenese. Sobald nachgewiesen wurde, dass ein Gen eine Rolle bei der Entwicklung spielt, besteht der nächste Schritt darin, seine genaue Rolle bei der Festlegung des richtigen Körperplans zu definieren. Die Immunfärbung ist der gewählte Ansatz für die meisten Modelle. Diese Technik klärt Probleme bei der Zelldifferenzierung oder Expression spezifischer Marker auf. Eine wesentliche Einschränkung dieses Ansatzes besteht jedoch darin, dass er nur eine statische Ansicht des Ausdrucks eines einzelnen oder mehrerer Marker an einem festen Punkt in der Entwicklung bietet. Eine dynamische Sicht auf diese Marker während der gesamten Entwicklung kann nur durch die Färbung verschiedener Embryonen zu unterschiedlichen Zeitpunkten erhalten werden. Zudem ist eine Zelllinienrekonstruktion in solchen fixierten Proben nicht möglich.
Die 4D-Mikroskopie ist ein komplementärer Ansatz zur Untersuchung der Embryonalentwicklung. Diese Technik zeigt die Entwicklungsdynamik bei einer Auflösung auf Zellebene. Jeder Defekt im Embryo wie Probleme in der Spindelorientierung, Zellmigration, Apoptose, Zellschicksalsspezifikation usw. werden in einem 4D-Film angezeigt, der vom Forscher vorwärts und rückwärts visualisiert, quantifiziert und bewertet werden kann. Mit dieser Technik kann praktisch jede einzelne Zelle im Embryo bis zu dem Moment verfolgt werden, in dem sich der Embryo zu bewegen beginnt. Embryonen, die einer 4D-Mikroskopie mit nur sichtbarem Licht und Nomarski-Optik unterzogen werden, erleiden keine Lichtschäden. Fluoreszierende Scans können auch innerhalb der Aufzeichnung interkaliert werden, um zu erkennen, wann und wo ein Gen exprimiert wird. Embryonen, die erhebliche Lichtschäden erleiden, werden durch die Verlängerung des Zellzyklus identifiziert, die im Vergleich zu einem Standard-WT-Linienembryo starke UV-Bestrahlung verursacht. In diesem Fall können Lichtschäden reduziert werden, indem die Intensität der UV-Lampe verringert und die Kameraempfindlichkeit oder die Belichtungszeit erhöht werden. Morphologische Merkmale und molekulare Marker können helfen, die embryonale Entwicklung einer Mutante zu klären.
Die Einrichtung eines 4D-Mikroskopiesystems ist im Labor einfach zu implementieren und ermöglicht nach einiger Übung eine unübertroffene Analyse der Zelldynamik und Linienverfolgung von Zellkulturen und lebenden transparenten Proben auf einer Auflösungsebene jeder einzelnen Zelle im Mikroskopfeld. Die Zelllinienverfolgung auf DIC-Bildern wird immer noch von Hand verarbeitet. Es ist zeitaufwendig und obwohl die Software Abstammungsfehler erkennt, wie z.B. verschiedene Abstammungszweige, die dieselbe Zelle markieren, sind Fehler möglich. Während die automatische Erkennung von GFP-markierten Zellen gut entwickelt ist2, befindet sich die ergänzende Linienverfolgungssoftware, die auf unmarkierten Zellen und Bildern des sichtbaren Lichts basiert, noch im Frühstadium und ist für eine vollständige Embryonenanalyse nicht wirklich nützlich. Ohne Zweifel wird die Anwendung von Bilderkennungssystemen auf dem Gebiet der Mikroskopie des sichtbaren Lichts einen großen Fortschritt auf diesem Gebiet bringen.

Die 4D-Mikroskopie ist ein multifokales Zeitraffer-Aufzeichnungssystem, mit dem Forscher die Zelldynamik einer biologischen Probe sowohl räumlich als auch im Zeitverlauf registrieren und quantifizieren können. Zellkulturen, Hefen oder lebendes Gewebe können einer 4D-Analyse unterzogen werden, aber diese Technik eignet sich besonders für die Analyse der Entwicklung lebender Embryonen. Die Auflösung dieser Analyse erreicht das Niveau jeder einzelnen Zelle des Embryos. Jede Zellteilung kann nachgewiesen werden, und Zellbewegungen können im Laufe der Zeit verfolgt werden. Zellschicksale werden nach der Position und Form bewertet, die Zellen einnehmen. Die Verwendung von Nomarski-Optiken verstärkt den Kontrast von unbefleckten transparenten Proben durch orthogonal polarisierte Lichtstrahlen, die in der Fokusebene interferieren. Die resultierenden Bilder erscheinen dreidimensional, auf einer Seite beleuchtet.
Andere Methoden, die auf der Verwendung von konfokaler Mikroskopie und transgenen GFP-Tieren zum automatischen Nachweis von Kernen und zur Erzeugung von Zelllinien basieren, wurden entwickelt 1,2. Der Vorteil dieser Systeme liegt auf der Hand: Die Software überschreibt die Notwendigkeit, jeden Kern über einen bestimmten Zeitraum manuell zu markieren (obwohl in den späten Phasen eine gewisse manuelle Überwachung erforderlich ist). Zelluläre Prozesse mit Veränderungen der Zellform oder Membrandynamik, wie sie bei Zelldifferenzierung, Migration, Apoptose oder Leichenverschlingung auftreten, bleiben jedoch als schwarzer Hintergrund in den fluoreszierend markierten Kernbildern verborgen.
Im Gegensatz dazu zeigt die 4D-Nomarski-Mikroskopie (auch DIC-Mikroskopie genannt, Differentielle Interferenzkontrastmikroskopie) sowohl Kern- als auch Zellformänderungen, die während der Entwicklung von Wildtyp- oder Mutantentieren auftreten. Dies ermöglicht die Verfolgung von Zelllinien mit Standardmikroskopen, bei denen nur Durchlicht verwendet wird. Es besteht keine allgemeine Notwendigkeit, transgene Tiere zu verwenden, außer um spezifische Expressionsmuster zu zeigen, in diesem Fall können fluoreszierende Scans interkaliert werden. Daher könnte dies der optimale Ansatz für viele Labore sein, die an dynamischen Zellprozessen wie Embryogenese oder Apoptose arbeiten, die unter DIC-Mikroskopie 3,4,5,6,7 hervorgehoben werden können.
Für die Aufnahme mikroskopischer Bilder und die Rekonstruktion von Zelllinien, 3D-Modellen, Zellmigrationspfaden usw. in der aufgezeichneten Probe stehen mehrere flexible und benutzerfreundliche Programme zur Verfügung. In einem Standardexperiment werden Bilder in einer Reihe von Fokusebenen in einem konstanten Abstand aufgenommen, deren Anzahl von der Probendicke abhängt. Die zeitliche Auflösung der Analyse kann durch Erhöhung der Scanfrequenz optimiert werden. Es gibt praktisch keine andere Begrenzung für die Dauer der Aufzeichnung als die Computerspeicherkapazität. Zum Beispiel erfassen wir für eine C. elegans-Embryoentwicklungsanalyse routinemäßig Bilder auf 30 Fokusebenen (jeweils 1 Mikrometer-Schritt), alle 30 Sekunden für 12 Stunden.
Diese Systeme wurden auf die Analyse mehrerer tierischer Embryonen wie Caenorhabditis elegans8,9,10, Drosophila melanogaster11, anderer Nematodenembryonen12,13, Bärtierchen 14,15 und sogar früher Mausembryonen 16 angewendet. Die einzige Voraussetzung ist, einen transparenten Embryo zu haben, der sich auf dem Objektträger unter dem Mikroskop entwickeln kann.
Zusammenfassend ist die DIC-basierte 4D-Mikroskopie besonders nützlich für 1) die Analyse der Embryonalentwicklung von kleinen, transparenten Tieren: Verfolgung der Zelllinie, Zellmigrationspfade, Erstellung von 3D-Modellen usw.; 2) Definition von Genexpressionsmustern; 3) Untersuchung der Zellkulturdynamik, von Hefe bis zu menschlichen Zellen; 4) Analyse der Gewebedynamik oder der Embryonenfragmente; 5) Quantifizierung der Zelltodkinetik und des Leichenverschlings; und 6) Durchführung einer vergleichenden Phylogenieanalyse auf der Grundlage der embryonalen Entwicklungsmerkmale. Wenn Interesse an einem dieser Themen (oder ähnlichen) besteht, kann die 4D-Mikroskopie verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans (N2)&lt;/em&gt;</td><td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td><td>N2</td><td>WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans (VZ454)&lt;/em&gt;</td><td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td><td>VZ454</td><td>gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Cell Lineage Tracing software</td><td>SIMI</td><td>Simi BioCell</td><td>This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html</td></tr><tr><td>Microscope camera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca-R2</td><td>Miscroscope camera for both transmitted and UV light</td></tr><tr><td>Microscope control software</td><td>Caenotec</td><td>Time to Live</td><td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel&lt;br/&gt; Kleine Dorfstr. 9 38312 B&amp;ouml;r&amp;szlig;um, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de</td></tr><tr><td>Microscope control software</td><td>Micro-manager</td><td>Micro-manager</td><td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>Motorized microscope</td><td>Leica</td><td>Leica DM6000</td><td>Motorized upright microscope to perform 4D microscopy</td></tr><tr><td>Standard equipment in a Molecular Biology lab.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td>Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos.</td></tr></tbody></table>

4d microscopy: unraveling caenorhabditis elegans embryonic development using nomarski microscopy

Die 4D-Mikroskopie ist ein unschätzbares Werkzeug zur Entschlüsselung des embryonalen Entwicklungsprozesses bei verschiedenen Tieren. In den letzten Jahrzehnten hat sich Caenorhabditis elegans zu einem der besten Modelle für das Studium der Entwicklung entwickelt. Aus optischer Sicht machen seine Größe und sein transparenter Körper diesen Fadenwurm zu einem idealen Exemplar für die DIC-Mikroskopie (Differential Interference Contrast oder Nomarski). Dieser Artikel veranschaulicht ein Protokoll für die Züchtung von C. elegans-Nematoden, die Vorbereitung und Montage ihrer Embryonen, die Durchführung von 4D-Mikroskopie und die Verfolgung von Zelllinien . Die Methode basiert auf multifokalen Zeitrafferaufzeichnungen von Nomarski-Bildern und Analysen mit spezifischer Software. Diese Technik zeigt die embryonale Entwicklungsdynamik auf zellulärer Ebene. Jeder embryonale Defekt bei Mutanten, wie Probleme in der Spindelorientierung, Zellmigration, Apoptose oder Zellschicksalsspezifikation, kann effizient erkannt und bewertet werden. Praktisch jede einzelne Zelle des Embryos kann bis zu dem Moment verfolgt werden, in dem sich der Embryo zu bewegen beginnt. Die Verfolgung der vollständigen Zelllinie eines C. elegans-Embryos durch 4D-DIC-Mikroskopie ist mühsam, aber die Verwendung spezifischer Software erleichtert diese Aufgabe erheblich. Darüber hinaus ist diese Technik im Labor einfach zu implementieren. Die 4D-Mikroskopie ist ein vielseitiges Werkzeug und eröffnet die Möglichkeit, eine beispiellose Analyse der Embryonalentwicklung durchzuführen.

Um die embryonale Entwicklung einer C. elegans-Mutante für das Gen gsr-1 zu charakterisieren, das für das Enzym Glutathionreduktase kodiert, das zur Regeneration von reduziertem Glutathion (GSH) erforderlich ist und an der Aufrechterhaltung der Redoxhomöostase im Nematoden beteiligt ist, führten wir eine 4D-Mikroskopie einer gsr-1 (tm3574) Deletionsmutante durch, bei der es sich um einen Funktionsverlust des Allels handelt, der einen frühen embryonalen Arrestphänotyp18 verursacht. Sowohl WT als auch ausgewogene GSR-1 (tm3574) mutierte C. elegans Nematoden wurden auf NGM-Platten gezüchtet, die mit E. coli OP50 als Nahrungsquelle17 ausgesät waren. GSR-1 (TM3574) Würmer wurden zwei Generationen lang bei 20 °C als heterozygot gezüchtet und dann wurden segregierende homozygote Würmer (die dank der mütterlichen Belastung bis ins Erwachsenenalter heranwachsen können) für eine Inkubation über Nacht vor der Embryonenanalyse auf 25 °C verschoben. Wurmplatten wurden in Kartons inkubiert, um Kondensation zu vermeiden (Abbildung 1). Gravide Nematoden wurden aufgeschnitten, um junge Embryonen zu extrahieren.
Um die embryonale Entwicklung der Mutante mit der stereotypen WT unter identischen Bedingungen zu vergleichen, wurden ein WT (als Kontrolle) und ein gsr-1 (tm3574) Embryo nebeneinander auf das gleiche Präparat gelegt. Der 4D-Mikroskopie-Workflow wurde auf einem standardmäßigen motorisierten aufrechten Mikroskop ausgeführt, das mit DIC-Optik ausgestattet war. Die ausgewählten Aufzeichnungsparameter im Mikroskopsteuerungsprogramm waren: Z-Stacks von 30 Fokusebenen in jeweils 1 Mikron Abstand, 30-Sekunden-Intervalle zwischen dem Beginn jedes Z-Stacks und 1500 Z-Stacks (12,5 Stunden Aufnahme). Die Aufnahmetemperatur wurde auf 25 °C eingestellt (sowohl im Raum als auch auf der Mikroskopstufe) (Abbildung 2).
Sobald die Aufzeichnung abgeschlossen war, wurde die Bilddatei geöffnet, und die Zelllinie wurde mit einer Linienverfolgungssoftware rekonstruiert, indem auf die im Videofenster gezeigten Zellkerne geklickt wurde (Abbildung 4). Die nachgezeichnete gsr-1 (tm3574) mutierte embryonale Zelllinie wurde mit der im Hintergrund dargestellten C. elegans WT-Linie verglichen. Ein wesentliches Ergebnis war der Nachweis einer fortschreitenden Verzögerung des Zellzyklus während der Embryonalentwicklung. Infolgedessen blockierten mutierte Embryonen in Zwischenstadien, während WT-Embryonen fortschritten und schließlich als Larven schlüpften.
Die Vorbereitung und direkte Beobachtung von Embryonen unter dem Mikroskop oder die Immunfärbung mit Antikörpern gegen spätembryonale Marker könnte das Vorhandensein eines hohen Prozentsatzes junger Embryonen in der Mutante im Vergleich zum WT zeigen. Der Embryonenarrest könnte dann als die plausibelste Erklärung abgeleitet werden. Der direkte Nachweis und die genaue Quantifizierung der Zellzyklusverzögerung können jedoch nur durch ein 4D-Mikroskopie-Experiment elegant und einfach gezeigt und quantifiziert werden. Andere wichtige Merkmale der Embryonalentwicklung wie Zelldifferenzierung oder Apoptose (Abbildung 5) können ebenfalls dynamisch mit Hilfe der 4D-Mikroskopie visualisiert werden, die eine detaillierte Analyse mehrerer Aspekte der Entwicklung in einem einzigen Experiment ermöglicht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig01.jpg"> Abbildung 1: C. elegans Nematoden, die unter Laborbedingungen wachsen. Nematoden werden auf mit E. coli ausgesäten NGM-Platten gezüchtet, in Kartons gelagert und entweder bei 15 °C, 20 °C oder 25 °C inkubiert <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig01large.jpg" target="_blank">. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig02.jpg"> Abbildung 2: Screenshot der 4D-Mikroskopie-Aufnahmesoftware. Beispiel für zwei verschiedene Mikroskopsteuerungssoftwareprogramme (A und B). Diese Programme erstellen Workflows zur Steuerung der Mikroskop- und Bilderfassung während der 4D-Mikroskopieaufnahme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig03.jpg"> Abbildung 3: Serienfotos der Agar-Pad-Vorbereitung und -Montage des C. elegans-Embryos zeigen.  A . zubereitete Agarröhrchen. B-C. Vorbereitung des Agar-Pads. D. Rutsche teilweise mit Wasser gefüllt. E. Versiegeln der Rutsche mit Vaseline. F. Letzte Vorbereitung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig04.jpg"> Abbildung 4: Serielle Screenshots von Cell Lineage Tracer-Software. Das Programm ermöglicht die Rekonstruktion der embryonalen Zelllinie einer Zellzyklusverzögerungsmutante (links) und eines WT (rechts) C. elegans-Embryos. Ein. Ein früher Schritt der Entwicklung. B-C. Die Entwicklung beider Embryonen schreitet im Laufe der Zeit voran. D. WT-Embryo entwickelt sich richtig und beginnt mit der Dehnung, während die Mutante anhält. In allen Fällen zeigt das Programm das Videofenster und das Linienfenster an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig05v2.jpg"> Abbildung 5: Linsenrefraktile Form apoptotischer Zellen in einem WT-Embryo von C. elegans . Das durch morphologische Merkmale definierte Zellschicksal kann mittels 4D-Mikroskopie beurteilt werden. Das Bild zeigt einen C. elegans-Embryo im Bohnenstadium. Lebende Zellen zeigen glattgeformte Kerne, die von einem körnigen Zytoplasma umgeben sind. Im Gegensatz dazu kondensieren apoptotische Zellen (gelbe Pfeile) und nehmen eine linsenartige, feuerfeste Form an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Befestigung von Caenorhabditis elegans-Embryonen , zur Aufzeichnung der Entwicklung unter einem 4D-Mikroskop und zur Verfolgung der Zelllinie vor.

4D-Mikroskopie: Entschlüsselung der Caenorhabditis elegans Embryonalentwicklung mittels Nomarski-Mikroskopie

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

2.5K Aufrufe.  CIBIR (Center for Biomedical Research of La Rioja), La Rioja, Spain. Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Befestigung von Caenorhabditis elegans-Embryonen , zur Aufzeichnung der Entwicklung unter einem 4D-Mikroskop und zur Verfolgung der Zelllinie vor.

Serie: 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, acceleration and forces involved in the locomotory behavior of nematodes suspended in a column of water in response to single wavelengths of light. We demonstrate how to evaluate the locomotion of a microscopic organism using Single Wavelength Shadow Imaging (SWSI) using two different examples.
The first example is a systematic and statistically viable study of the average descent of C. elegans in a column of water. For this study, we used living and dead wildtype C. elegans. When we compared the velocity and direction of nematode active movement with the passive descent of dead worms within the gravitational field, this study showed no difference in descent-times. The average descent was 1.5 mm/sec &#177; 0.1 mm/sec for both the live and dead worms using 633 nm coherent light.
The second example is a case study of select individual C. elegans changing direction during the descent in a vertical water column. Acceleration and force are analyzed in this example. This case study demonstrates the scope of other physical properties that can be evaluated using SWSI while evaluating the behavior using single wavelengths in an environment that is not accessible with traditional microscopes. Using this analysis we estimated an individual nematode is capable of thrusting with a force in excess of 28 nN.
Our findings indicate that living nematodes exert 28 nN when turning, or moving against the gravitational field. The findings further suggest that nematodes passively descend in a column of water, but can actively resist the force of gravity primarily by turning direction.

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

The technique presented here measures the path of freely swimming microscopic species using single wavelength exposure. C. elegans are used to demonstrate shadow imaging as an inexpensive alternative to costly microscopes. This technique can be adapted to accommodate various orientations, environments and species to measure direction, speed, acceleration and forces.

Einzel-Wellenlänge Schatten von Imaging<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Locomotion einschließlich Kraft-Schätzungen

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Forschung

Ingenieurwesen

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column inside an optical cuvette. A 632 nm continuous wave HeNe laser is directed through the cuvette using front surface mirrors. A significant distance of at least 20-30 cm traveled after the light passes through the cuvette ensures a useful far-field (Fraunhofer) diffraction pattern. The diffraction pattern changes in real time as the nematode swims within the laser beam. The photodiode is placed off-center in the diffraction pattern. The voltage signal from the photodiode is observed in real time and recorded using a digital oscilloscope. This process is repeated for 139 wild type and 108 &#34;roller&#34; C. elegans. Wild type worms exhibit a rapid oscillation pattern in solution. The &#34;roller&#34; worms have a mutation in a key component of the cuticle that interferes with smooth locomotion. Time intervals that are not free of saturation and inactivity are discarded. It is practical to divide each average by its maximum to compare relative intensities. The signal for each worm is Fourier transformed so that the frequency pattern for each worm emerges. The signal for each type of worm is averaged. The averaged Fourier spectra for the wild type and the &#34;roller&#34; C. elegans are distinctly different and reveal that the dynamic worm shapes of the two different worm strains can be distinguished using Fourier analysis. The Fourier spectra of each worm strain match an approximate model using two different binary worm shapes that correspond to locomotory moments. The envelope of the averaged frequency distribution for actual and modeled worms confirms the model matches the data. This method can serve as a baseline for Fourier analysis for many microscopic species, as every microorganism will have its unique Fourier spectrum.

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to distinguish different nematodes using far-field diffraction signatures. We compare the locomotion of 139 wild type and 108 &#34;Roller&#34; C. elegans by averaging frequencies associated with the temporal Fraunhofer diffraction signature at a single location using a continuous wave laser.

Fourier-basierte Beugung Live-Analyse von Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

Isotrope Licht-Sheet-Mikroskopie und automatisierte Zelllineage-Analysen zu Katalog-Caenorhabditis elegans Embryogenese mit subzellulärer Auflösung

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Entwicklungsbiologie

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualisierung Neuroblast Cytokinesis Während<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Neurowissenschaften

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.

Novel Metrics zur Charakterisierung von Embryonic Dehnung des Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imaging C. elegans Embryos mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop und Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biologie

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zur Anoxie-induzierten Suspended Animation in Visualisieren<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryonen

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

4D-Mikroskopie: Entschlüsselung der Caenorhabditis elegans Embryonalentwicklung mittels Nomarski-Mikroskopie

Zusammenfassung

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Einzel-Wellenlänge Schatten von Imaging

Fourier-basierte Beugung Live-Analyse von Caenorhabditis elegans

Isotrope Licht-Sheet-Mikroskopie und automatisierte Zelllineage-Analysen zu Katalog-Caenorhabditis elegans Embryogenese mit subzellulärer Auflösung

Visualisierung Neuroblast Cytokinesis Während

Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development

Novel Metrics zur Charakterisierung von Embryonic Dehnung des Nematode

Imaging C. elegans Embryos mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop und Open Source Software

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Grundlegende

Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zur Anoxie-induzierten Suspended Animation in Visualisieren